Introduction
Däggdjurs Notch signalväg är homolog med samma väg i Drosophila melanogaster och består av fyra transmembran Notch-receptorer (Notch1-4) och fem membranbundna ligander av den Jagged (JAG1 & JAG2) och Delta-liknande (DLL1, 3, & 4) familjer 1. Notch-signalering initieras när Notch receptor på en mottagande cell är bunden av ligand på en sändande cell 2. Under denna trans-aktivering, producerar den membranbundna Notch-ligand en sträckkraft på membranbundna Notch-receptor 3, 4. Sträckningskraften av ligand bindning inducerar konformationsförändringar i den Notch-receptor som underlättar extracellulär klyvning av receptorn genom TNFalpha omvandlande enzym (TACE), följt av en intracellulär klyvning händelse medieras av ett presenilin-innehållande gamma-sekretas-komplexet (γ-sekretas). γ-sekretas frigör Notch intracellular domän (NiCd), som translokerar in i kärnan där den bildar en transkriptionsaktiveringskomplex med CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-liknande (MAML), och cell typspecifika faktorer för att driva uttryck av målgener 5.
De mekaniska elementen av Notch-signalering aktivering resulterar i behovet av unika metoder av Notch vägsaktivering in vitro. Lösliga Notch-ligander kan binda till Notch-receptorer, men misslyckas med att producera sträckkrafter som är nödvändiga för NICD frisättning medan på samma gång att kompetetivt hämma bindning av cellassocierade Notch-ligander. Således kan tillsats av lösliga Notch ligander till odlingsmedium dämpa normal Notch-signal 6, 7. Lyckligtvis kan Notch-ligander inducerar NICD frisättning, om de är fixerade till ett lämpligt styvt substrat 5, 8, 9,10. Sådd celler på ligand-belagda odlingssubstrat eller tillämpa ligand-belagda pärlor till celler kan både aktivera Notch-signalering, och valet mellan dem beror främst på den önskade tidpunkten för Notch stimulering. För omedelbar, temporär aktivering Notch-signalering, som man kunde önska under mittpunkten av en funktionell eller differentiering analys Notch-ligand kan bindas till agarospärlor, tillämpas på odlade celler och tvättas ut när som helst. För mer ihållande Notch-signalering från början av en odlingsperiod, kan vävnadsodlingsplattor vara belagda med ligand före cellsådd.
Vid tillämpningen av detta protokoll, metoder genomförs med hjälp av musen osteoklastprekursorer, men de metoder och variationer på de metoder som beskrivs här kan tillämpas på en mängd olika celltyper 6, 11, 12, 13, 14. Osteoklaster är terminalt differentierade hematopoetiska Linage celler som är ansvariga för resorptionen av benvävnad, och de är inblandade i flera sjukdomar i benförlust 15. Således, in vitro-studie av differentieringen av osteoklaster från deras monocyt / makrofag-härstamning prekursorer och de molekylära mekanismer som styr deras funktion är nödvändig för att bättre förståelse av osteoklaster och utveckling av nya ben regenere terapier. Även om det är nu allmänt accepterat att Notch-signalering spelar en positiv roll i differentiering och funktion av osteoklaster, variationer i både Notch-signalering stimulering och osteoklaster föregångare kultur och differentiering ledde till initialt motstridiga slutsatser 16, 17, 18, 19. En närmare granskning av skillnaderna i metoder och användning av genetiskamodeller har kraftigt klar roll Notch signalering i osteoklastogenes, men tillämpning av standardiserade Notch stimulering och odlingsmetoder kan förhindra sådana kontroverser i framtida studier av Notch signalering i andra celltyper 20, 21, 22, 23.
Det finns flera metoder för odling och differentiering av mus osteoklastprekursorer, och som med varierande förfaranden för stimulering av Notch-signalering, kommer den bästa metoden att bero på den experimentella fråga. Häri, kommer vårt föredragna förfarande för odling av vidhäftande och icke-vidhäftande fraktioner av märgceller spolas från mus långa ben att presenteras. Denna metod har den fördelen att kräva i huvudsak ingen specialutrustning och att producera celler som kan tillämpas på en mängd olika differentieringsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning ryggradsdjur genomfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Pennsylvania Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Kultur Media Preparation
- Förbereda α-MEM genom upplösning av minimalt essentiellt medium (MEM) pulver och 1,9 g natriumbikarbonat i 900 ml H2O och komplettera med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 100 ml värme- inaktiverat fetalt bovint serum. Sterilisera användning av ett 0,22 um polyetersulfon (PES) filter.
- Förbereda makrofag-medium genom att komplettera α-MEM med 35 ng / ml rekombinant mus-makrofag-kolonistimulerande faktor (M-CSF)
- Förbereda osteoklast-medium genom att komplettera makrofag-medium med 100 ng / ml RANKL
2. benmärgsceller Isolering
- Fyll en 10 ml spruta med en 25⅝ nål per mus med 10 ml α-MEM. Euthanize möss via 10 min exponering för CO2 vid en flödeshastighet av 1,3 l / min. Säkerställa djurens död genom att följa CO2 exponering med halsdislokation innan du fortsätter med dissekering.
- Med rent teknik, dissekera ut och separera skenbenen och lårbenen. Desinficera mushud med 70% etanol före att göra ett snitt längs den främre ytan av varje bakben för att exponera skenbenet och lårbenet.
- Skär genom knäleden för att frigöra den distala änden av lårbenet, och skär genom lårbenet så nära bäckenet som möjligt. Ta lårbenet och rengör så mycket mjuk vävnad som möjligt. För att ta bort skenbenet, skär genom ankeln och ta bort så mycket mjuk vävnad som möjligt.
- Håll benet med pincett och spola märg i en 15 ml koniska rör med 2,5 ml rumstemperatur α-MEM kombinera märgvallningar från en enda mus i ett enda rör.
OBS: En framgångsrik märg flush kommer att förändra färgning av than ben från röd till beige. - Låt skräp att sjunka till botten av röret och överför supernatanten till ett rent 15 ml koniskt rör noga med att undvika att överföra eventuellt skräp.
OBS: Vissa celler kan också nöja sig med märg skräp. Om ett större antal celler erfordras, kan märgvallningar filtreras genom ett 70 | im cellfilter in i ett rent 15 ml-rör. - Centrifugrör (s) vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Vakuum aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml Ammonium-Klorid-Kalium (ACK) lyseringsbuffert och inkubera vid 37 ° C under 3 min för att lysera röda blodkroppar.
- Tillsätt 10 ml PBS direkt till ACK-cell-lösning, och centrifugera vid 300 xg under 5 min.
OBS: Den tidigare röda cellpelleten bör nu vara beige. - Vakuum aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml α-MEM, och plattan i en 100 mm vävnadsodlingsbehandlade skålen. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en fuktadvävnadsodlingsinkubator.
OBS: Räkna celler är inte nödvändig för detta steg. Under denna tid kommer vidhäftande celler från benmärgen fäster till odlingsytan; icke-vidhäftande benmärgscellspopulationer kommer att förbli i suspension. MCSF inte är närvarande i odlingsmediet under denna inledande inkubation.
3. Anrikning av osteoklastprekursorer
- Efter inkubation över natten av märgvallningar, överföring odlingssupernatant innehållande icke vidhäftande celler till en 50 ml koniska rör.
OBS: Kultur rätter med vidhäftande celler, som omfattar benmärgs mesenkymala stamceller, kan kasseras eller matas med färsk α-MEM, om så önskas för andra experiment.
OBS: Osteoklaster kan differentieras direkt från dessa icke-vidhäftande benmärgsceller genom utstrykning dem till vävnadsodlingsbehandlade skålar vid en densitet av 4 x 10 5 celler / cm 2 i osteoklast-medium och uppfriskande mediet varannan dag i 5 dagar. Lägga α-MEM till icke-vidhäftande cell-lösning till en slutlig volym av 18 ml och tillsätt M-CSF till en slutlig koncentration av 35 ng / ml. - Tillsätt 3 ml cellsuspension vardera till 6 60 mm suspensionsodlingsskålar.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C i en fuktad vävnadskulturinkubator. Under denna tid kommer M-CSF stimulera differentiering av makrofager, som kan vidhäfta till och med icke-vävnadskultur-behandlade ytor.
- Efter inkubation över natten, återmatnings osteoklastprekursorer med 3 ml färskt makrofag medium. Detta kommer att avlägsna icke-adherenta celler som inte har differentierade till makrofager.
- Fortsätta att odlings osteoklastprekursorer vid 37 ° C och 5% CO2 i 2 dagar eller tills kulturerna når ungefär 70% konfluens.
4. osteoklastdifferentiering
- Tvätta osteoklastprekursorer med 5 ml PBS och behandla cellerna med 1 ml marint ursprung proteolytisk / kollagenolytisk enzym vid rumstemperatur tills cells kan rubbas genom försiktig knackning av plattan.
OBS: osteoklastprekursorer kan endast hävas om de odlas i suspensions rätter; prekursorer fästa alltför hårt till vävnadskulturbehandlade ytor som skall lyftas. Trypsin kan aktivera osteoklastprekursorer och bör undvikas. - Tillsätt 4 ml α-MEM till varje skål och överföra celler till en 50 ml koniska rör. Räkna celler med användning av en hemocytometer och späd cellerna till en densitet av 5 x 10 4 celler / ml och tillsätt M-CSF till en slutlig koncentration av 35 ng / ml och RANKL till en slutlig koncentration av 100 ng / ml.
- Utsädes celler vid en densitet av 2,6 x 10 4 celler / cm 2 in i vävnadsodlingsbehandlade plattor och inkubera vid 37 ° C i en fuktad vävnadskulturinkubator under 2 dagar. Differentiering utförs typiskt i 24-brunnsplattor, där 5 x 10 4 celler ympas i varje brunn.
- 2 dagar efter starten av de differentiering, re-feed-celler genom att ersätta mediet med 1 ml färskt osteocsista medium.
OBS: osteoklastdifferentiering kommer vanligen att vara fullbordad inom 3 dagar. Resulterande osteoklaster kan vara TRAP-färgades för enkel kvantifiering och morfologisk analys.
5. Kontinuerlig Stimulering av Notch signalering med Jagged1 belagd yta
- Suspendera get-anti-human-IgG Fc-antikropp i PBS vid en koncentration av 10 | ig / ml (1: 1000 spädning av 10 mg / ml förråd). Lägg antikropplösning till odlingsytan vid en densitet av 1,3 | j, g / cm 2 och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme. I fallet med 24-brunnsplattor, tillsätt 250 | il (2,5 pg) per brunn.
- Vakuum aspirera brunnar och fyll på med en ml PBS. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Suspendera rekombinant Jagged1-Fc-fusionsprotein i PBS vid en koncentration av 10 pg / ml. Lägga Jagged1-FC-lösning till den antikroppsbelagda odlingsytan vid en densitet av 1,3 | j, g / cm 2 och inkubera vid rumstemperatur i 2 h. Odlingsytor belagda med antikropp only kan användas som kontroller.
- Vakuum aspirera brunnar och fyll på med en ml PBS. Upprepa detta steg 2 gånger. Hålla PBS i brunnarna till precis före cellsådd för att hindra dem från att torka.
- Seed 2,6 x 10 4 osteoklastprekursorer / cm2 på belagda ytor. Notch-signalering kommer kontinuerligt stimuleras under minst 3 dagar.
6. Tillfällig Stimulering av Notch signalering med Jagged1-belagda pärlor
- Kombinera följande i en lämpligt dimensionerad rör: 0,5 | j, g / cm 2 Jagged1-Fc, 21 | j, l / cm 2 protein G-agarospärlor, och PBS till en slutlig volym av 1,5 ml. För att framställa ett tillräckligt antal Jagged1 pärlor för en brunn i en platta med 24 brunnar, kombinera 1 mikrogram Jagged1-Fc, 40 ul protein G-agarospärlor, och PBS till 1,5 ml.
- Inkubera rör med rotation vid 4 ° C under 2 h.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 1 min till pelletkulor. Resuspendera pärlor i 1,5 ml PBS. Upprepa denna tvättYtterligare 2 gånger.
- Resuspendera Jagged1 pärlor i 130 l / cm2 odlingsmedium och tillämpas på odlade celler.
- Inkubera cellerna med pärlorna vid 37 ° C och 5% CO2 under önskad period. Ta pärlor med flera tvättar av PBS eller odlingsmedium.
- Kontrollera Notch signalering aktivering via mätning av Notch mål gentranskript 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna metod är att kultur och stimulera Notch signalering i osteoklastprekursorer. Vid korrekt odlade, osteoklastprekursorer uppvisar en i huvudsak långsträckt spolformad morfologi med mjuk cytoplasman (Figur 1A). Försiktighet bör vidtas för att undvika immunologisk aktivering av osteoklastprekursorer. Vid aktivering, prekursorer spridas och bli tillplattade med skummande cytoplasman (Figur 1B). Dessa "stekt ägg" celler är resistenta mot RANK signalering och inte på ett effektivt sätt differentierar till mogna osteoklaster. Under rätt kultur och differentieringsförhållanden kommer berikade osteoklastprekursorer differentiera och säkring i stora TRAP-positiva multinukleära osteoklaster inom tre dagar (Figur 1C).
Sådd osteoklastprekursorer på Jagged1-Fc belagda ytor upp-reglerar Notch målgener inom 24 timmar(Figur 2). Specifika gener upp-regleras av Notch-signalering varierar beroende på celltyp. I fallet med osteoklastprekursorer, är den mest dominerande gen uppregleras av Jagged1 Hes1, fast Hey2 och Myc är måttligt uppregleras, liksom. Expression av andra Notch målgener såsom Hey1 och p21 är inte signifikant av Jagged1 stimulering av osteoklastprekursorer.
När osteoklastprekursorer odlas i 24-brunnars plattor, behandling med pärlor belagda med så lite som 600 ng Jagged1-Fc visar en signifikant ökning i Hes1 expression inom 24 h (fig 3). Fyrtioåtta h behandlingar visar en liknande ökning av Hes1 uttryck, om än i mindre grad.
Figur 1: Kultur och differentiering av osteoklastprekursorer. (A)Naiva osteoklastprekursorer odlade med 35 ng / ml MCSF och utan aktiverings stimuli har en slät, spolformad morfologi. Skalstreck = 25 | im. (B) Vid immunologisk aktivering osteoklastprekursorer antar en tillplattad, skumfyllda morfologi och kommer inte att differentiera till osteoklaster. För att inducera aktivering, var osteoklastprekursorer behandlades med 10 ng / ml lipopolysackarid under 16 timmar. Skalstreck = 25 | im. (C) Immunologiskt naiva vidhäftande osteoklastprekursorer odlade med 35 ng / ml MCSF och 100 ng / ml under 3 dagar differentieras till mogna osteoklaster. Mogna osteoklaster är stora, multikärn och TRAP-positiva. Skalstreck = 200 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uppreglering av Notch målgener i osteoklastprekursorer pläterade på immobiliserat Jagged1-Fc. Osteoklastprekursorer ströks på immobiliserat Jagged1-Fc och odlades under 24 h. Under odlingsperioden, var uttryck Hes1, Hey2, och Myc-mRNA ökade. Andra Notch målgener, Hey1 och p21 påverkades inte. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet, signifikans utvärderades med användning av studentens 1-tailed t-test. *, P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uppreglering av Hes1 mRNA i osteoklastprekursorer behandlade med Jagged1-Fc-pärlor. 600 ng Jagged-Fc bundet till protein G-agarospärlor uppreglerar Hes1 expression i osteoklastprekursorer odlas i brunnen på en 24-brunnarinom 24 timmar av exponering. Hes1 induktion av Jagged1-pärlor var jämförbar med Hes1 nivåer som induceras av Jagged1-Fc-belagda plattor. Andra Notch målgener som inte var starkt induceras av Jagged1-Fc-belagda plattorna inte bedömts. Felstaplar är standardfelet av medelvärdet, signifikans utvärderades med användning av studentens 1-tailed t-test. *, P <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Kultur och in vitro differentiering av osteoklastprekursorer ger en användbar plattform för utredning av molekylära mekanismer av osteoklastogenes och identifiering av terapeutiska mål för benuppbyggnad och bevarande av benmassa. När odling mus osteoklastprekursorer, är den mest kritiska delen underhåll av prekursorer i en naiv tillstånd. Såsom makrofag-liknande celler, är osteoklastprekursorer trimmade för att svara på bakteriella komponenter och proinflammatoriska cytokiner. Vid aktivering kommer osteoklastprekursorer inte längre effektivt differentierar till osteoklaster. Den främsta orsaken till föregångare aktivering är närvaron av inflammatoriska cytokiner såsom TNF eller felaktigt inaktiv komplement i fetalt bovinserum. Av denna anledning måste sera partier testas för sin förmåga att stödja osteoklastogenes före användning i experimenten. Dessutom använde alla sera i osteocsista prekursorn kultur måste värmeinaktiv att denaturera komplement som kan aktivera de osteoklastprekursorer.
Ändringar och felsökning
I denna metod, är Jagged1-Fc användas för att stimulera Notch-signalering i osteoklastprekursorer. Fc-fusions med Jagged1 underlättar både immobilisering på odlingsytorna med anti-Fc-antikroppar och koppling till protein G pärlor. Andra Notch-ligander fuserade till Fc, som Delta-Gillar jag1-Fc, kan användas på ett liknande sätt. Det bör noteras att inte alla leverantörer tillhandahåller uttalanden av rekombinant Notch-ligand aktivitet. Därför medan rekombinanta Notch-ligander kan erhållas från flera leverantörer, försiktighet bör vidtas för att få biologisk aktivitet information från leverantören eller test av ligander i kända Notch-ligand-responsiva celler ska utföras.
Enligt protokollen i denna metod gör det möjligt för konstitutiv och tillfällig stimulering av Notch teckenAling i odlade osteoklastprekursorer. Standardmetoden för att detektera aktivering av Notch-signalering är kvantifiering av Notch målgener via kvantitativ omvänd-transkription-PCR (RT-qPCR). Målgener uppregleras av Notch-signalering varierar från cell, så när Notch stimulering utförs på en tidigare uncharacterized celltyp, uttryck av en panel av kanoniska Notch målgener såsom medlemmar av den Hes och Hey familj av transkriptionsfaktorer bör fastställas. I en kortare tid, kan Notch aktivering potentiellt upptäckas via Western blot bedömning av Notch intracellulär domän (NiCd). Försiktighet bör iakttas, men eftersom det finns fyra Notch-receptorer och NICDs från olika receptorer i olika celltyper är inte släpps ut i samma utsträckning efter ligand stimulering. NICD nivån i Notch-stimulerade celler bör också jämföras med nivåer i icke-stimulerade celler till svars för baslinje NICD release.
Begränsningar av tekniken Även om denna metod är teoretiskt tillämplig på alla Notch-ligander, hittills har det bara varit konsekvent appliceras med Jagged1 och Delta-Gillar jag1 10, 20, 21. Ytterligare tester kommer att krävas för att avgöra om ytterligare Notch ligander är mottagliga för denna metod. Denna metod är också ospecifika i Notch-receptoraktivering; bedömning av specifik Notch-receptoraktivering efter stimulering med användning av denna metod är det nödvändigt att tillskriva cellulära svar på särskilda Notch-receptorer.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Osteoklastdifferentiering är beroende upp både osteoklaster föregångare nummer och osteoklaster föregångare differentiering potential. Utvärdering av osteoklastdifferentiering av blandade benmärgspopulationer kan inte skilja mellan förändringar i osteoklast precursor nummer och cell autonom differentieringspotential. Anrikning av osteoklastprekursorer före differentierings kontroller för skillnader i antal prekursorer och tillåter närmare förhör av osteoklastdifferentiering processen. Med tanke på att Notch-signalering utövar olika effekter vid olika tidpunkter under osteoklastogenes, tidsstyrning av både Notch-signalering och osteoklastdifferentiering är avgörande för ordentlig utredning av de molekylära vägar det styr.
Framtida tillämpningar efter att behärska denna teknik
Användning av detta protokoll, kan utföras bedömning av roller för Notch-signalering inte bara i osteoklastprekursorer, men eventuellt i andra celltyper, liksom. Genom att variera längden av Notch stimulering och tid för Notch-signalering initiering, kan definieras potentiella multi-phasic roller Notch-signalering i olika cellulär process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
