Introduction
Memeli Çentik sinyal yolu, Drosophila melanogaster, aynı yol homolog olan dört transmembran Çentik reseptörleri (Notch1-4) ve sivri (JAG1 ve JAG2) Delta-benzeri (DLL1, 3 beş zara bağlı ligand içerir ve 4) aileleri 1. Bir alıcı hücreye Çentik alıcısı bir iletim hücresi 2 ligandı ile bağlı olduğunda, Çentik sinyal başlatılır. Bu şekilde trans-aktivasyon sırasında zara bağlı Çentik ligand zara bağlı Çentik alıcısı 3, 4 üzerinde bir germe kuvveti üretir. bağlayıcı ligandın germe kuvveti presenilin-içeren y-sekretaz kompleksi (γ-sekretaz) tarafından aracılık edilen bir hücreiçi bölünme etkinliği ve ardından enzim (TACE), dönüştürücü TNFalfa ile reseptörünün hücre dışı ayrılmasını kolaylaştıran Çentik reseptörde konformasyonel değişikliklere neden olur. γ-sekretaz bültenleri Notch intBu CBF-1-Su (lH) -Lag-1 (CSL), beyni benzeri (MAML) bir transkripsiyonel aktivasyon kompleks oluşturan çekirdek içine geçiş yapar ve hücre tipine spesifik faktörler, ekspresyonu hızlandırmak için racellular alan (NiCd) genler 5 hedef.
In vitro Notch yolu aktivasyonu eşsiz yöntemlere ihtiyaç Notch sinyal aktivasyon sonucu mekanik elemanlar. Eriyebilir Çentik ligandlarmın reseptörlerine Notch bağlanan, ancak aynı zamanda, rekabetçi, hücreye birleşik Çentik ligandların bağlanmasını inhibe ederken NICD serbest bırakılması için gerekli kuvvetleri gerilme özelliklerine göre başarısız olabilir. Bu nedenle, kültür ortamına eriyebilir Çentik ligandlarmın eklenmesi 6, 7 sinyal, normal Notch azaltabilir. Bunlar uygun bir şekilde katı bir alt-tabaka 5, 8, 9 sabitlenmektedir Neyse ki, Çentik ligandları NICD salınmasını,10. Ligand kaplı kültür yüzeylerde hücreleri tohumlama veya hücrelere ligand kaplı boncuklar uygulayarak hem Notch sinyali etkinleştirmek ve aralarındaki seçim Notch stimülasyon istenen zamanlaması öncelikle bağlıdır olabilir. fonksiyonel ya da farklılaşma deneyinde orta noktası boyunca arzulanan gibi anında geçici Çentik sinyal aktivasyonu için, Çentik ligand kültürlenmiş hücrelere uygulanan boncuklar, agaroz bağlı olabilir ve herhangi bir zamanda yıkanmıştır. bir kültür süresinin başlangıcından itibaren daha sürekli Çentik sinyallemesinin için, doku kültürü plakaları Hücre Serpilmesi önce bir ligant ile kaplanabilir.
Bu protokol amaçları için, yöntemler, fare osteoklast öncüler kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak burada tarif edilen yöntemler ile ilgili yöntemler ve varyasyonların hücre tipleri 6, 11, 12, 13, çok çeşitli uygulanabilir, 14. Osteoklastlar terminal kemik dokusunun emilmesinden sorumlu olan farklılaşmış hematopoietik nesilli hücreleridir ve bunlar kemik kaybı 15 birden fazla rahatsızlığa rol oynar. Böylece, monosit / makrofaj-soy öncüleri osteoklastlar ve fonksiyon osteoklastlar ve yeni kemik-yenileyici tedavilerin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması için gereklidir kontrol eden moleküler mekanizmaların farklılaşma in vitro çalışmada. Bu artık, genel olarak bu çentik sinyal osteoklast farklılaşması ve fonksiyonunda pozitif bir rol oynadığını kabul edilmekle birlikte, her iki çentik sinyal uyarılması ve osteoklast ön-kültürü ve farklılaşmasında varyasyonlar ilk çelişkili sonuçlar 16, 17, 18, 19 yol açmıştır. Yakından yöntemleri farklılıkların incelenmesi ve genetik kullanımımodeller büyük ölçüde osteoklastogenez Notch sinyalizasyon rolünü açıklık, ama standardize Notch uyarılması ve kültür yöntemlerinin uygulama diğer hücre tipleri 20, 21, 22, 23 Notch sinyalizasyon gelecekteki çalışmalarda bu tür tartışmaları engelleyebilir.
Notch sinyali teşvik etmek için çeşitli yöntemler olduğu gibi, en iyi yöntem deneysel soru bağlı olacaktır, orada kültüre ve fare osteoklast öncülerini ayırt etmek için birden çok yöntem vardır ve. Burada, fare uzun kemiklerde temizlendi ilik hücrelerinin yapışık ve yapışmaz kesirler kültüre bizim tercih edilen yöntem sunulacaktır. Bu yöntem, farklılaşma çeşitli yöntemler uygulanabilir hücreleri esas olarak herhangi bir özel ekipman gerektiren ve üretme avantajına sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırma Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde gerçekleştirildi.
1. Kültür Medya Hazırlık
- Ve 100 ml ısı, 900 mi, H2O içinde en az temel ortam (MEM) tozu ve 1.9 g sodyum bikarbonat çözülmesiyle α-MEM hazırlanması ve 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile takviye inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu. 0.22 mikron polyethersulfone (PES) filtre kullanarak sterilize edin.
- 35 ng α-MEM ilave makrofajın orta hazırlayın / ml rekombinant fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF)
- 100 ng / ml RANKL ile makrofaj ortamı ilave ederek osteoklast ortamı hazırlayın
2. Kemik iliği Hücre İzolasyonu
- 10 mi α-MEM ile fare başına 25⅝ gauge iğne ile bir 10 ml şırınga doldurun. 1.3 L / dakikalık bir akış oranında CO 2-10 dakika maruz kalma ile fareler öldürülür. Diseksiyon başlamadan önce servikal dislokasyon ile CO 2 pozlama takip ederek hayvan ölümü sağlayın.
- Temiz tekniği kullanarak, teşrih ve fibula ve femora ayırın. Kaval ve femur maruz her arka bacak ön yüzeyi boyunca bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile fare cildi dezenfekte edin.
- femur distal ucunu serbest diz eklemine kesti, ve mümkün olduğunca pelvis yakın olarak femur kesti. Uyluk çıkarın ve mümkün olduğu kadar yumuşak doku temizleyin. ayak bileği kesti tibia, kaldırmak ve mümkün olduğunca yumuşak doku kaldırmak için.
- 2.5 ml oda sıcaklığında α-MEM, tek bir tüp içine tek bir fare kemik iliği basması birleştirerek bir 15 ml konik tüp içine forseps ve gömme iliği ile kemik tutun.
NOT: Başarılı bir kemik iliği floş t renklerini değişecekO kırmızı kemik bej. - enkaz tüpün dibe ve herhangi bir enkaz aktarılmasını engellemek için temiz bir 15 ml konik tüp alma bakımına süpernatant aktarmak için izin verin.
NOT: Bazı hücreler de kemik iliği enkaz ile razı olabilir. hücrelerin daha fazla sayıda gerekli ise, kemik iliği basması temiz 15 ml'lik bir tüp içine 70 mikron hücre süzgecinden süzülür. - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpüne (ler) hücreler pelet.
- Vakum tampon lize 0.5 mi Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de çözeltisi ve santrifüj hücresi ACK doğrudan 10 ml PBS ilave edin.
NOT: Daha önce kırmızı hücre pelet şimdi bej olmalıdır. - 100 mm doku kültürü ile tedavi edilen çanak vakum aspirasyon supernatant ve tekrar süspansiyon pelet 10 ml α-MEM içinde ve plaka. nemlendirilmiş, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe hücreleridoku kültürü kuluçka.
NOT: hücrelerin sayılması bu adım için gerekli değildir. Bu süre boyunca, kemik iliğinden yapışan hücreler, kültür yüzey eklenecektir; yapışmayan kemik iliği hücre popülasyonları süspansiyon içinde kalır. MCSF Bu ilk inkübasyon sırasında kültür ortamında mevcut değildir.
Osteoklast Öncüleri 3. zenginleştirilmesi
- iliği basması, 50 ml yıkanarak yapışmayan hücreler konik tüp içeren transfer kültür süpernatanının gece boyunca inkübe edildikten sonra.
Not: Kemik iliği mezenkimal projenitör hücreleri, yapışık hücreler ile kültür tabaklarında, iptal edilebilir ya da başka deneyler için arzu edildiği takdirde, taze α-MEM ile beslenir.
Not: Osteoklastlar, 5 gün boyunca her gün osteoklast orta ve ferahlatıcı bir ortam içinde 4 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş tabaklar içine kaplama ile, bu yapışmayan kemik iliği hücreleri ile irtibata ayırt edilebilir. 18 ml'lik bir son hacme yapışmayan hücre çözeltisine α-MEM ilave edin ve 35 ng / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar M-CSF ekleyin. - 6 60 mm süspansiyonu kültür tabaklarında hücre süspansiyonu her bir 3 ml ekleyin.
- nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Bu süre boyunca, M-CSF daha olmayan doku kültürü ile muamele edilmiş yüzeylerin yapışabilir makrofajlar, farklılaşmasını teşvik edecektir.
- bir gecede 3 ml taze makrofaj ortamı ile, yeniden besleme osteoklast öncülerini kuluçka sonra. Bu makrofajlar içine farklılaştırılmış değil yapışmayan hücreleri çıkarmak olacaktır.
- 2 gün veya kültürlerinin yaklaşık 70% konfluansta ulaşana kadar CO2, 37 ° C'de, kültür osteoklast öncüler devam ve% 5.
4. Osteoklast Farklılaşma
- cel kadar oda sıcaklığında 1 mi Deniz menşeli proteolitik / kolajenolitik enzim hücreler 5 ml PBS ile osteoklast öncüler yıkayın ve tedavisils plakanın nazik dokunarak yerinden yapılabilir.
NOT: süspansiyon yemekleri kültüre ise osteoklast öncüleri sadece kaldırılabilir; öncüleri kaldırılması için doku kültürü ile işlenmiş yüzeylere çok sıkı bir şekilde takın. Tripsin osteoklast öncülerini aktive edebilir ve kaçınılmalıdır. - 50 ml konik tüp, her çanak ve aktarım hücrelere 4 ml α-MEM ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve mi, 5 x 10 4 hücre / bir yoğunluğa hücreleri sulandırmak ve 100 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar 35 ng / ml ve RANKL nihai konsantrasyona M-CSF ekleyin.
- Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara 2.6 x 10 4 hücre / cm2 yoğunluğunda tohum hücreleri ve 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma, tipik olarak 5 x 10 4 hücre her bir kuyunun içine ekilir 24 oyuklu plakalar içinde gerçekleştirilmektedir.
- 2 gün 1 ml taze osteoc ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık yeniden besleme hücrelerinin başladıktan sonraGeçen ortam.
Not: osteoklast başkalaşımı, genellikle 3 gün içinde tamamlanır. Ortaya çıkan osteoklastlar TRAP-lekeli kolay ölçümü ve morfolojik analizler için olabilir.
Jagged1 kaplı Yüzeyli Notch Sinyal 5. Sürekli Stimülasyon
- 10 ug / ml bir konsantrasyonda PBS içinde keçi anti-insan IgG Fc antikoru Askıya (1: 10 mg / ml stok 1000 seyrelti). 1.3 ug / cm2 'lik bir yoğunlukta kültür yüzey antikor solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 24 oyuklu plakalar halinde, oyuk başına 250 ul (2.5 ug) ilave edilir.
- Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
- 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda PBS içinde yeniden birleştirici Jagged1-Fc füzyon proteinini süspanse edin. 1.3 ug / cm2 'lik bir yoğunlukta antikor kaplı kültür yüzey Jagged1-YP solüsyonu ilave edin ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kültür yüzey antikoru ONL ile kaplanmışY kontrol olarak da kullanılabilir.
- Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. kurumasını önlemek için tohumlama hücre hemen önce kadar kuyu PBS tutun.
- Tohum 2.6 x 10 4 osteoklast ön-maddeleri / kaplanmış yüzeyler üzerine cm2. Çentik sinyal sürekli en az 3 gün süre ile teşvik edilecektir.
Jagged1 kaplı Boncuk ile Notch Sinyal 6. Geçici Stimülasyon
- 1.5 ml'lik bir son hacimde 0.5 mg / cm 2 Jagged1-Fc, 21 ul / cm2 protein G agaroz boncuklar, ve PBS: uygun boyutta bir boru aşağıdaki birleştirin. Bir 24 yuvalı plaka 1 kuyu için Jagged1 boncuk yeterli sayıda hazırlanması 1.5 ml 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul protein G agaroz boncuklar, ve PBS birleştirmek için.
- 4 dönme ile tüp inkübe 2 saat ° C.
- Pelet tanelerine 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpü. 1.5 ml PBS içinde süspanse boncuk. Bu yıkama tekrarlayın2 kez daha.
- 130 ul / cm2, kültür ortamı içinde yeniden süspanse Jagged1 boncuk ve kültürlenmiş hücrelere uygulanır.
- İstenen süre için CO2 37 ° C'de boncuk hücreleri inkübe ve% 5. PBS veya kültür ortamının çok yıkama ile boncuk çıkarın.
- Notch hedef gen kopyalarının 10 ölçümü yoluyla Notch sinyal aktivasyonunu doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemin amacı, kültürüne ve osteoklast öncüleri olarak Notch sinyali uyarır. Düzgün kültürlenmiş, osteoklast ön-maddeleri düzgün bir sitoplazma (Şekil 1A) ile esas olarak uzunlamasına aks-benzeri morfolojiye sergiler. Bakım osteoklast öncülerinin immünolojik aktivasyon önlemek için alınmalıdır. Aktivasyonu üzerine, ön-yayılmış ve köpüksü sitoplazma (Şekil 1B) basık hale gelir. Bu "kızarmış yumurta" hücreler SIRA sinyalizasyon dayanıklıdır ve verimli olgun osteoklastlar içine bir ayrım yoktur. Doğru kültür ve farklılaşma koşullar altında, zenginleştirilmiş osteoklast öncüleri ayırt edecek ve üç gün (Şekil 1C) içinde büyük TRAP-pozitif multinükleer osteoklastlar içine sigorta.
24 saat içinde Notch hedef genleri düzenleyen yukarı-Jagged1-Fc kaplı yüzeylere osteoklast öncülerini Seeding(Şekil 2). Notch sinyalizasyon tarafından regüle spesifik genler hücre tipine göre değişir. Hey2 ve myc, hem de orta up-regüle olsa osteoklast öncüler durumunda, Jagged1 tarafından regüle en baskın geni Hes1 olup. Bu Hey1 ve p21 gibi Çentik hedef genlerin ekspresyonu anlamlı osteoklast öncüler Jagged1 uyarılması ile değiştirilmez.
Osteoklast ön-maddeleri, 24 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi olduğunda, boncuklar ile muamele Jagged1-Fc, 24 saat (Şekil 3) içinde Hes1 ekspresyonunda önemli bir artış göstermektedir ng az 600 ile kaplanır. daha az bir dereceye kadar da Kırk sekiz saat tedaviler Hes1 ifade olan bir artış göstermektedir.
Şekil 1: Kültür ve osteoklast öncüleri farklılaşma. (A)35 ng / ml mCSF ve aktivasyon uyaran olmadan kültüre naif osteoklast öncüleri pürüzsüz, iğ şeklinde morfolojiye sahiptir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Immünolojik aktivasyonu üzerine (B), osteoklast öncüleri basık, köpük dolgulu morfoloji benimsemek ve osteoklast içine ayırt olmayacaktır. aktivasyonunu teşvik etmek için, osteoklast ön-maddeleri 16 saat 10 ng / ml lipopolisakarid ile muamele edilmiştir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. 35 ng / ml mCSF ile kültürlenen (C) İmmünolojik olarak naif yapışık osteoklast ön-maddeleri ve 3 gün boyunca 100 ng / ml olgunlaşmış osteoklastlar farklılaşırlar. Olgun osteoklastlar, büyük çok çekirdekli ve TRAP-pozitiftir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: hareketsizleştirilmiş Jagged1-Fc ile kaplanmış osteoklast öncüler Notch hedef genlerin yukarı regülasyonu. Osteoklast ön hareketsiz Jagged1-Fc ile kaplanmış ve 24 saat süre ile kültüre edildi. kültür periyodu boyunca, sentezleme Hes1, hey2 ve Myc mRNA arttırılmıştır. Diğer çentik hedef genler, Hey1 p21 değişmemiştir. Hata çubukları öğrencinin 1-kuyruklu t testi kullanılarak değerlendirildi ortalama, standart anlamlılık hatası vardır. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Jagged1-Fc boncuklar ile muamele osteoklast öncüler olarak Hes1 mRNA yukarı regülasyonu. Protein G agaroz boncuklara bağlı 600 ng Titreşimli-Fc, 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu kültürlenmiş osteoklast öncüler olarak Hes1 ekspresyonunu yukarı-regülemaruziyet 24 saat içinde. Jagged1-boncuklar Hes1 indüksiyon Jagged1-Fc ile kaplanmış plakalar neden Hes1 seviyeleri ile karşılaştırılabilir. güçlü Jagged1-Fc ile kaplanmış plakalar neden olmayan diğer Çentik hedef genler değerlendirilmemiştir. Hata çubukları öğrencinin 1-kuyruklu t testi kullanılarak değerlendirildi ortalama, standart anlamlılık hatası vardır. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokolü içinde kritik adımlar
Kültür ve osteoklast ön-maddeleri arasında nitro farklılaşmasında osteoclastogenez ve kemik rejenerasyonu ve kemik kütlesinin korunması için terapötik hedeflerin tanımlanması moleküler mekanizmalarının incelenmesi için yararlı bir platform sağlar. Fare osteoklast öncülerini kültürlerken, en kritik unsur, bir naif bir durumda öncüleri bakımıdır. makrofaj-benzeri hücreler olarak, osteoklast ön-maddeleri, bakteriyel bileşenler ve pro-inflamatuar sitokinlere karşı hazır. aktivasyonu üzerine, osteoklast öncüleri artık verimli osteoklast içine ayırt edecektir. ön-madde aktivasyonunun başlıca nedeni fetal sığır serumu gibi TNFa gibi enflamatuar sitokinlerin varlığı ya da uygun olmayan şekilde inaktive tamamlayıcıdır. Bu nedenle, sera çok deneylerde kullanılmadan önce osteoklastojenezi desteklemek için yetenekleri açısından test edilmelidir. Buna ek olarak, tüm sera osteoc kullanılanson habercisi kültür ısı osteoklast öncülerini etkinleştirebilirsiniz tamamlayıcı denatüre inaktive edilmelidir.
Değişiklikler ve sorun giderme
Bu yöntemde, Jagged1-Fc osteoklast öncüler Notch sinyal uyarmak için kullanılır. Jagged1 ile Fc füzyon proteini G boncuk anti-Fc antikorları ve bağlantı kültür yüzeylerde hem immobilizasyon kolaylaştırır. Bu delta-like1-Fc Fc'ye ekli diğer Çentik ligandları, benzer bir şekilde kullanılabilir. O değil tüm tedarikçiler rekombinant Çentik ligand aktivite raporlarını sunmalarını unutulmamalıdır. Rekombinant Çentik ligandlan birden tedarikçilerden elde edilebilir ise bu nedenle, bakım yapılmalıdır ilgili bilinen ya da Çentik ligand duyarlı hücrelerde ligandların testler Biyolojik aktivite bilgilerini elde etmek üzere dikkat edilmelidir.
Bu yöntemde tarif edilmiş protokolleri kullanılarak çentik işareti kurucu ve geçici uyarılmasına imkan verirKültür osteoklast öncüler olarak aling. Çentik sinyallemesinin aktivasyonuna tespit edilmesi için standart bir yöntem kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) üzerinden çentik hedef genlerin miktar olup. Çentik sinyallemesi ile üst-düzenlenmektedir Hedef genler hücre göre değişir, bu yüzden Çentik uyarılması gibi Hes üyeleri olarak önceden karakterize edilmemiş bir hücre tipi, kanonik Çentik hedef genlerinin bir panelin ifadesi üzerindeki gerçekleştirilir ve Hey transkripsiyon faktörleri ailesinin belirlenmelidir. daha kısa bir zaman dilimi içinde, çentik aktivasyonu potansiyel Çentik hücre içi alanın (NiCd) Western blot değerlendirilmesi ile tespit edilebilir. Bakım, dört çentik reseptörleri ve NICDs farklı hücre tiplerinde farklı reseptörlerden olarak orada ligand uyarılmasını takiben aynı derecede serbest değildir, ancak, alınmalıdır. Çentik uyarılmış hücrelerde NICD seviyesi, temel NICD serbest bırakılması için hesap, uyarılmamış hücrelerde seviyelere karşılaştırılmalıdır.
tekniğin sınırlamaları Bu yöntem, tüm Çentik ligandlan teorik uygulanabilir olsa da, sadece sürekli olarak yapılmış Jagged1 10 Delta-like1, 20, 21 kullanarak tatbik Bugüne kadar. Bundan başka testleri Ek Çentik ligandlan, bu yöntem için uygun olup olmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. Bu yöntem, aynı zamanda Çentik alıcı aktivasyonu ile spesifik olduğu; Bu yöntemi kullanarak, belirli bir çentik reseptör aktivasyonu şu stimülasyon değerlendirmesi belli bir çentik reseptörlerine hücresel tepkileri atfetmek gerekir.
Mevcut / alternatif yöntemlere göre tekniğin önemi
Osteoklast farklılaşması osteoklast öncü numarası ve osteoklast öncü farklılaşma potansiyelinin hem de yukarı bağlıdır. Karma kemik iliği popülasyonlarının osteoklast farklılaşması değerlendirilmesi osteoklast Yağışlı değişiklikler arasında ayrım yapamazursor sayısı ve hücre bağımsız farklılaşma potansiyeli. öncül numaraları farklılıkların farklılaşma kontrolleri öncesinde osteoklast öncülerinin zenginleştirilmesi ve osteoklast farklılaşma sürecinin yakından sorgulama sağlar. Çentik sinyal osteoklastogenez sırasında farklı noktalarda farklı etkiler ortaya göz önüne alındığında, Çentik sinyallemesi ve osteoclast farklılaşmasında hem zamansal kumanda bu tabi molekül yollarının uygun soruşturma için gereklidir.
Bu tekniği mastering sonra gelecekteki uygulamalar
Bu protokol kullanılarak, çentik sinyali için roller değerlendirme ve osteoklast ön-maddeleri, aynı potansiyel olarak diğer hücre tiplerinde, sadece gerçekleştirilebilir. Çentik uyarımı ve Çentik sinyal başlatma süre değiştirilerek, hücresel sürecin çeşitli Çentik sinyallemesinin muhtemel çok fazlı roller tanımlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
