Introduction
Pattedyrs Notch signalvej er homolog med den samme vej hos Drosophila melanogaster og består af fire transmembrane Notch receptorer (Notch1-4) og fem membranbundne ligander af Jagged (JAG1 & JAG2) og Delta-lignende (DLL1, 3, & 4) familier 1. Notch signalering initieres når Notch receptor på en modtagende celle er bundet af ligand på en transmitterende celle 2. Under denne trans-aktivering, det membranbundne Notch-ligand frembringer en strækning kraft på den membranbundne Notch-receptor 3, 4. Strækkraften af ligand binding inducerer konformationelle ændringer i Notch-receptoren, som letter ekstracellulær spaltning af receptoren ved TNFa-omdannende enzym (TACE), efterfulgt af en intracellulær spaltning begivenhed medieret af en presenilin-indeholdende y-sekretase kompleks (γ-sekretase). γ-sekretase frigiver Notch intracellular domæne (NiCd), som translokerer ind i kernen, hvor den danner en transkriptionel aktivering kompleks med CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-lignende (MAML), og celle-typespecifikke faktorer til at drive ekspression af target gener 5.
De mekaniske elementer i Notch signalering aktivering resulterer i behovet for unikke fremgangsmåder til Notch-aktivering in vitro. Opløselige Notch-ligander kan binde til Notch receptorer, men undlader at producere strækker kræfter er nødvendige for NiCd frigivelse, mens på samme tid kompetitivt at inhibere binding af celleassocierede Notch-ligander. Således kan tilsætning af opløselige Notch ligander til dyrkningsmediet dæmpe normal Notch signalering 6, 7. Heldigvis kan Notch-ligander inducerer NiCd frigivelse, hvis de er fastgjort til et passende stift substrat 5, 8, 9,10. Podning celler på ligand-coatede kultursubstrater eller påføring ligand-overtrukne perler til celler kan både aktivere Notch signalering, og valget mellem dem afhænger primært af den ønskede timing af Notch stimulation. For øjeblikkelig, midlertidig Notch signalering aktivering, som det kunne ønskes under midtpunktet af en funktionel eller differentiering assay Notch-ligand kan bindes til agarose perler, der anvendes til dyrkede celler, og udvaskes til enhver tid. For mere vedvarende Notch signalering fra begyndelsen af en dyrkningsperiode kan vævskulturpladerne overtrækkes med ligand før cellepodning.
Ved anvendelse af denne protokol er fremgangsmåder udføres under anvendelse af muse osteoklastpræcursorer, men metoderne og variationer over fremgangsmåderne beskrevet her kan anvendes til en bred række celletyper 6, 11, 12, 13, 14. Osteoklaster terminalt differentierede hæmatopoietiske linage celler, som er ansvarlige for resorptionen af knoglevæv, og de er impliceret i flere sygdomme i knogletab 15. Således in vitro-undersøgelse af differentieringen af osteoklaster fra deres monocyt / makrofag-afstamningsceller prækursorer og de molekylære mekanismer, der styrer deres funktion er afgørende for bedre forståelse af osteoklaster og udvikling af nye knogle-regenererende behandlinger. Selv om det nu er almindeligt accepteret, at Notch signalering spiller en positiv rolle i differentiering og funktion af osteoklaster, variationer i både Notch signalering stimulation og osteoklast forløber kultur og differentiering medførte i første omgang modstridende fund 16, 17, 18, 19. En nærmere undersøgelse af forskellene i metoder og brug af genetiskemodeller har i høj grad afklaret rolle Notch signalering i osteoklastogenese, men anvendelse af standardiserede Notch stimulation og dyrkningsmetoder kunne forhindre sådanne kontroverser i fremtidige studier af Notch signalering i andre celletyper 20, 21, 22, 23.
Der er flere metoder til dyrkning og differentiering muse osteoklastpræcursorer, og som med varierende fremgangsmåder til stimulering Notch signalering, vil den bedste metode afhænge af den eksperimentelle spørgsmål. Heri, vil vores foretrukne metode til dyrkning adhærente og ikke-adhærente fraktioner af marvceller skylles ud muse lange knogler blive præsenteret. Denne fremgangsmåde har den fordel, at der i det væsentlige ingen specialudstyr og producerende celler, som er anvendelig til en række forskellige differentierings- metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al forskning omfatter hvirveldyr blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af University of Pennsylvania Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Dyrkningsmedier Fremstilling
- Forbered α-MEM ved opløsning minimalt essentielt medium (MEM) pulver og 1,9 g natriumbicarbonat i 900 ml H2O og supplere med 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 100 ml varme- føtalt bovint serum. Sterilisere bruge en 0,22 um polyethersulfon (PES) filter.
- Forbered makrofag medium ved at supplere α-MEM med 35 ng / ml rekombinant muse makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF)
- Forbered osteoclast medium ved at supplere makrofag medium med 100 ng / ml RANKL
2. knoglemarv Cell Isolation
- Fyld en 10 ml sprøjte med en 25⅝ gauge nål pr mus med 10 ml α-MEM. Aflive mus via 10 min udsættelse for CO2 ved en strømningshastighed på 1,3 l / min. Sørg dyr død ved at følge CO2 eksponering med cervikal dislokation før du fortsætter med dissektion.
- Ved hjælp af ren teknik, dissekere ud og skille skinnebenene og femora. Desinficere musehud med 70% ethanol før et snit langs den forreste overflade af hver bagben for at blotlægge skinneben og lårben.
- Skære gennem knæleddet at frigøre den distale ende af lårbenet, og skære gennem femur så tæt til bækkenet som muligt. Fjern lårben og rengør så meget blødt væv som muligt. For at fjerne tibia, skære gennem ankel og fjerne så meget blødt væv som muligt.
- Hold knoglen med pincet og skyl marv i en 15 ml konisk rør med 2,5 ml rumtemperatur α-MEM kombinere marv flushes fra en enkelt mus i et enkelt rør.
BEMÆRK: En vellykket marv flush vil ændre farvning af than knogle fra rød til beige. - Tillad debris at bosætte til bunden af røret og overføre supernatanten til et rent 15 ml konisk rør tage sig at undgå at overføre eventuelle rester.
BEMÆRK: Nogle celler kan også nøjes med marv vragrester. Hvis et større antal celler er påkrævet, kan marv flushes filtreres gennem et 70 um cellefilter i et rent 15 ml rør. - Centrifugeglas (s) ved 300 xg i 5 min ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
- Vakuum aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 0,5 ml Ammonium-Chloride-Kalium (ACK) lyseringsbuffer og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter for at lysere røde blodlegemer.
- Tilsæt 10 ml PBS direkte til ACK-celle-opløsning, og der centrifugeres ved 300 xg i 5 min.
BEMÆRK: Det tidligere røde cellepellet skulle nu være beige. - Vakuum aspireres supernatanten og resuspender pellet i 10 ml α-MEM, og plade i en 100 mm vævskultur-behandlet skål. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C i en fugtigvævskulturinkubator.
BEMÆRK: Counting celler er ikke nødvendig til dette trin. I løbet af denne tid vil adhærerende celler fra knoglemarven tillægger kulturen overflade; ikke-adhærente knoglemarvsceller cellepopulationer vil forblive i suspension. MCSF ikke er til stede i dyrkningsmediet under denne indledende inkubering.
3. Berigelse af osteoklastpræcursorer
- Efter inkubation natten over af marv flushes, overførsel dyrkningssupernatant indeholdende ikke-adhærente celler til en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: dyrkningsskåle med adhærente celler, som omfatter knoglemarvs mesenkymale stamceller, kan kasseres eller fodres med frisk α-MEM, om ønsket for andre eksperimenter.
BEMÆRK: Osteoklaster kan skelnes direkte fra disse ikke-adhærente knoglemarvsceller ved udpladning dem i vævskultur-behandlet skåle ved en densitet på 4 x 10 5 celler / cm2 i osteoklast-medium og forfriskende medium hver anden dag i 5 dage. Tilføj α-MEM til ikke-klæbende celle opløsning til et endeligt volumen på 18 ml, og der tilsættes M-CSF til en slutkoncentration på 35 ng / ml. - Tilsæt 3 ml cellesuspension hver til 6 60 mm suspension dyrkningsskåle.
- Pladerne inkuberes natten over ved 37 ° C i en befugtet vævskultur-inkubator. I løbet af denne tid, vil M-CSF stimulerer differentiering af makrofager, der kan klæbe selv til ikke-vævskultur-behandlede overflader.
- Efter inkubation natten over, re-foder osteoklastpræcursorer med 3 ml frisk makrofag medium. Dette vil fjerne ikke-adhærente celler, der ikke differentierede til makrofager.
- Fortsæt til kultur osteoklastpræcursorer ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 dage, eller indtil kulturerne nå op på omkring 70% konfluens.
4. osteoklastdifferentiering
- Vask osteoklastpræcursorer med 5 ml PBS og behandle cellerne med 1 ml marine-oprindelse proteolytiske / collagenolytisk enzym ved stuetemperatur indtil den cells kan fjernes ved en let banken på pladen.
BEMÆRK: osteoklastpræcursorer kan kun ophæves, hvis de dyrkes i suspension retter; forstadier lægger for fast til vævskultur-behandlede overflader, der skal løftes. Trypsin kan aktivere osteoklastpræcursorer og bør undgås. - Tilsæt 4 ml α-MEM til hver skål og overføre cellerne til et 50 ml konisk rør. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og fortyndes cellerne til en tæthed på 5 x 10 4 celler / ml, og der tilsættes M-CSF til en slutkoncentration på 35 ng / ml og RANKL til en slutkoncentration på 100 ng / ml.
- Seed celler ved en densitet på 2,6 x 10 4 celler / cm2 i vævskulturplader-behandlede plader og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet vævskultur-inkubator i 2 dage. Differentiering udføres typisk i 24-brønds plader, hvor 5 x 10 4 celler podes i hver brønd.
- 2 dage efter starten af differentieringen, re-foder-celler ved at udskifte medium med 1 ml frisk osteocsidste medium.
BEMÆRK: osteoklastdifferentiering vil sædvanligvis være fuldstændig inden for 3 dage. Resulterende osteoklaster kan være TRAP-farvet for nem kvantificering og morfologiske analyse.
5. Kontinuerlig Stimulering af Notch Signaling med Jagged1-overflade
- Suspender gede-anti-humant IgG Fc-antistof i PBS ved en koncentration på 10 ug / ml (1: 1000 fortynding af 10 mg / ml stamopløsning). Tilføj antistofopløsning til kultur overflade ved en densitet på 1,3 ug / cm 2 og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. I tilfælde af plader med 24 brønde tilsættes 250 pi (2,5 ug) per brønd.
- Vakuum aspiratprøver brønde og refill med 1 ml PBS. Gentag dette trin 2 gange.
- Suspender rekombinant Jagged1-Fc-fusionsprotein i PBS ved en koncentration på 10 ug / ml. Tilføj Jagged1-FC løsning på antistofcoatede kultur overflade ved en densitet på 1,3 ug / cm 2 og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer. Kultur overflader belagt med antistof only kan bruges som kontroller.
- Vakuum aspiratprøver brønde og refill med 1 ml PBS. Gentag dette trin 2 gange. Hold PBS i brønde indtil umiddelbart inden cellepodning at forhindre dem i tørring.
- Seed 2,6 x 10 4 osteoklastpræcursorer / cm2 på coatede overflader. Notch signalering vil løbende blive stimuleret i mindst 3 dage.
6. Midlertidig Stimulering af Notch Signaling med Jagged1-belagte perler
- Kombiner følgende i en hensigtsmæssigt dimensioneret rør: 0,5 ug / cm2 Jagged1-Fc, 21 pl / cm2 protein G agaroseperler, og PBS til et endeligt volumen på 1,5 ml. Til fremstilling af en tilstrækkeligt antal Jagged1 perler i 1 brønd på en plade med 24, kombinere 1 ug Jagged1-Fc, 40 pi protein G agaroseperler, og PBS til 1,5 ml.
- Inkuber rør med rotation ved 4 ° C i 2 timer.
- Centrifugerør ved 300 xg i 1 min til pelletering perler. Resuspender perler i 1,5 ml PBS. Gentag denne vask2 gange mere.
- Resuspender Jagged1 perler i 130 pl / cm2 dyrkningsmedium og gælder for dyrkede celler.
- Cellerne inkuberes med perler ved 37 ° C og 5% CO2 i ønskede periode. Fjern perler med flere vaske med PBS eller dyrkningsmediet.
- Verificere Notch signalering aktivering via måling af Notch målgen transkripter 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne metode er at kultur og stimulere Notch signalering i osteoklastpræcursorer. Ved korrekt dyrket, osteoklastpræcursorer udviser et primært langstrakt spindel-formet morfologi med blank cytoplasma (figur 1A). Der bør udvises forsigtighed for at undgå immunologiske aktivering af osteoklastpræcursorer. Efter aktivering, prækursorer brede sig og blive fladtrykt med skummende cytoplasma (figur 1B). Disse "stegt æg" celler er resistente over for RANK signalering og ikke effektivt differentierer til modne osteoklaster. Under korrekte kultur og differentiering betingelser, vil beriget osteoklastpræcursorer differentiere og sikring i store TRAP-positive multinucleare osteoklaster inden for tre dage (figur 1C).
Såning osteoklastpræcursorer på Jagged1-Fc coatede overflader opregulerer Notch målgener inden 24 timer(Figur 2). Specifikke gener opreguleret af Notch signalering variere fra celletype. I tilfælde af osteoklastpræcursorer, den mest fremherskende gen opreguleret af Jagged1 er Hes1, selvom Hey2 og Myc er moderat opreguleres, samt. Angivelse af andre Notch target gener såsom Hey1 og p21 er ikke signifikant ændret ved Jagged1 stimulering af osteoklastpræcursorer.
Når osteoklastpræcursorer dyrkes i plader med 24 brønde, behandling med perler overtrukket med så lidt som 600 ng Jagged1-Fc påvise en signifikant stigning i Hes1 ekspression inden for 24 timer (figur 3). Otteogfyrre timer behandlinger viser en lignende stigning i Hes1 ekspression, om end i mindre grad.
Figur 1: Kultur og differentiering af osteoklastpræcursorer. (A)Naive osteoklastpræcursorer dyrket med 35 ng / ml MCSF og uden aktivering stimuli har en glat, spindelformet morfologi. Scale bar = 25 um. (B) Ved immunologisk aktivering, osteoklastpræcursorer vedtage en flad, skum-fyldt morfologi og vil ikke differentierer til osteoklaster. For at inducere aktivering blev osteoklastpræcursorer behandlet med 10 ng / ml lipopolysaccharid i 16 timer. Scale bar = 25 um. (C) immunologisk naive adhærente osteoklastpræcursorer dyrket med 35 ng / ml MCSF og 100 ng / ml for 3 dage differentierer til modne osteoklaster. Modne osteoklaster er store, multinuclear, og TRAP-positive. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opregulering af Notch målgener i osteoklastpræcursorer udpladet på immobiliseret Jagged1-Fc. Osteoklastpræcursorer blev udpladet på immobiliseret Jagged1-Fc og dyrket i 24 timer. Under dyrkningsperioden, blev ekspression Hes1, Hey2, og Myc mRNA steget. Andre Notch målgener, Hey1 og p21 blev ikke ændret. Fejlsøjler er standard afvigelse på middelværdi, signifikans blev vurderet ved anvendelse studerendes 1-halet t-test. *, P <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opregulering af Hes1 mRNA i osteoklastpræcursorer behandlet med Jagged1-Fc-perler. 600 ng Jagged-Fc bundet til protein G agaroseperler opregulerer Hes1 ekspression i osteoklastpræcursorer dyrket i brønden i en plade med 24 brøndeinden for 24 timer for eksponering. Hes1 induktion ved Jagged1-beads var sammenlignelig med Hes1 niveauer induceret af Jagged1-Fc-overtrukne plader. Andre Notch målgener, som ikke blev kraftigt induceret af Jagged1-Fc-overtrukne plader blev ikke vurderet. Fejlsøjler er standard afvigelse på middelværdi, signifikans blev vurderet ved anvendelse studerendes 1-halet t-test. *, P <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Kultur og in vitro differentiering af osteoklastpræcursorer giver et nyttigt udgangspunkt for undersøgelse af molekylære mekanismer for osteoklastogenese og identifikation af terapeutiske mål for knogleregenerering og bevarelse af knoglemasse. Når dyrkning mus osteoklastpræcursorer, det mest kritiske element er vedligeholdelse af prækursorer i en naiv tilstand. Som makrofag-lignende celler, der osteoklastpræcursorer primet til at reagere på bakterielle komponenter og pro-inflammatoriske cytokiner. Ved aktivering vil osteoklastpræcursorer ikke længere effektivt differentierer til osteoklaster. Den primære årsag til precursor aktivering er tilstedeværelsen af inflammatoriske cytokiner, såsom TNFa eller forkert inaktiveret komplement i føtalt bovint serum. Derfor skal sera partier testes for deres evne til at understøtte osteoklastogenese inden anvendelse i forsøgene. Derudover alle sera anvendt i osteocsidste forløber kultur skal varme inaktiveret at denaturere komplement, der kan aktivere osteoklastpræcursorer.
Ændringer og fejlfinding
Ved denne fremgangsmåde er Jagged1-Fc bruges til at stimulere Notch signalering i osteoklastpræcursorer. Fc fusion med Jagged1 letter både immobilisering på kultur overflader med anti-Fc antistoffer og kobling til protein G-perler. Andre Notch-ligander fusioneret til Fc, såsom Delta-like1-Fc, kan anvendes på en lignende måde. Det skal bemærkes, at ikke alle leverandører giver udsagn af rekombinant Notch-ligand-aktivitet. Derfor, mens der kan opnås rekombinante Notch-ligander fra flere leverandører, der skal sørges for at opnå biologisk aktivitet oplysninger fra leverandøren eller test af ligander i kendte Notch ligand-responsive celler bør udføres.
Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i denne metode giver mulighed for konstitutiv og midlertidig stimulering af Notch tegnaling i dyrkede osteoklastpræcursorer. Standarden metode til påvisning aktivering af Notch signalering er kvantificering af Notch målgener via kvantitativ reverse-transskription PCR (RT-qPCR). Målgener opreguleres ved Notch signalering variere fra celle, så når Notch stimulation udføres på en tidligere ukarakteriseret celletype, udtryk for et panel af kanoniske Notch målgener som medlemmer af Hes og Hey familie af transkriptionsfaktorer bør fastlægges. I en kortere tidshorisont, kan Notch aktivering potentielt blive opdaget via Western blot vurdering af Notch intracellulære domæne (NiCd). der skal sørges imidlertid, da der er fire Notch receptorer og NICDs fra de forskellige receptorer i forskellige celletyper ikke frigives i samme grad efter ligandstimulering. NICD niveau i Notch-stimulerede celler bør også sammenlignes med niveauerne i ikke-stimulerede celler til udgør baseline NICD udgivelse.
Begrænsninger af teknikken Selv om denne fremgangsmåde er teoretisk gælder for alle Notch-ligander, til dato har det kun været konsekvent bruger Jagged1 og Delta-like1 10, 20, 21. Yderligere testning vil være forpligtet til at afgøre, om yderligere Notch ligander er egnede til denne metode. Denne metode er også uspecifik i sin Notch receptoraktivering; er nødvendig vurdering af specifik Notch receptor-aktivering efter stimulering ved hjælp af denne metode til at tilskrive cellulære reaktioner på bestemte Notch receptorer.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Osteoklastdifferentiering er afhængig op på både osteoklast precursor nummer og osteoklast precursor differentiering potentiale. Evaluering af osteoklastdifferentiering af blandede knoglemarv befolkninger kan ikke skelne mellem ændringer i osteoclast PRECursor antal og celleautonom differentiering potentiale. Berigelse af osteoklastpræcursorer før differentiering kontrol for forskelle i prækursorer tal, og giver mulighed for tættere forhør af osteoklastdifferentiering processen. I betragtning af at Notch signalering udøver forskellige effekter på forskellige tidspunkter under osteoklastogenese, tidsmæssig styring af både Notch signalering og osteoklastdifferentiering er afgørende for en ordentlig undersøgelse af de molekylære veje den regulerer.
Fremtidige applikationer efter mastering denne teknik
Ved anvendelse af denne protokol, kan udføres vurdering af roller for Notch signalering ikke kun i osteoklastpræcursorer, men potentielt også i andre celletyper, så godt. Ved at variere længden af Notch stimulering og tidspunkt for Notch signalering initiering, kan defineres potentielle multi-fasiske roller Notch signalering i en række cellulære proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
