Introduction
מסלול איתות Notch היונק הוא הומולוגי לאותו המסלול ב תסיסנית והיא מורכבת מארבעה קולטנים Notch הטרנסממברני (Notch1-4) וחמישה הליגנדים קרום נכנס של Jagged (JAG1 & JAG2) ודלתא הדמוית (DLL1, 3, & 4) משפחות 1. איתות Notch מופעלת כאשר הקולטן Notch על תא מקבל מחויב ליגנד על תא שידור 2. במהלך הפעלה טראנס זה, ליגנד Notch הקרום נכנס מייצר כוח מתיחה על קולט Notch הקרום נכנס 3, 4. הכח המתיח של ליגנד מחייב גורם לשינויי קונפורמציה הקולטן Notch המאפשרים מחשופות תאים של הקולטן על ידי TNFalpha המרת אנזים (TACE) ואחריו אירוע מחשוף תאיים מתווך על ידי גמא-secretase המכיל presenilin המורכב (γ-secretase). γ-secretase ומשחרר את Notch intתחום racellular (NiCd) אשר translocates לתוך הגרעין בו צורות מתחם הפעלה תעתיק עם CBF-1-סו (H) -Lag-1 (CSL), המוח דמוי (maml), וגורמים סוג תא ספציפי לנהוג ביטוי של למקד גנים 5.
האלמנטים המכאניים של תוצאת הפעלת איתות Notch בצורך השיטות ייחודיות של הפעלת מסלול Notch במבחנה. הליגנדים Notch מסיסים יכולים להיקשר Notch קולטנים, אבל לא מצליחים לייצר מתיחה הכוחות הדרושים לשחרור NiCd ובאותו זמן עיכוב תחרותי מחייב של הליגנדים Notch הקשורים התא. לפיכך, תוספת של הליגנדים Notch מסיסים עד בינוני התרבות יכולה להחליש Notch הנורמלי איתות 6, 7. למרבה המזל, הליגנדים Notch יכול לגרום לשחרור NiCd אם הם קבועים כדי מצע קשיח כראוי 5, 8, 9,10. זריעת תאים על מצעים תרבות מצופה ליגנד או החלת חרוזים מצופים ליגנד לתאים שניהם יכולים להפעיל Notch signaling, והבחירה ביניהן תלויה בעיקר בתזמון הרצוי של גירוי Notch. להגברת פעילות איתות Notch מיידית, זמנית, כפי שניתן היה רצוי במהלך האמצע של assay תפקודית או בידול, ליגנד Notch יכול להיות מאוגד agarose חרוזים, הוחלו תאים בתרבית, ו סחוט בכל עת. לאיתות Notch מתמשכת יותר מתחילת תקופת תרבות, צלחות בתרבית רקמה יכולות להיות מצופות ליגנד לפני זריעת תאים.
למטרות פרוטוקול זה, שיטות מתבצעות באמצעות מבשרי osteoclast העכבר, אבל שיטות וריאציות על השיטות שתוארו כאן ישימות למגוון רחב של סוגי תאים 6, 11, 12, 13, 14. Osteoclasts הם סופני תאי linage hematopoietic הבדילו כי האחראים הספיגים של רקמת עצם, והם מעורבים בהפרעות מרובות של עצם פסד 15. לפיכך, במחקר במבחנה של הבידול של osteoclasts מ מבשר מונוציטים / מקרופאג השושלת שלהם ואת המנגנונים המולקולריים השולטים תפקידם חיוני להבנה טובה יותר של osteoclasts ופיתוח של טיפולי עצם התחדשות חדשים. ואילו כיום הוא מקובלים כי איתות Notch ממלאת תפקיד חיוב הבידול והתפקוד של osteoclasts, וריאציות בשתי תרבות מבשר Notch איתות גירוי osteoclast וההבחנה הובילו לממצאים סותרים בתחילה 16, 17, 18, 19. בדיקה מדוקדקת יותר של ההבדלים בשיטות ושימוש גנטייםמודלים מאוד הבהירו את התפקיד של Notch איתות osteoclastogenesis, אבל יישום של שיטות התרבות וגירוי Notch סטנדרטיות יכול למנוע מחלוקות כאלה במחקרים עתידיים של Notch איתות סוגי תאים אחרים 20, 21, 22, 23.
ישנן מספר שיטות culturing ומבדל מבשרי osteoclast העכבר, וכמו עם שיטות שונות עבור מגרת Notch signaling, השיטה הטובה ביותר תהיה תלויה בשאלה הניסיונית. בזאת, השיטה המועדפת עלינו culturing שברים חסידים לא חסידים של תאי מח הסמוקים מן העצמות ארוכות עכבר יוצגה. שיטה זו יש יתרון בכך שנדרש למעשה שום ציוד מיוחד והפקת תאים החלימו על מגוון של שיטות בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בהתאם פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי החיים המוסדי פנסילבניה ועדת שימוש (IACUC).
1. הכנת מדיה ותרבות
- הכן α-MEM ידי המסת מדיום חיוני מינימום אבקת (MEM) ו סודיום ביקרבונט 1.9 גרם ב 900 מ"ל H 2 O ו להשלים עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -100 מ"ל תרמי בסרום שור עובר מומת. לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES).
- הכן בינוני מקרופאג ידי השלמת α-MEM עם 35 ng / עכבר רקומביננטי מ"ל פקטור מגרה Macrophage-קולוני (M-CSF)
- הכן בינוני osteoclast ידי משלים בינוני מקרופאג עם 100 RANKL ng / ml
2. בידוד תא מח עצם
- מלאו מזרק אחד 10 מ"ל עם מחט מד 25⅝ לכל עכבר עם 10 מ"ל α-MEM. להרדים עכברים באמצעות 10 דקות חשיפת CO 2 בקצב זרימה של 1.3 ליטר / דקה. ודא מוות חיה על ידי ביצוע CO 2 חשיפה עם נקע בצוואר הרחם לפני שתמשיך עם לנתיחה.
- באמצעות טכניקה נקייה, לנתח את ולהפריד את tibiae ואת femora. לחטא את עור עכבר עם אתנול 70% לפני ביצוע חתך על פני השטח הקדמיים של כל גפיים אחוריים כדי לחשוף את עצם השוק ועצם ירך.
- חותך דרך מפרק הברך לשחרר את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, לחתוך דרך הירך קרובה האגן ככל האפשר. הסר את הירך ולנקות כמו הרבה רקמות רכות ככל האפשר. כדי להסיר את השוקה, ביקע את הקרסול להסיר כמה שיותר רקמה רכה ככל האפשר.
- החזק את העצם עם מלקחיים מח סומק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם טמפרטורה 2.5 מ"ל חדר α-MEM שילוב גלי מוח של עכבר בודד לתוך צינור אחד.
הערה: סומק מח מוצלח ישנה את הצבע של tהוא עצם מאדום בז '. - אפשר ושיירי ליישב לתחתית של התחתית ולהעביר supernatant אל בלטפל נקי חרוטי 15 מ"ל הצינור כדי למנוע העברת כל פסולת.
הערה: כמה תאים עשויים גם להתיישב עם פסולת המח. אם מספר גדול יותר של תאים נדרש, גלי מוח ניתן לסנן דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך שפופרת 15 מ"ל נקי. - צינור צנטריפוגה (ים) ב XG 300 עבור 5min בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
- אבק לשאוב התא גלולה supernatant ו resuspend ב 0.5 מ"ל אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) lysing חיץ לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי lyse כדוריות דם אדומות.
- הוסף 10 מ"ל PBS ישירות ACK תאים פתרון, ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
הערה: תא גלולה אדומה בעבר כעת אמור להיות בצבע בז '. - supernatant לשאוב אבק ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל α-MEM, צלחת בצלחת תרבות שטופלו רקמות 100 מ"מ. דגירה תאים לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס humidifiedחממה בתרבית רקמה.
הערה: ספירת תאים אין צורך בשלב זה. במהלך תקופה זו, תאים חסידים ממח העצם יצרפו אל פני שטח התרבות; לא חסידי אוכלוסיות תאים במח עצם תישארנה השעיה. MCSF אינו נוכח במדיום התרבות במהלך דגירה ראשונית זו.
3. העשרה של מבשרי osteoclast
- לאחר הדגירה לילה של גלי מוח, supernatant תרבות העברה המכיל תאים שאינם חסיד צינור חרוטי 50 מ"ל.
הערה: מנות תרבות עם תאים חסידים, הכוללים ובתאי mesenchymal מח עצם, יכולה להיות מושלכת או נמאס עם ממ α טרי, אם תרצה בכך לניסויים אחרים.
הערה: ניתן להבדיל osteoclasts ישירות מתאי לא חסיד מח עצם אלה על ידי ציפוי אותם הכלים תרבות שטופלו רקמות בצפיפות של 4 x 10 5 תאים / 2 ס"מ במדיום osteoclast ובינוניים מרענן פעם ביומיים במשך 5 ימים. להוסיף α-MEM כדי פתרון התא לא חסיד לנפח סופי של 18 מ"ל ולהוסיף M-CSF לריכוז סופי של 35 ng / ml. - הוסף 3 מ"ל של ההשעיה תא אחד עד 6 60 מ"מ צלחות תרבות ההשעיה.
- דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה humidified. במהלך תקופה זו, M-CSF יעודד בידול של מקרופאגים, אשר יכול לדבוק גם על משטחי תרבות שטופל שאינם רקמות.
- לאחר דוגרים לילה, מחדש להאכיל מבשרי osteoclast עם המדיום מקרופאג טרי 3 מ"ל. פעולה זו תסיר שאינה חסידים תאים שלא הבדילו לתוך מקרופאגים.
- המשך מבשרי osteoclast תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 על 2 ימים או עד תרבויות מגיעות למפגש בערך 70%.
4. בידול osteoclast
- לשטוף מבשרי osteoclast עם 5 מ"ל PBS ולטפל תאים עם 1 מ"ל פרוטאוליטים ימיים-המוצא / אנזים collagenolytic בטמפרטורת החדר עד cells ניתן וחילצה על ידי הקשה עדינה של הצלחת.
הערה: מבשרי osteoclast ניתן להרים רק אם הם בתרבית מנות ההשעיה; מבשרים לצרף גם בתקיפות למשטחי תרבות שטופלה רקמות להיות הרים. טריפסין יכול להפעיל מבשרי osteoclast יש להימנע. - הוסף 4 מ"ל α-MEM לכל התאים צלחת והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל התאים בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / מ"ל ולהוסיף M-CSF לריכוז סופי של 35 ng / ml ו RANKL לריכוז סופי של 100 ng / ml.
- תאי זרע בצפיפות של 2.6 x 10 4 תאים / 2 ס"מ לתוך צלחות תרבות שטופלו רקמות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה בתרבית רקמה humidified למשך 2 ימים. הבידול מבוצע בדרך כלל 24 גם צלחות, שבו 5 x 10 4 תאים הם זורעים לתוך כל טוב.
- 2 ימים לאחר תחילת תאי בידול, מחדש ההזנה באמצעות החלפה בינונית עם 1 מיליליטר osteoc הטריהמדיום האחרון.
הערה: בידול osteoclast בדרך כלל יהיה שלם בתוך 3 ימים. osteoclasts וכתוצאה מכך ניתן מוכתם TRAP כימות קל ניתוח מורפולוגי.
5. גירוי רציף של איתות Notch עם משטח מצופה Jagged1
- להשעות נוגדן IgG Fc אנטי אנושי עז PBS בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל (1: 1,000 דילול של 10 מ"ג / ml המלאי). הוסף פתרון נוגדנים משטח התרבות בצפיפות של 1.3 מיקרוגרם / 2 ס"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. במקרה של צלחות 24-היטב, מוסיפים 250 μl (2.5 מיקרוגרם) לכל טוב.
- בארות לשאוב אבק ולמלא עם 1 מ"ל PBS. חזור על פעולה זו 2 פעמים.
- להשעות חלבון היתוך Jagged1-Fc רקומביננטי PBS בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף פתרון Jagged1-FC אל פני השטח תרבות מצופה נוגדן בצפיפות של 1.3 מיקרוגרם / 2 ס"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. משטחי תרבות מצופים onl הנוגדןy יכול לשמש שולטים.
- בארות לשאוב אבק ולמלא עם 1 מ"ל PBS. חזור על פעולה זו 2 פעמים. שמור PBS בבארות עד זמן קצר לפני תא זריעה כדי למנוע מהם הייבוש.
- זרע 2.6 x 10 4 מבשרי osteoclast / 2 ס"מ על משטחים מצופים. איתות Notch תהיה מגורה ברציפות במשך 3 ימים לפחות.
6. גירוי זמני של מערכת האיתות Notch עם חרוזים מצופים Jagged1
- מערבבים את הבאים בצינור בגודל מתאים: 0.5 מיקרוגרם / 2 ס"מ Jagged1-FC, 21 μl / 2 ס"מ חרוזים חלבון G agarose, ו- PBS לנפח סופי של 1.5 מ"ל. כדי להכין מספר מספיק של חרוזים Jagged1 עבור 1 גם צלחת 24 היטב, לשלב 1 מיקרוגרם Jagged1-FC, 40 חרוזים μl חלבון G agarose, ו- PBS 1.5 מ"ל.
- דגירת צינור עם סיבוב ב 4 ° צלזיוס למשך 2 שעות.
- צנטריפוגה צינור ב XG 300 דקות 1 חרוזים גלולים. חרוזים Resuspend ב 1.5 מ"ל PBS. חזור על זה לשטוףפי 2 יותר.
- Resuspend Jagged1 החרוזים 130 μl / 2 ס"מ בינוני תרבות ולמרוח על תאים בתרבית.
- דגירת תאים עם חרוזים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור תקופה רצויה. סר חרוז עם כמה שטיפות של PBS או בינוני תרבות.
- ודא הפעלת איתות Notch באמצעות מדידה של תמלילי גן מטרת Notch 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת השיטה היא התרבות לעורר Notch איתות מבשר osteoclast. כאשר כראוי תרבותי, מבשרי osteoclast להפגין מורפולוגיה ציר בצורה מוארכת בעיקר עם הציטופלסמה חלקה (איור 1 א). יש להקפיד כדי להימנע מהפעלת אימונולוגיים של מבשרי osteoclast. לאחר ההפעלה, מבשרי להתפשט ולהפוך שטוח עם הציטופלסמה מקציף (איור 1B). אלה "ביצת עין" תאים עמידים איתות RANK ואינו מבחינים ביעילות לתוך osteoclasts הבוגרת. בתנאי התרבות והתמיינות נכונים, מבשרי osteoclast מועשרים יבדילו ואת פתיל לתוך osteoclasts multinuclear TRAP-חיובי גדול בתוך שלושה ימים (איור 1 ג).
זריעת מבשרי osteoclast על משטחים מצופים Jagged1-Fc עד-מסדיר גני מטרה Notch תוך 24 שעות(איור 2). גנים ספציפיים למעלה מוסדרים על ידי איתות Notch להשתנות לפי סוג תא. במקרה של מבשרי osteoclast, הגן השולט ביותר למעלה מוסדר על ידי Jagged1 הוא Hes1, למרות Hey2 ו Myc הם בינוני עד מוסדר, כמו גם. ביטוי של גני מטרת Notch אחרים כגון Hey1 ו p21 אינם משתנה באופן משמעותי על ידי גירוי Jagged1 של מבשרי osteoclast.
כאשר מבשרי האוסטאוקלסטים הם בתרבית 24 גם צלחות, טיפול עם חרוזים מצופים עם קטנה כמו 600 ng Jagged1-Fc להפגין גידול משמעותי ביטוי Hes1 בתוך 24 שעות (איור 3). ארבעים ושמונה טיפולי h להראות עלייה דומה בביטוי Hes1, אם כי במידה פחותה.
איור 1: תרבות והבחנה של מבשרי osteoclast. (א)מבשרי osteoclast נאיביים תרבותיים עם 35 ng / ml MCSF וללא גירויי הפעלה יש מורפולוגיה חלקה, דמויי כישור. בר סולם = 25 מיקרומטר. (ב) עם הפעלת אימונולוגית, מבשרי osteoclast לאמץ מורפולוגיה פחוסה, מלא קצף ולא להתמיין osteoclasts. כדי לגרום ההפעלה, מבשרי osteoclast טופלו 10 ng / ml lipopolysaccharide במשך 16 שעות. בר סולם = 25 מיקרומטר. (C) אימונולוגית נאיבי osteoclast חסיד מבשרי תרבותי עם 35 MCSF ng / ml ו -100 ng / ml במשך 3 ימים להתמיין osteoclasts בוגרת. osteoclasts מבוגרים הם גדולים, multinuclear, וללכוד חיובי. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Up-רגולציה של גני מטרה Notch ב מבשרי osteoclast מצופה על Jagged1-Fc משותקת. מבשרי osteoclast היו מצופים על Jagged1-Fc המשותקת ותרבותי במשך 24 שעות. במהלך תקופת התרבות, ביטוי Hes1, Hey2, ו Myc mRNA הוגדל. גני מטרת Notch אחרים, Hey1 ו p21 היו לא שינו. ברי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע, המשמעות הוערכה באמצעות מבחן t 1 הזנב של תלמיד. *, P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Up-רגולציה של mRNA Hes1 ב מבשרי osteoclast שטופלו Jagged1-Fc חרוזים. 600 ng Jagged-FC חייב חרוזים agarose חלבון G עד-מסדיר ביטוי Hes1 ב מבשרי osteoclast בתרבית הבאר של צלחת 24 גםתוך 24 שעות של חשיפה. אינדוקציה Hes1 ידי Jagged1-חרוזים היה דומה לרמות Hes1 המושרה על ידי צלחות Jagged1-מצופה Fc. גני מטרת Notch אחרים אשר לא היו מושרה בחום על ידי צלחות מצופות Jagged1-Fc לא הוערכו. ברי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע, המשמעות הוערכה באמצעות מבחן t 1 הזנב של תלמיד. *, P <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
תרבות בידול במבחנה של מבשרי osteoclast מספקת פלטפורמה שימושית לחקירה של מנגנונים מולקולריים של osteoclastogenesis וזיהוי מטרות טיפוליות עבור התחדשות עצם ושימור מסת עצם. כאשר culturing מבשר osteoclast העכבר, האלמנט הקריטי ביותר הוא תחזוקה של מבשרים במצב נאיבי. ככל שתאי מקרופאג דמוי, מבשרי האוסטאוקלסטים הם דרוכים להגיב לרכיבים חיידקי וציטוקינים פרו-דלקתיים. לאחר ההפעלה, מבשרי osteoclast כבר לא להבדיל ביעילות לתוך osteoclasts. הגורם העיקרי של הפעלת מבשר הוא נוכחות של ציטוקינים דלקתיים כגון TNFα או השלמה מומת כראוי בסרום שור העובר. מסיבה זו, הרבה סרה חייב להיבדק על יכולת לתמוך osteoclastogenesis לפני השימוש בניסויים. בנוסף, כל הסרה המשמשת osteocתרבות המבשר האחרונה חייבת להיות חום מומת לפגל משלים שניתן להפעיל את מבשרי osteoclast.
שינויים ופתרון בעיות
בשיטה זו, Jagged1-Fc משמש כדי לעורר Notch איתות מבשר osteoclast. היתוך Fc עם Jagged1 מקל הוא חוסר התנועה על משטחי תרבות עם נוגדנים נגד Fc צימוד חרוזי חלבון G. הליגנדים Notch אחרים התמזגו Fc, כגון דלתא-like1-FC, ניתן להשתמש באופן דומה. יצוין כי לא כל הספקים לספק הצהרות של פעילות ליגנד Notch רקומביננטי. לכן, בעוד ניתן להשיג הליגנדים Notch רקומביננטי מספקי מרובים, יש לנקוט זהירות כדי לקבל מידע פעילות ביולוגית מהספק או בדיקות של הליגנדים בתאים ליגנד תגובה Notch ידוע צריכה להתבצע.
באמצעות הפרוטוקולים מתוארים שיטה זו מאפשרת גירוי מכונן וזמני Notch סימןaling ב מבשרי osteoclast תרבותיים. הגישה הסטנדרטית לגילוי הפעלת איתות Notch הוא כימות של גני מטרה Notch באמצעות כמותי הפוך שעתוק PCR (RT-qPCR). גני מטרה שהוגברו על ידי Notch איתות להשתנות לפי התא, ולכן כאשר גירוי Notch מבוצע על סוג תא uncharacterized בעבר, ביטוי של פאנל של גני מטרה Notch הקנונית כגון חברי הס ו היי המשפחה של גורמי שעתוק צריך להיקבע. בתוך מסגרת זמן קצרה יותר, הפעלת Notch ניתן לאתר באופן פוטנציאלי באמצעות הערכה כתם המערבית של מתחם תאיים Notch (NiCd). יש להקפיד עם זאת, כפי שיש ארבעה Notch קולטנים NICDs מן קולטנים שונים בסוגי תאים שונים אינם מפורסמים באותה מידה בעקבות גירוי ליגנד. רמת NiCd בתאי Notch מגורה צריכה להיות גם בהשוואה לרמות בתאים שאינם מגורים לתת דין וחשבון על שחרור NiCd בסיס.
מגבלות הטכניקה למרות ששיטה זו היא תיאורטית החלים על כל הליגנדים Notch, עד היום זה כבר רק בעקביות מיושם באמצעות Jagged1 ודלתא-like1 10, 20, 21. בדיקות נוספות יידרשו כדי לקבוע אם הליגנדים Notch נוספים ניתנים בשיטה זו. שיטה זו היא גם נוקבים ב הפעלת קולטן Notch שלה; הערכה של גירוי לאחר הפעלת קולטן מסוימת Notch בשיטה זו יש צורך לייחס תגובות הסלולר קולטנים Notch בפרט.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
בידול osteoclast תלוי על שניהם מספר מבשר osteoclast ופוטנציאל בידול מבשר osteoclast. הערכת בידול osteoclast של אוכלוסיות מח עצם מעורבות אינה יכולה להבחין בין שינויי osteoclast precursor מספר ופוטנציאל התמיינות תאים אוטונומיים. העשרה של מבשרי osteoclast לפני שולט בידול להבדלים בנתונים מבשרים ומאפשר חקירה מדוקדקת יותר של תהליך התמיינות osteoclast. בהתחשב בכך איתות Notch מפעילה אפקטים שונים בנקודות שונות במהלך osteoclastogenesis, שליטה זמנית של שתי איתות Notch והבחנת osteoclast חיונית חקירה ראויה של מסלולים המולקולריים הוא מושלת.
יישומים עתידיים לאחר מאסטרינג טכניקה זו
שימוש בפרוטוקול זה, הערכה של תפקידי איתות Notch יכולה להתבצע לא רק מבשרי osteoclast, אך עם פוטנציאל בסוגי תאים אחרים, כמו גם. על ידי שינוי האורך של גירוי Notch ושעה של חניכת איתות Notch, תפקידים רבים-פאזית פוטנציאל של Notch איתות במגוון תהליך הסלולר יכולים להיות מוגדרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
