Introduction
Die Säuger Notch - Signalwegs ist homolog zu den gleichen Stoffwechselweg in Drosophila melanogaster und besteht aus vier transmembranen Notch - Rezeptoren (Notch1-4) und fünf membrangebundenen Liganden der Jagged (JAG1 & JAG2) und Delta-like (DLL1, 3, & 4) Familien 1. Notch - Signal wird eingeleitet , wenn Notch - Rezeptor auf einer Empfangszelle , die durch Liganden auf einer Sendezelle 2 gebunden ist. Während dieser trans-Aktivierung, die membrangebundene erzeugt Notch - Liganden eine Streckkraft auf die Membran-gebundenen Notch - Rezeptor 3, 4. Die Dehnkraft der Ligandenbindung induziert Konformationsänderungen in dem Notch-Rezeptor, der von TNFalpha umwandelndes Enzym (TACE) extrazelluläre Spaltung des Rezeptors erleichtern durch ein intrazelluläres Spaltungsereignis von einem Presenilin-enthaltenden gamma-Sekretase-Komplex (γ-Sekretase) vermittelt gefolgt. γ-Sekretase gibt den Notch intracellular Domain (NICD), die in den Zellkern transloziert, wo es eine Transkriptionsaktivierungskomplex bildet mit CBF-1-Su (H) -LAG-1 (CSL), Mastermind-like (MAML) und zelltypspezifische Faktoren die Expression anzutreiben von Zielgenen 5.
Die mechanischen Elemente des Notch - Signalaktivierung Ergebnis in der Notwendigkeit für einzigartige Verfahren der Notch - Signalweg - Aktivierung in vitro. Soluble Notch-Liganden binden an Rezeptoren Notch, aber nicht Dehnungskräfte zu erzeugen, die notwendig für die Freigabe NICD während zugleich kompetitiv die Bindung von zellassoziierte Liganden Notch hemmen. Somit Zugabe von löslichem Notch - Liganden an Kulturmedium können normale Notch dämpfen 6 Signalgebung, 7. Glücklicherweise Notch - Liganden können NICD Freisetzung induzieren , wenn sie 5 zu einem geeigneten starren Substrat befestigt sind, 8, 9,10. Aussäen Zellen auf Liganden-beschichteten Kultursubstrate oder Aufbringen Ligand-beschichteten Kügelchen an Zellen kann sowohl aktivieren Notch-Signalisierung, und die Wahl zwischen ihnen hängt in erster Linie von dem gewünschten Zeitpunkt der Notch-Stimulation. Für sofortige temporäre Notch-Signalaktivierung, wie während der Mittelpunkt einer funktionellen oder Differenzierungsassay, Notch-Liganden an Agarose beads können, zu kultivierten Zellen angewendet würde erwünscht sein, werden gebunden und gewaschen jederzeit aus. Für länger anhalt Notch-Signalisierung von Beginn einer Kulturperiode, Gewebekulturplatten können vor dem Aussähen der Zellen mit dem Liganden überzogen werden.
Für die Zwecke dieses Protokolls werden Verfahren durchgeführt Maus Osteoklastenvorläufer verwenden, aber die Verfahren und Variationen der hier beschriebenen Verfahren sind anwendbar auf eine große Vielzahl von Zelltypen 6, 11, 12, 13, 14. Osteoklasten sind terminal differenzierten hämatopoetischen linage Zellen , die für die Resorption von Knochengewebe verantwortlich sind, und sie sind in mehreren Erkrankungen des Knochenschwundes 15 gebracht. Somit ist in vitro Untersuchung der Differenzierung von Osteoklasten aus ihren Monocyten / Makrophagen-Abstammungslinie Vorstufen und die molekularen Mechanismen , die Kontrolle ihrer Funktion zu einem besseren Verständnis der Osteoklasten und Entwicklung neuer Knochenregenerierungs Therapien wesentlich ist. Während es nun , dass Notch - Signalweg spielt eine positive Rolle bei der Differenzierung und Funktion von Osteoklasten, Variationen sowohl in der Notch - Signal Stimulation und Osteoklasten - Vorläuferkultur und Differenzierung allgemein akzeptiert wird geführt zunächst widersprüchlichen Ergebnisse 16, 17, 18, 19. Näherer Betrachtung der Unterschiede in den Verfahren und der Verwendung von genetischenModelle haben stark die Rolle der Notch - Signalweg in osteoclastogenesis geklärt, aber Anwendung standardisierter Notch Stimulation und Kulturmethoden könnten solche Kontroversen in zukünftigen Studien der Notch - Signalweg in anderen Zelltypen 20, 21, 22, 23 zu verhindern.
Es gibt mehrere Methoden zum Züchten und Maus Osteoklastenvorläufer Differenzierung und, wie mit unterschiedlichen Methoden zur Stimulierung von Notch-Signalisierung, die beste Methode hängt von der Versuchs Frage abhängen. Hier unsere bevorzugte Methode zur Kultivierung von adhärenten und nicht adhärenten Fraktionen von Mark aus Maus langen Knochen gespült Zellen präsentiert werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, erfordern im wesentlichen keine Spezialausrüstung und Herstellung von Zellen, die zu einer Vielzahl von Differenzierungsmethoden anwendbar sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Forschung Wirbeltiere wurde in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.
1. Kultur Nährmedienzubereitung
- Bereiten α-MEM mit Minimum Essential Medium (MEM) -Pulver und 1,9 g Natriumbicarbonat in 900 ml H 2 O und ergänzt mit 2 mM L-Glutamin Auflösen, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 ml hitze- inaktiviertes fötales Rinderserum. Sterilisieren einen 0,22 um Polyethersulfon (PES) Filter.
- Bereiten Sie Makrophagen-Medium durch Ergänzung α-MEM mit 35 ng / ml rekombinantem Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF)
- Bereiten Sie Osteoklasten Medium durch Ergänzung Makrophagen-Medium mit 100 ng / ml RANKL
2. Knochenmarkzellisolierung
- Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 25⅝-Gauge-Nadel pro Maus mit 10 ml α-MEM. Euthanize Mäuse über 10 min Einwirkung von CO 2 bei einer Flussrate von 1,3 L / min. Stellen Sie sicher , Tier Tod durch folgende CO 2 Exposition mit Genickbruch vor mit Dissektion fortfahren.
- Mit sauberer Technik, sezieren und trennen die Tibiae und femora. Desinfizieren der Haut von Mäusen mit 70% Ethanol , bevor ein Einschnitt entlang der anterioren Oberfläche jedes Hinterbein machen Tibia und Femur zu belichten.
- Schnitt durch das Kniegelenk, das distale Ende des Femurs freizugeben, und durch den Femur so nahe am Becken wie möglich schneiden. Entfernen Sie den Oberschenkelknochen und reinigen so viel Weichgewebe wie möglich. die Tibia, schneiden durch den Knöchel und entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich zu entfernen.
- Halten Sie die Knochen mit einer Pinzette und bündig Mark in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2,5 ml Raumtemperatur α-MEM Kombination Markwallungen aus einer einzigen Maus in einem einzigen Rohr.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Mark Flush wird die Färbung von t änderner Knochen von rot bis beige. - Lassen Sie Trümmer auf den Boden der Röhre und Überstand in ein sauberes 15 ml konischen Röhrchen kümmert absetzen zu vermeiden, alle Ablagerungen zu übertragen.
HINWEIS: Einige Zellen können auch mit dem Mark Trümmer absetzen. Wenn eine größere Anzahl von Zellen erforderlich ist, marrow Wallungen kann durch einen 70 & mgr; m Zellsieb in ein sauberes 15-ml-Röhrchen gefiltert werden. - Zentrifugenröhrchen (s) bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur Zellen zu pelletieren.
- Vakuum ansaugen den Überstand und resuspendiere Zellpellet in 0,5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer und Inkubation bei 37 ° C für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren.
- 10 ml PBS, um direkt ACK-Zelllösung und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min.
HINWEIS: Die bisher roten Zellpellet sollte nun beige sein. - Vakuum absaugen Überstand und Pellet in 10 ml α-MEM, und die Platte in einer 100-mm-Gewebekultur-behandelte Schale. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchtetenGewebekultur-Inkubator.
HINWEIS: Zählung der Zellen für diesen Schritt nicht erforderlich ist. Während dieser Zeit werden adhärente Zellen aus dem Knochenmark in die Kulturoberfläche befestigen; nicht-adhärenten Zellpopulationen Knochenmark wird in der Schwebe bleiben. MCSF ist in dem Kulturmedium während dieser anfänglichen Inkubation nicht vorhanden.
3. Anreicherung von Osteoklasten Precursors
- Nach Inkubation über Nacht von marrow Wallungen, Transferkulturüberstand, die nicht-adhärenten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen.
HINWEIS: Die Kulturschalen mit anhaftenden Zellen, die Knochenmark mesenchymale Vorläuferzellen umfassen, können mit frischen α-MEM verworfen oder eingespeist werden, wenn für andere Experimente gewünscht.
HINWEIS: Osteoklasten können sie in Gewebekultur-behandelten Schalen bei einer Dichte von 4 x 10 5 Zellen / cm 2 in Osteoklasten - Medium und erfrischende Medium jeden zweiten Tag für 5 Tage durch direkt aus diesen nicht-adhärenten Knochenmarkzellen differenziert werden Plattieren. Fügen α-MEM nicht-adhärenten Zelllösung auf ein Endvolumen von 18 ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml. - 3 ml Zellsuspension jeder bis 6 60 mm Federung Kulturschalen.
- Inkubieren Platten über Nacht bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Während dieser Zeit wird M-CSF stimuliert die Differenzierung von Makrophagen, die auch auf nicht-Gewebekultur-behandelten Oberflächen anhaften kann.
- Nach über Nacht wieder Futter Osteoklastenvorläufer mit 3 ml frischen Makrophagen-Medium inkubiert. Dies entfernt nicht-adhärente Zellen, die nicht zu Makrophagen differenziert haben.
- Weiter zur Kultur Osteoklastenvorläufer bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 Tage oder bis Kulturen erreichen rund 70% Konfluenz.
4. Differenzierung von Osteoklasten
- Osteoklasten-Vorläufer mit 5 ml PBS waschen und behandeln Zellen mit 1 ml marinen Ursprungs proteolytischen / kollagenolytischer Enzym bei Raumtemperatur bis zum cells kann durch leichtes Klopfen der Platte abgelöst werden.
HINWEIS: Osteoklasten-Vorläufer kann nur aufgehoben werden, wenn sie in der Schwebe Geschirr kultiviert werden; Vorläufern befestigen zu fest auf Gewebekultur-behandelten Oberflächen angehoben werden. Trypsin kann Osteoklastenvorläufer aktivieren und sollte vermieden werden. - 4 ml α-MEM zu jeder Schale und Transfer Zellen einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnter Zellen zu einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml und füge M-CSF bis zu einer Endkonzentration von 35 ng / ml und RANKL zu einer Endkonzentration von 100 ng / ml.
- Samenzellen in einer Dichte von 2,6 x 10 4 Zellen / cm 2 in Gewebekultur-behandelten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einer angefeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 2 Tage. Differentiation wird typischerweise in 24-Well - Platten durchgeführt, wobei 5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung ausgesät.
- 2 Tage nach dem Beginn der Differenzierung, Wiederfutterzellen durch Medium mit 1 ml frischem osteoc ersetzenletzte Medium.
HINWEIS: die Differenzierung von Osteoklasten wird in der Regel innerhalb von 3 Tagen abgeschlossen sein. Resultierende Osteoklasten können TRAP-gefärbt für die einfache Quantifizierung und morphologische Analyse sein.
5. Kontinuierliche Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Oberfläche
- Suspend-Ziege-Anti-Human-IgG Fc-Antikörper in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml (1: 1000-Verdünnung von 10 mg / ml stock). Hinzufügen Antikörperlösung zu Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 & mgr; g / cm 2 und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Im Fall von 24-Well-Platten, fügen 250 ul (2,5 ug) pro Vertiefung.
- Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.
- Suspend rekombinantes Jagged1-Fc-Fusionsprotein in PBS bei einer Konzentration von 10 ug / ml. Hinzufügen Jagged1-FC - Lösung auf den Antikörper-beschichteten Kulturoberfläche mit einer Dichte von 1,3 & mgr; g / cm 2 und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Kulturflächen mit einem Antikörper beschichtet only können als Kontrollen verwendet werden.
- Vakuum absaugen Brunnen und füllen mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. Halten PBS in Vertiefungen bis unmittelbar vor der Aussaat zu Zelle sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Seed 2,6 x 10 4 Osteoklastenvorläufer / cm 2 auf beschichteten Oberflächen. Notch-Signalweg wird kontinuierlich für mindestens 3 Tage stimuliert.
6. Temporäre Stimulation der Notch-Signalweg mit Jagged1 beschichteten Beads
- Kombinieren der folgenden in einem entsprechend dimensionierten Schlauch: 0,5 & mgr; g / cm 2 Jagged1-Fc, 21 & mgr; l / cm 2 Protein G - Agarose - Perlen, und PBS auf ein Endvolumen von 1,5 ml. eine ausreichende Anzahl von Jagged1 Perlen für 1 Well einer 24-Well-Platte, kombinieren 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul Protein G Agarose-Kügelchen, und PBS auf 1,5 ml zu bereiten.
- Inkubieren Rohr mit Rotation bei 4 ° C für 2 Stunden.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 1 min bis Pellet-Perlen. Resuspendieren Perlen in 1,5 ml PBS. Wiederholen Sie diesen Wasch2 weitere Male.
- Resuspendieren Jagged1 Perlen in 130 & mgr; l / cm 2 Kulturmedium und gelten für kultivierten Zellen.
- Inkubieren Zellen mit Perlen bei 37 ° C und 5% CO 2 für die gewünschte Zeit. Entfernen Perlen mit mehreren Wäschen von PBS oder Kulturmedium.
- Stellen Sie sicher , Notch - Signalaktivierung über die Messung von Notch Zielgen Transkripte 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Ziel dieser Methode ist es, Kultur und Notch-Signalweg in Osteoklasten-Vorläufer zu stimulieren. Wenn sie richtig kultiviert weisen Osteoklastenvorläufer eine hauptsächlich längliche spindelförmige Morphologie mit glatten Zytoplasma (1A). Sorgfalt sollte immunologische Aktivierung der Osteoklastenvorläufer zu vermeiden. Nach der Aktivierung aus und werden dabei Vorstufen mit schaumigen Zytoplasma abgeflacht (1B). Diese "Spiegelei" Zellen sind resistent gegen RANK-Signalisierung und nicht effizient differenzieren zu reifen Osteoklasten. Unter richtigen Kultur und Differenzierungsbedingungen wird angereichert Osteoklastenvorläufer zu differenzieren und Sicherung in große TRAP-positive kernigen Osteoklasten innerhalb von drei Tagen (Abbildung 1C).
Seeding Osteoklasten-Vorläufer auf Jagged1-Fc-beschichteten Oberflächen hochreguliert Notch Zielgene innerhalb von 24 h(Abbildung 2). Spezifische Gene hochreguliert durch Notch-Signal ändern sich je nach Zelltyp. Im Falle von Osteoklastenvorläufer, die vorherrschende Gens hochreguliert durch Jagged1 ist Hes1, obwohl Hey2 und Myc sind mäßig hochreguliert, sowie. Expression von anderen Notch-Zielgenen, wie Hey1 und p21 sind nicht signifikant durch Jagged1 Stimulation der Osteoklastenvorläufer verändert.
Wenn Osteoklasten - Vorläufer gezüchtet werden in 24-Well - Platten, die Behandlung mit Perlen mit so wenig beschichtet , wie 600 ng Jagged1-Fc eine signifikante Erhöhung der Hes1 Ausdruck innerhalb von 24 h (Abbildung 3) zeigen. Achtundvierzig Stunden Behandlungen zeigen eine ähnliche Zunahme der Hes1 Ausdruck, wenn auch in geringerem Maße.
Abbildung 1: Kultur und Differenzierung von Osteoklasten - Vorläufer. (A)Naïve Osteoklastenvorläufer kultiviert mit 35 ng / ml MCSF und ohne Aktivierung Reize haben eine glatte, spindelförmige Morphologie. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. (B) Bei der immunologischen Aktivierung nehmen Osteoklastenvorläufer eine abgeflachte, schaumgefüllte Morphologie und differenzieren nicht zu Osteoklasten. Zu induzieren Aktivierung wurden Osteoklastenvorläufer mit 10 ng / ml Lipopolysaccharid für 16 h behandelt. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. (C) immunologisch naiv haftOsteoklastenVorläufer kultiviert mit 35 ng / ml MCSF und 100 ng / ml für 3 Tage unterscheiden sich in reife Osteoklasten. Reife Osteoklasten sind große, mehrkernige und TRAP-positiv. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Hochregulierung von Notch Zielgene in Osteoklastenvorläufer ausplattiert auf immobilisiertem Fc-Jagged1. Osteoklasten Vorläufer wurden auf immobilisiertem Jagged1-Fc und kultiviert zogen für 24 Stunden. Während der Kulturperiode Ausdruck Hes1, Hey2 und Myc mRNA erhöht wurde. Andere Notch Zielgene, Hey1 und p21 wurden nicht verändert. Die Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts, Signifikanz wurde unter Verwendung Schülers 1-tailed t-Test. *, P <0,05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Hochregulierung von mRNA in Hes1 Osteoklastenvorläufer behandelt mit Jagged1-Fc - Kügelchen. 600 ng Jagged-Fc-Protein G-Agarosekügelchen gebunden hochreguliert Hes1 Expression in Osteoklasten-Vorläufer gezüchtet in die Vertiefung einer 24-Well-Platteinnerhalb von 24 h der Exposition. Hes1 Induktion durch Jagged1-Perlen war vergleichbar mit Ebenen Hes1 induziert durch Jagged1-Fc-beschichteten Platten. Andere Notch Zielgene, die durch Jagged1-Fc-beschichteten Platten nicht stark induziert wurden, wurden nicht bewertet. Die Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts, Signifikanz wurde unter Verwendung Schülers 1-tailed t-Test. *, P <0,05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Kultur und in vitro Differenzierung von Osteoklasten - Vorläufer liefert eine nützliche Plattform für die Untersuchung von molekularen Mechanismen der osteoclastogenesis und Identifizierung von therapeutischen Ziele für die Knochenregeneration und die Erhaltung der Knochenmasse. Wenn Maus Osteoklastenvorläufer Kultivierung ist das wichtigste Element Wartung von Vorläufern in einem naiven Zustand. Als Makrophagen-ähnliche Zellen werden Osteoklastenvorläufer grundiert, um bakterielle Komponenten und pro-inflammatorische Zytokine zu reagieren. Nach der Aktivierung wird keine Vorläufer Osteoklasten mehr unterscheiden effizient in Osteoklasten. Die primäre Ursache von Vorläufer Aktivierung Anwesenheit von inflammatorischen Zytokinen wie TNFa oder falsch inaktiviert Komplement in fötalem Rinderserum. Aus diesem Grund müssen sera viele für ihre Fähigkeit, vor der Verwendung in Experimenten zu unterstützen osteoclastogenesis getestet werden. Darüber hinaus verwendet, um alle Seren in osteocletzte Vorstufe Kultur Wärme werden müssen Ergänzung zu denaturieren inaktiviert, die die Osteoklasten-Vorläufer aktivieren kann.
Technische Änderungen und Fehlersuche
In diesem Verfahren wird Jagged1-Fc verwendet Notch-Signalweg in Osteoklasten-Vorläufer zu stimulieren. Die Fc-Fusion mit Jagged1 erleichtert sowohl die Immobilisierung an Kulturoberflächen mit Anti-Fc-Antikörper und Kopplung an Protein G-Kügelchen. Anderen Notch-Liganden an Fc fusioniert, wie beispielsweise Delta-like1-Fc, können in ähnlicher Weise verwendet werden. Es ist zu beachten, dass nicht alle Lieferanten Aussagen rekombinanter Notch-Ligandenaktivität bereitzustellen. Daher wird, während rekombinante Notch-Liganden können von mehreren Lieferanten erhalten werden, sollte darauf biologische Aktivität Informationen des Lieferanten oder Tests von Liganden in bekannten Notch-Liganden-responsive Zellen durchgeführt sollte erhalten werden, genommen werden.
Mit den in dieser Methode beschriebenen Protokolle ermöglicht konstitutive und vorübergehende Stimulation der Notch-Zeichenaling in kultivierten Osteoklasten-Vorläufer. Die Standardmethode zur Aktivierung des Notch-Signalerfassungs ist die Quantifizierung von Notch Zielgene über quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR). Zielgene von Notch-Signal upregulated variieren von Zelle, so dass, wenn Notch Stimulation auf einer zuvor nicht charakterisierten Zelltyp durchgeführt wird, Expression einer Reihe von kanonischen Notch Zielgene, wie Mitglieder der Hes und Hey Familie von Transkriptionsfaktoren, sollte bestimmt werden. In einem kürzeren Zeitrahmen, Notch-Aktivierung möglicherweise via Western-Blot-Beurteilung von Notch intrazelluläre Domäne (NICD) nachgewiesen werden kann. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, da es vier Notch-Rezeptoren und NiCds aus den verschiedenen Rezeptoren in verschiedenen Zelltypen sind nicht in gleichem Maße nach der Ligandenstimulation freigesetzt. NICD Ebene in Notch-stimulierte Zellen sollten auch auf ein Niveau in nicht-stimulierten Zellen verglichen werden, um grundlegende NICD Freisetzung zu berücksichtigen.
Einschränkungen der Technik Während dieses Verfahren für alle Notch - Liganden theoretisch anwendbar ist, ist es bis heute nur konsequent angewendet wurde 10 Jagged1 und Delta-like1 Verwendung, 20, 21. Weitere Tests werden benötigt, um zu bestimmen, ob zusätzliche Notch-Liganden an diese Methode zugänglich sind. Dieses Verfahren ist auch unspezifisch in seiner Notch-Rezeptor-Aktivierung; Bewertung bestimmter Notch-Rezeptor-Aktivierung nach Stimulation mit dieser Methode ist notwendig, die zellulären Reaktionen auf bestimmte Notch-Rezeptoren zuzuschreiben.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden
Differenzierung von Osteoklasten liegt abhängig von sowohl Osteoklasten Vorläufernummer und Osteoklasten-Vorläuferdifferenzierungspotenzial. Bewertung der Differenzierung von Osteoklasten von Mischpopulationen Knochenmark kann nicht zwischen Veränderungen in Osteoklasten prec unterscheidenursor Anzahl und potentielle autonome Differenzierung Zelle. Die Anreicherung von Osteoklasten-Vorläufer vor der Differenzierung Kontrollen für Unterschiede in der Vorläufernummern und ermöglicht eine engere Abfrage des Osteoklasten-Differenzierung. Da Notch-Signal verschiedene Effekte an verschiedenen Stellen während osteoclastogenesis ausübt, der zeitlichen Steuerung sowohl Notch-Signalweg und die Differenzierung von Osteoklasten sind von wesentlicher Bedeutung für die ordnungsgemäße Untersuchung der molekularen Wege es regelt.
Zukünftige Anwendungen nach dieser Technik zu meistern
nicht nur in Osteoklastenvorläufer, aber möglicherweise in anderen Zelltypen als auch unter Verwendung dieses Protokolls, die Beurteilung der Rollen für Notch-Signalisierung durchgeführt werden. Durch Variation Länge von Notch Stimulation und Zeit des Notch-Signal Initiation, potenzielle mehrphasige Rollen von Notch-Signalweg in einer Vielzahl von zellulären Prozess definiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
