Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Det overordnede målet med denne metoden er å isolere ryggmargen, samt å identifisere og isolere DRG 1, 2. Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen er en betydelig raskere metode enn den tradisjonelle måten å ryggmarg isolering ved laminektomi, dvs. ved å bryte ryggvirvler en om gangen, og denne fremgangsmåten reduserer risikoen for vevsskade forårsaket av disseksjon prosess 3, 4 . DRG kan være vanskelig å identifisere. Riktig identifisering er svært viktig for vev analyse, for eksempel etter isjiasnerven skade. Ved å nummerere DRG i henhold til deres lokalisering i forhold til costae kan DRG identifiseres konsekvent.
Tissue isolert ved hjelp av teknikkene vist her kan anvendes på et bredt spekter av analyser, inkludert Western blotting 5,6, qPCR 7 og immunhistokjemisk farging 8.
Ved identifisering av DRG, er det viktig å ta hensyn til at antall ryggmargssegmenter er kjent for å variere med dyretype og stamme 9, 10, 11. Fordelene med å utføre denne metoden i mus er det høye antallet av genmodifiserte varianter tilgjengelig og de relativt lave boutgifter. De fordeler ved anvendelse av rotter er den relativt høye vev utbytte og hvis involverer nerveskader, vil prosedyren bli lettet med størrelse.
Dersom ryggsøylen blir forstyrret, for eksempel ved cervikal dislokasjon, vil ryggmargen splittet under ekstrudering. Hvis ryggmargen ikke kan ekstruderes, kan ryggraden være trimmet litt i begge ender og ekstrudering forsøk kan gjentas. I tilfelle hele ryggmargen er nødvendig for videre analyse, det vil si bestående av nakke utvidelse så vel som den lumbale utvidelse, bør ryggsøylen bare trimmes noe. Hvis det trengs bare den lumbale utvidelse for ytterligere analyse, bør ryggmargen trimmes i henhold til den foreliggende protokoll. Ryggsøylen skal rettes ved hjelp av fingertuppene for å lette ekstrudering.
Protokollen gjelder gnagere i alle aldre, og er her eksemplifisert av en voksen mus (8 uker), en mus valp (5 dager) og en voksen rotte (10 uker). Avhengig av dyr type og belastning, kan antallet thorax og lumbale seksjoner variere 9, </sup> 10, 11. Avhengig av proteinene som skal analyseres, voksen gnagere kan bli perfusert med enzymhemmende løsninger før eutanasi. Hvis du utfører et eksperiment som involverer ensidig nerveskade, kan ryggmargen deles i ipsilaterale og kontralaterale sider ved hjelp av ultra-fine pinsett umiddelbart etter ekstrudering. Videre kan hver side være delt inn i dorsal og ventrale sider. Vevet kan deretter bli behandlet for videre analyser, for eksempel Western blotting.
Transcardial perfusjon-fiksering med PFA før ryggmargen ekstrudering bør unngås, da dette gjør det ryggmarg ikke-fleksibel og hindrer ryggmargen hydraulisk ekstrudering. Hydraulisk ryggmarg ekstrudering vil rive av Dorsalrøttene. For forsøk der festet Dorsalrøttene er nødvendig, laminectomy anbefales. Videre er spinale hjernehinnene tapt ved hydraulisk ekstrudering, noe som kan unngås ved hjelp av standard laminektomi <sup class = "xref"> 3.
Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen og DRG isolasjon kan også utføres ved hjelp av oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) i stedet for iskald PBS. Bruken av ACSF muliggjør bevaring av det isolerte vev i en bedre fysiologisk miljø, noe som er særlig viktig i tilfelle av etterfølgende elektrofysiologiske opptak 12, 13. Et alternativ til ACSF kan være PBS inneholdende 1 g / l glukose for generering av primær DRG-kulturer 14.
Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen er en betydelig raskere metode enn den tradisjonelle måten å ryggmarg isolering ved laminektomi, redusere vev-håndteringstiden og dermed redusere risikoen for skade på proteinet. Perfusjon med et fikseringsmiddel før isolering av ryggmargen etter laminektomi kan redusere risikoen for vevsskade i løpet av disseksjon og under den endelige fjerning avryggmarg fra ryggsøylen. Men utelukker vev fiksering sin anvendbarhet til analyser som Western blotting. Hydrauliske press gir strukturelt uskadet vev 3 passer for et bredere spekter av analyser.
Konsistent identifikasjon av DRG kan være vanskelig. Men dette er viktig for vev analyse, for eksempel etter isjiasnerven skade. Ved å nummerere DRG i henhold til deres lokalisering i forhold til costae kan DRG identifiseres konsekvent. Farging av ryggmargen vev samt av DRG kan optimaliseres ved å utføre de illustrerte vev behandling som omtalt i protokollen trinn 7.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |