Introduction
स्तनधारी पायदान संकेतन मार्ग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में एक ही मार्ग के मुताबिक़ है और चार transmembrane पायदान रिसेप्टर्स (Notch1-4) और दांतेदार (JAG1 और JAG2) और डेल्टा की तरह (DLL1, 3 के पांच झिल्ली ही सीमित ligands के होते हैं, और 4) परिवारों को 1। जब एक प्राप्त सेल पर पायदान रिसेप्टर एक संचारण सेल 2 पर ligand से बाध्य है पायदान संकेतन शुरू की है। इस पार सक्रियण के दौरान, झिल्ली ही सीमित पायदान ligand झिल्ली ही सीमित पायदान रिसेप्टर 3, 4 पर एक खींच बल पैदा करता है। ligand बाध्यकारी की खींच बल पायदान रिसेप्टर में गठनात्मक परिवर्तन है कि TNFalpha द्वारा रिसेप्टर के बाह्य दरार की सुविधा परिवर्तित एंजाइम (TACE) एक presenilin युक्त गामा secretase परिसर (γ-secretase) द्वारा मध्यस्थता एक intracellular दरार घटना के द्वारा पीछा लाती है। γ-secretase विज्ञप्ति पायदान intracellular डोमेन (एनआईसीडी) जो नाभिक जहां यह CBF-1-र (एच) -Lag-1 (सीएसएल), मास्टरमाइंड की तरह (MAML) के साथ एक transcriptional सक्रियण जटिल रूपों में translocates, और सेल प्रकार विशिष्ट कारकों अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए के जीन 5 लक्ष्य।
इन विट्रो में पायदान मार्ग सक्रियण की अनूठी तरीकों के लिए जरूरत होती पायदान संकेतन सक्रियण परिणाम के यांत्रिक तत्वों। घुलनशील पायदान ligands रिसेप्टर्स पायदान के लिए बाध्य है, लेकिन एनआईसीडी रिहाई के लिए आवश्यक बलों खींच जबकि एक ही समय में प्रतिस्पर्धात्मक रूप से सेल जुड़े पायदान ligands के बंधन में बाधा का उत्पादन करने में असफल हो सकता है। इस प्रकार, संस्कृति के माध्यम से घुलनशील पायदान ligands के अलावा सामान्य पायदान 6, 7 संकेत attenuate कर सकते हैं। सौभाग्य से, पायदान ligands एनआईसीडी रिहाई के लिए प्रेरित कर सकते हैं अगर वे एक उपयुक्त कठोर सब्सट्रेट 5, 8, 9 को तय कर रहे हैं,10। ligand लेपित संस्कृति substrates पर कोशिकाओं सीडिंग या कोशिकाओं के लिए ligand लिपटे मोतियों को लागू करने के लिए दोनों पायदान संकेतन सक्रिय कर सकते हैं, और उन दोनों के बीच चुनाव पायदान उत्तेजना के वांछित समय पर मुख्य रूप से निर्भर करता है। तत्काल, अस्थायी पायदान संकेतन सक्रियण के लिए, के रूप में एक कार्यात्मक या भेदभाव परख के मध्य के दौरान वांछित किया जाएगा, पायदान ligand मोती, सुसंस्कृत कोशिकाओं को लागू agarose के लिए बाध्य किया जा सकता है, और किसी भी समय बाहर धोया। एक संस्कृति अवधि की शुरुआत से अधिक निरंतर पायदान संकेतन के लिए, टिशू कल्चर प्लेटों ligand सेल बोने से पहले साथ लेपित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, विधियों माउस अस्थिशोषक व्यापारियों का उपयोग किया जाता है, लेकिन तरीकों और यहाँ वर्णित तरीकों में बदलाव सेल प्रकार 6, 11, 12, 13 की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू कर रहे हैं, 14। अस्थिशोषकों टर्मिनली विभेदित hematopoietic वंशावली कोशिकाओं है कि हड्डी के ऊतकों के अवशोषण के लिए जिम्मेदार हैं, और वे हड्डी हानि 15 के कई विकारों में फंसा रहे हैं। इस प्रकार, उनके monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश व्यापारियों से अस्थिशोषकों और आणविक को नियंत्रित करने के उनके कार्य अस्थिशोषकों और नई हड्डी-regenerating उपचारों के विकास की बेहतर समझ के लिए आवश्यक है तंत्र के भेदभाव के इन विट्रो अध्ययन में। यह अब आम तौर पर स्वीकार किया जाता है जबकि उस पायदान संकेतन भेदभाव और अस्थिशोषकों के समारोह में एक सकारात्मक भूमिका निभाता है, दोनों पायदान संकेतन उत्तेजना और अस्थिशोषक अग्रदूत संस्कृति और भेदभाव में बदलाव शुरू में विरोधाभासी निष्कर्षों 16, 17, 18, 19 के लिए नेतृत्व किया। तरीकों में मतभेद के करीब परीक्षा और आनुवंशिक का उपयोगमॉडल बहुत osteoclastogenesis में पायदान संकेतन की भूमिका स्पष्ट किया है, लेकिन मानकीकृत पायदान उत्तेजना और संस्कृति तरीकों के आवेदन अन्य प्रकार की कोशिकाओं 20, 21, 22, 23 में पायदान संकेतन के भविष्य के अध्ययनों में इस तरह के विवादों को रोकने सकता है।
वहाँ संवर्धन और माउस अस्थिशोषक व्यापारियों फर्क के लिए कई तरीके हैं, और, पायदान संकेतन उत्तेजक के लिए अलग-अलग तरीकों के साथ के रूप में, सबसे अच्छा तरीका प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करेगा। इस के साथ साथ, माउस लंबी हड्डियों से प्लावित मज्जा कोशिकाओं के पक्षपाती और गैर पक्षपाती अंशों संवर्धन के हमारे पसंदीदा विधि प्रस्तुत किया जाएगा। इस विधि को अनिवार्य रूप से कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और कोशिकाओं है कि भेदभाव तरीकों की एक किस्म के लिए लागू कर रहे हैं उत्पादन का लाभ दिया है।
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Protocol
कशेरुकी सभी जानवरों को शामिल अनुसंधान पेंसिल्वेनिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था।
1. संस्कृति मीडिया तैयारी
- 900 मिलीलीटर एच 2 ओ में न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) पाउडर और 1.9 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट भंग द्वारा α सदस्य को तैयार है और 2 मिमी एल glutamine, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक और 100 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम। एक 0.22 माइक्रोन polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर का उपयोग जीवाणुरहित।
- 35 एनजी के साथ α सदस्य सप्लीमेंट द्वारा बृहतभक्षककोशिका मध्यम तैयार / एमएल पुनः संयोजक माउस बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ)
- 100 एनजी / एमएल RANKL साथ बृहतभक्षककोशिका मध्यम सप्लीमेंट द्वारा अस्थिशोषक मध्यम तैयार
2. अस्थि मज्जा सेल अलगाव
- 10 मिलीलीटर α-सदस्य के साथ माउस प्रति एक 25⅝ गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें। 1.3 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर सीओ 2 के 10 मिनट के लिए जोखिम के माध्यम से चूहों euthanize। विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने से पहले सीओ 2 ग्रीवा अव्यवस्था के साथ प्रदर्शन के बाद से पशु मौत सुनिश्चित करें।
- स्वच्छ तकनीक का उपयोग करना, काटना और tibiae और femora अलग। टिबिया और फीमर को बेनकाब करने के लिए प्रत्येक हिंद अंग के पूर्वकाल सतह के साथ एक चीरा बनाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ माउस त्वचा कीटाणुरहित।
- फीमर के बाहर का अंत मुक्त करने के लिए संयुक्त घुटने के माध्यम से कट और फीमर के रूप में संभव के रूप में श्रोणि के करीब माध्यम से काटा। फीमर निकालें और जितना संभव हो उतना कोमल ऊतक को साफ। टिबिया, टखने के माध्यम से कटौती को हटा दें और जितना संभव हो उतना नरम ऊतक निकालने के लिए।
- 2.5 मिलीलीटर कमरे के तापमान α सदस्य एक एकल ट्यूब में एक माउस से मज्जा flushes के संयोजन के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में संदंश और फ्लश मज्जा के साथ हड्डी पकड़ो।
नोट: एक सफल मज्जा फ्लश टी की रंगाई बदल जाएगावह लाल से हड्डी मटमैला है। - मलबे ट्यूब के नीचे बसा है और एक साफ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब देखभाल करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण किसी भी मलबे में परिवर्तित करने से बचने के लिए करने की अनुमति दें।
नोट: कुछ कोशिकाओं को भी मज्जा मलबे के साथ समझौता कर सकता है। कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है, मज्जा flushes एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर किया जा सकता है। - कमरे के तापमान पर 5min के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) गोली कोशिकाओं।
- वैक्यूम 0.5 मिलीलीटर अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली aspirate बफर lysing और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए।
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर एसीके सेल का हल, और सेंट्रीफ्यूज सीधे 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें।
ध्यान दें: पहले लाल सेल गोली अब बेज होना चाहिए। - वैक्यूम महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली 10 मिलीलीटर α सदस्य में, और थाली एक 100 मिमी टिशू कल्चर का इलाज डिश में। एक humidified में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को सेतेटिशू कल्चर इनक्यूबेटर।
नोट: कोशिकाओं की गिनती इस कदम के लिए आवश्यक नहीं है। इस समय के दौरान, अस्थि मज्जा से पक्षपाती कोशिकाओं संस्कृति की सतह को जोड़ना होगा; गैर पक्षपाती अस्थि मज्जा सेल आबादी निलंबन में रहेगा। MCSF इस प्रारंभिक ऊष्मायन के दौरान संस्कृति के माध्यम में मौजूद नहीं है।
3. अस्थिशोषक व्यापारियों का संवर्धन
- मज्जा flushes, स्थानांतरण संस्कृति गैर पक्षपाती शंक्वाकार ट्यूब एक 50 मिलीलीटर कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला की रात ऊष्मायन के बाद।
नोट: पक्षपाती कोशिकाओं है, जो अस्थि मज्जा कोशिकाओं mesenchymal पूर्वज शामिल है के साथ संस्कृति बर्तन, त्याग या ताजा α सदस्य से तंग आ चुके है, तो अन्य प्रयोगों के लिए वांछित जा सकता है।
नोट: अस्थिशोषकों उन्हें टिशू कल्चर का इलाज बर्तन में 5 दिनों के लिए हर दूसरे दिन अस्थिशोषक मध्यम और ताज़ा माध्यम में 4 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर चढ़ाना द्वारा इन गैर पक्षपाती अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से सीधे भेदभाव किया जा सकता है। 18 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए गैर पक्षपाती सेल के समाधान के लिए α सदस्य जोड़े और 35 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एम-सीएसएफ जोड़ें। - 6 60 मिमी निलंबन संस्कृति व्यंजन के लिए सेल निलंबन प्रत्येक के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें सेते हैं। इस समय के दौरान, एम-सीएसएफ मैक्रोफेज, जो गैर टिशू कल्चर का इलाज सतहों के लिए भी पालन कर सकते हैं के भेदभाव को प्रोत्साहित करेंगे।
- रात भर 3 मिलीलीटर ताजा बृहतभक्षककोशिका माध्यम के साथ, फिर से चारा अस्थिशोषक व्यापारियों incubating के बाद। यह गैर पक्षपाती कोशिकाओं है कि मैक्रोफेज में भेदभाव नहीं किया है निकाल देंगे।
- 2 दिनों के लिए या जब तक संस्कृतियों लगभग 70% संगम तक पहुँचने 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति अस्थिशोषक व्यापारियों को जारी रखें और 5% सीओ 2।
4. अस्थिशोषक भेदभाव
- अस्थिशोषक व्यापारियों सेल तक कमरे के तापमान पर 1 मिलीलीटर समुद्री मूल के प्रोटिओलिटिक / कोलेजनोलिटिक एंजाइम के साथ 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोने और कोशिकाओं का इलाजरास थाली के कोमल दोहन से उखाड़ फेंकना जा सकता है।
नोट: यदि वे निलंबन व्यंजन में संवर्धित कर रहे अस्थिशोषक व्यापारियों केवल उठाया जा सकता है; व्यापारियों के लिए टिशू कल्चर का इलाज सतहों भी मजबूती देते हैं उठाया जा सके। Trypsin अस्थिशोषक व्यापारियों सक्रिय कर सकते हैं और बचा जाना चाहिए। - एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 4 मिलीलीटर α सदस्य प्रत्येक पकवान और हस्तांतरण कोशिकाओं में जोड़े। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के लिए कोशिकाओं को कमजोर और 100 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 35 एनजी / एमएल और RANKL अंतिम एकाग्रता के लिए एम-सीएसएफ जोड़ें।
- 2.6 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व टिशू कल्चर का इलाज प्लेटों में से बीज कोशिकाओं और 2 दिनों के लिए एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। भेदभाव आम तौर पर 24 अच्छी तरह प्लेटें, जहां 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रत्येक में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं में किया जाता है।
- 2 दिन 1 मिलीलीटर ताजा osteoc के साथ मध्यम जगह से भेदभाव, फिर से चारा कोशिकाओं की शुरुआत के बादपिछले माध्यम।
नोट: अस्थिशोषक भेदभाव आमतौर पर 3 दिन के भीतर पूरा हो जाएगा। परिणामस्वरूप अस्थिशोषकों जाल से सना हुआ आसान मात्रा का ठहराव और रूपात्मक विश्लेषण के लिए हो सकता है।
Jagged1-लेपित सतह के साथ पायदान संकेत के 5. निरंतर उत्तेजना
- 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में पीबीएस में बकरी विरोधी मानव आईजीजी एफसी एंटीबॉडी निलंबित (1: 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर के 1,000 कमजोर पड़ने)। 1.3 माइक्रोग्राम / 2 सेमी के घनत्व पर संस्कृति की सतह के लिए एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 24 अच्छी तरह से प्लेटों के मामले में, अच्छी तरह से प्रति 250 μl (2.5 माइक्रोग्राम) जोड़ें।
- वैक्यूम महाप्राण कुओं और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिर से भरना। इस चरण को दोहराएँ 2 बार।
- 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में पीबीएस में पुनः संयोजक Jagged1-एफसी संलयन प्रोटीन निलंबित। 1.3 माइक्रोग्राम / 2 सेमी के घनत्व पर एंटीबॉडी लेपित संस्कृति की सतह के लिए Jagged1-एफसी समाधान जोड़ें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। संस्कृति सतहों एंटीबॉडी onl के साथ लेपितY नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
- वैक्यूम महाप्राण कुओं और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिर से भरना। इस चरण को दोहराएँ 2 बार। बस से पहले तक कुओं में पीबीएस रखें बोने सेल करने के लिए उन्हें सूखने से रोकने के लिए।
- बीज 2.6 x 10 4 अस्थिशोषक व्यापारियों / लेपित सतहों पर 2 सेमी। पायदान संकेतन लगातार कम से कम 3 दिनों के लिए प्रेरित किया जाएगा।
Jagged1 लिपटे मोतियों के साथ पायदान संकेत के 6. अस्थाई उत्तेजना
- एक उचित आकार ट्यूब में निम्नलिखित गठबंधन: 0.5 माइक्रोग्राम / 2 सेमी Jagged1-एफसी, 21 μl / 2 सेमी प्रोटीन जी agarose मोती, और पीबीएस 1.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए। एक 24 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से करने के लिए Jagged1 मोतियों की एक पर्याप्त संख्या में तैयार करने के लिए, 1.5 मिलीग्राम के लिए 1 माइक्रोग्राम Jagged1-एफसी, 40 μl प्रोटीन जी agarose मोती, और पीबीएस गठबंधन।
- 4 में रोटेशन के साथ ट्यूब सेते 2 घंटे के लिए सें।
- गोली मोती के लिए 1 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। 1.5 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend मोती। इस धोने दोहराएँ2 गुना अधिक।
- 130 μl / 2 सेमी संस्कृति के माध्यम में Resuspend Jagged1 माला और संवर्धित कोशिकाओं के लिए लागू होते हैं।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर मोती के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और 5% वांछित अवधि के लिए सीओ 2। पीबीएस या संस्कृति के माध्यम से कई washes के साथ मोती निकालें।
- पायदान लक्ष्य जीन टेप 10 की माप के माध्यम से पायदान संकेत सक्रियण की जाँच करें।
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Representative Results
इस विधि का उद्देश्य संस्कृति के लिए है और अस्थिशोषक व्यापारियों में पायदान संकेतन को प्रोत्साहित। जब ठीक से सुसंस्कृत, अस्थिशोषक व्यापारियों चिकनी कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 ए) के साथ एक मुख्य रूप से लम्बी धुरी के आकार आकृति विज्ञान दिखा रहे हैं। जॉब अस्थिशोषक व्यापारियों की प्रतिरक्षा सक्रियण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। सक्रियण पर, व्यापारियों में फैला है और झागदार कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 बी) के साथ चपटा हो गया है। ये "तला हुआ अंडा" कोशिकाओं रैंक सिगनल लिए प्रतिरोधी रहे हैं और कुशलता से परिपक्व अस्थिशोषकों में अंतर नहीं है। सही संस्कृति और भेदभाव शर्तों के तहत, समृद्ध अस्थिशोषक व्यापारियों अंतर और तीन दिन (चित्रा 1 सी) के भीतर बड़े जाल सकारात्मक multinuclear अस्थिशोषकों में फ्यूज होगा।
पर Jagged1-एफसी लेपित सतहों अस्थिशोषक व्यापारियों सीडिंग 24 घंटे के भीतर पायदान लक्ष्य जीन को नियंत्रित(चित्रा 2)। विशिष्ट जीन पायदान संकेतन द्वारा विनियमित सेल प्रकार के हिसाब से बदलती। अस्थिशोषक व्यापारियों के मामले में सबसे प्रमुख जीन Jagged1 द्वारा विनियमित, Hes1 है, हालांकि Hey2 और Myc मामूली ऊपर विनियमित रहे हैं, के रूप में अच्छी तरह से। ऐसे Hey1 और P21 के रूप में अन्य पायदान लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति काफी अस्थिशोषक व्यापारियों की Jagged1 उत्तेजना से बदल नहीं कर रहे हैं।
अस्थिशोषक व्यापारियों 24 अच्छी तरह प्लेटें में संवर्धित कर रहे हैं, मोती के साथ इलाज के रूप में छोटे रूप में 600 एनजी Jagged1-एफसी 24 एच (चित्रा 3) के भीतर Hes1 अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन के साथ लेपित। अड़तालीस घंटे के उपचार, Hes1 अभिव्यक्ति में एक समान वृद्धि दिखाने के एक डिग्री कम करने के लिए यद्यपि।
चित्रा 1: संस्कृति और अस्थिशोषक व्यापारियों के भेदभाव। (ए)भोले अस्थिशोषक व्यापारियों 35 एनजी / एमएल MCSF साथ और सक्रियण उत्तेजनाओं बिना सुसंस्कृत एक चिकनी, धुरी के आकार आकारिकी है। स्केल बार = 25 माइक्रोन। (बी) के प्रतिरक्षा सक्रियण पर, अस्थिशोषक व्यापारियों एक चपटा, फोम से भरे आकृति विज्ञान को अपनाने और अस्थिशोषकों में अंतर नहीं होगा। सक्रियण के लिए प्रेरित करने के लिए, अस्थिशोषक व्यापारियों 16 घंटे के लिए 10 एनजी / एमएल lipopolysaccharide के साथ इलाज किया गया। स्केल बार = 25 माइक्रोन। (सी) प्रतिरक्षा के भोले पक्षपाती अस्थिशोषक व्यापारियों 35 एनजी / एमएल MCSF साथ सुसंस्कृत और 3 दिनों के लिए 100 एनजी / एमएल परिपक्व अस्थिशोषकों में अंतर है। परिपक्व अस्थिशोषकों, बड़े multinuclear, और जाल पॉजिटिव हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: स्थिर Jagged1-एफसी पर चढ़ाया अस्थिशोषक व्यापारियों में पायदान लक्ष्य जीन की अप-विनियमन। अस्थिशोषक व्यापारियों स्थिर Jagged1-एफसी पर चढ़ाया और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। संस्कृति अवधि के दौरान, अभिव्यक्ति Hes1, Hey2, और Myc mRNA वृद्धि की गई थी। अन्य पायदान लक्ष्य जीन, Hey1 और P21 बदल नहीं थे। त्रुटि सलाखों मतलब है, महत्व छात्र की 1 पूंछ टी परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था की मानक त्रुटि कर रहे हैं। *, पी <0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: Jagged1-एफसी मोतियों के साथ इलाज किया अस्थिशोषक व्यापारियों में Hes1 mRNA की अप-विनियमन। 600 एनजी दांतेदार-एफसी प्रोटीन जी agarose मोती के लिए बाध्य अस्थिशोषक व्यापारियों में Hes1 अभिव्यक्ति एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुएं में सुसंस्कृत अप को नियंत्रित करता हैजोखिम के 24 घंटे के भीतर। Hes1 प्रेरण Jagged1-मोतियों से Jagged1-एफसी में लिपटे प्लेटों से प्रेरित Hes1 स्तर के बराबर था। अन्य पायदान लक्ष्य जीन जो दृढ़ता Jagged1-एफसी में लिपटे प्लेटों से प्रेरित नहीं थे मूल्यांकन नहीं किया गया। त्रुटि सलाखों मतलब है, महत्व छात्र की 1 पूंछ टी परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था की मानक त्रुटि कर रहे हैं। *, पी <0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
संस्कृति और अस्थिशोषक व्यापारियों की इन विट्रो भेदभाव में osteoclastogenesis और हड्डी उत्थान और हड्डियों के संरक्षण के लिए चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है। जब माउस अस्थिशोषक व्यापारियों संवर्धन, सबसे महत्वपूर्ण तत्व एक भोले राज्य में व्यापारियों के रखरखाव है। मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह के रूप में, अस्थिशोषक व्यापारियों बैक्टीरियल घटकों और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए primed रहे हैं। सक्रियण पर, अस्थिशोषक व्यापारियों नहीं रह कुशलता अस्थिशोषकों में अंतर होगा। अग्रदूत सक्रियण का प्राथमिक कारण या भ्रूण गोजातीय सीरम में इस तरह के TNFα के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति को अनुचित तरीके से निष्क्रिय पूरक है। इस कारण से, सीरा बहुत से उनके osteoclastogenesis प्रयोगों में उपयोग करने से पहले समर्थन करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सभी सीरा osteoc में इस्तेमाल कियापिछले अग्रदूत संस्कृति गर्मी पूरक है कि अस्थिशोषक व्यापारियों को सक्रिय कर सकते denature को निष्क्रिय किया जाना चाहिए।
संशोधन और समस्या निवारण
इस विधि में, Jagged1-एफसी अस्थिशोषक व्यापारियों में निशान सिगनल को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Jagged1 साथ एफसी संलयन विरोधी एफसी प्रोटीन जी मोती के लिए एंटीबॉडी और युग्मन के साथ संस्कृति सतहों पर दोनों स्थिरीकरण की सुविधा। ऐसे डेल्टा-like1-एफसी के रूप में अन्य पायदान ligands एफसी से जुड़े हुए हैं, एक समान फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी आपूर्तिकर्ताओं पुनः संयोजक पायदान ligand गतिविधि के बयान प्रदान करते हैं। इसलिए, जबकि पुनः संयोजक पायदान ligands कई आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है, देखभाल आपूर्तिकर्ता या ज्ञात पायदान ligand जिम्मेदार कोशिकाओं में ligands के परीक्षण से जैविक गतिविधियों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए किया जाना चाहिए।
प्रोटोकॉल इस विधि में वर्णित का उपयोग पायदान पर हस्ताक्षर के विधान और अस्थायी उत्तेजना के लिए अनुमति देता हैसुसंस्कृत अस्थिशोषक व्यापारियों में Aling। पायदान संकेतन की सक्रियता का पता लगाने के लिए मानक विधि मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-qPCR) के माध्यम पायदान लक्ष्य जीन की मात्रा का ठहराव है। लक्ष्य जीन पायदान संकेतन द्वारा upregulated सेल के हिसाब से बदलती है, इसलिए जब पायदान उत्तेजना और इस तरह Hes के सदस्यों के रूप में एक पहले से uncharacterized सेल प्रकार, विहित पायदान लक्ष्य जीन के एक पैनल की अभिव्यक्ति पर किया जाता है अरे प्रतिलेखन कारक के परिवार निर्धारित किया जाना चाहिए। एक छोटे समय सीमा में, पायदान सक्रियण संभावित पायदान Intracellular डोमेन (एनआईसीडी) के पश्चिमी धब्बा आकलन के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। ध्यान रखा जाना चाहिए, हालांकि, वहाँ के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विभिन्न रिसेप्टर्स से चार पायदान रिसेप्टर्स और NICDs हैं ligand उत्तेजना के बाद ही डिग्री के लिए जारी नहीं कर रहे हैं। पायदान उत्तेजित कोशिकाओं में एनआईसीडी स्तर भी गैर प्रेरित कोशिकाओं में स्तरों आधारभूत एनआईसीडी रिहाई के लिए खाते में करने के लिए तुलना की जानी चाहिए।
तकनीक की सीमाएं हालांकि इस पद्धति सैद्धांतिक रूप से सभी पायदान ligands के लिए लागू है, तिथि करने के लिए यह केवल लगातार किया गया है Jagged1 और डेल्टा-like1 10, 20, 21 का उपयोग कर लागू होता है। आगे के परीक्षण निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त पायदान ligands इस विधि के लिए उत्तरदायी हैं कि क्या आवश्यक हो जाएगा। इस विधि को भी अपनी पायदान रिसेप्टर सक्रियण में unspecific है; निम्नलिखित उत्तेजना विशिष्ट पायदान रिसेप्टर सक्रियण इस विधि का उपयोग कर के आकलन विशेष पायदान रिसेप्टर्स के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं मानो करने के लिए आवश्यक है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
अस्थिशोषक भेदभाव दोनों अस्थिशोषक अग्रदूत नंबर और अस्थिशोषक अग्रदूत भेदभाव की क्षमता पर निर्भर है। मिश्रित अस्थि मज्जा आबादी के अस्थिशोषक भेदभाव का मूल्यांकन अस्थिशोषक prec में परिवर्तन के बीच भेद नहीं कर सकतेursor संख्या और सेल स्वायत्त भेदभाव की क्षमता। अग्रदूत संख्या में मतभेद के लिए भेदभाव नियंत्रण करने से पहले अस्थिशोषक व्यापारियों के संवर्धन और अस्थिशोषक भेदभाव की प्रक्रिया के करीब पूछताछ की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि पायदान संकेतन osteoclastogenesis दौरान विभिन्न बिंदुओं पर अलग अलग प्रभाव डाल रही है, दोनों पायदान संकेतन और अस्थिशोषक भेदभाव के अस्थायी नियंत्रण आणविक रास्ते इसे नियंत्रित की उचित जांच के लिए आवश्यक हैं।
इस तकनीक के माहिर के बाद भविष्य अनुप्रयोगों
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, पायदान संकेतन के लिए भूमिकाओं का मूल्यांकन, के रूप में अच्छी तरह से न केवल अस्थिशोषक व्यापारियों में है, लेकिन संभावित अन्य प्रकार की कोशिकाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है। पायदान उत्तेजना और पायदान संकेतन दीक्षा के समय की लंबाई अलग करके, सेलुलर प्रक्रिया की एक किस्म में पायदान संकेतन की क्षमता बहु phasic भूमिकाओं में परिभाषित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
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