Abstract
नमूना तैयार इष्टतम का पता लगाने और मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) प्रयोगों में analytes के दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है। उचित प्रोटोकॉल का निर्धारण नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान पालन करने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में हर कदम ब्याज की analytes की अद्वितीय विशेषताओं के साथ पालन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया केवल एक संगत मैट्रिक्स है कि desorb और कुशलता से ब्याज के अणुओं योण सकते हैं खोजने नहीं शामिल है, लेकिन यह भी उचित मैट्रिक्स बयान तकनीक का चयन। उदाहरण के लिए, एक गीला मैट्रिक्स बयान तकनीक है, जो विलायक में एक मैट्रिक्स भंग जरूरत पर जोर देता है, सबसे अधिक प्रोटीन और पेप्टाइड्स के desorption के लिए बेहतर है, जबकि सूखी मैट्रिक्स बयान तकनीक लिपिड के आयनीकरण लिए विशेष रूप से प्रभावी हैं। उच्च बनाने की क्रिया homogenei के कारण MALDI आईएमएस द्वारा ऊतकों में लिपिड का पता लगाने के लिए सूखी मैट्रिक्स बयान के एक अत्यंत कुशल पद्धति के रूप में सूचित किया गया हैमैट्रिक्स क्रिस्टल बयान और कम से कम analyte delocalization की Ty कई गीला बयान तरीकों 1, 2 की तुलना में। मोटे तौर पर, यह नमूने एक ठंडी सतह के खिलाफ दबाया के साथ एक निर्वात सील कक्ष में एक नमूना और पाउडर मैट्रिक्स रखने शामिल है। तंत्र तो, एक गर्म स्नान (रेत या तेल) में उतारा कूल्ड ऊतक का नमूना की सतह पर पाउडर मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया में जिसके परिणामस्वरूप है। यहाँ हम पता लगाने और MALDI आईएमएस का उपयोग कर चूहे के मस्तिष्क में gangliosides के दृश्य के लिए 1,5-diaminonaphthalene (दान) मैट्रिक्स का उपयोग कर एक उच्च बनाने की क्रिया प्रोटोकॉल का वर्णन।
Introduction
मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) बनता जा रहा है एक अत्यधिक मांग के पार बरकरार नमूना सतहों लिपिड, पेप्टाइड्स और प्रोटीन के स्थानिक वितरण के दृश्य के लिए तकनीक के बाद। MALDI आईएमएस पहले पूर्व शुद्ध analytes के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक के रूप में जाना जाता था, लेकिन हाल के वर्षों में, यह क्योंकि बिना उच्च संकल्प दृश्य / शारीरिक संदर्भ अंक के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सटीकता गठबंधन करने की क्षमता के कई अन्य विषयों में ध्यान आकर्षित किया गया है किसी भी बाहरी लेबलिंग के लिए की जरूरत है। इस तकनीक के उपयोग के शोधकर्ताओं के वैज्ञानिक पूल विकसित करने के लिए जारी है, वहां विकास और आईएमएस प्रयोगों के अनुकूलन में सहायता करने के लिए मानकीकृत, आसान करने के लिए अनुवर्ती प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत बढ़ जाती है। Gangliosides, झिल्ली लिपिड केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अत्यधिक प्रचुर मात्रा का एक समूह है, उनके स्थान, झिल्ली के भीतर एम्बेडेड के रूप में MALDI आईएमएस प्रयोगों के लिए आदर्श होते हैं, कुछ विशिष्ट बनाता हैपारंपरिक इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग कर पता लगाने के लिए असंभव तों। इसके अतिरिक्त, हम पता चला है, MALDI आईएमएस का उपयोग कर, कि इन लिपिड, जो सेल संकेत के रूप में कार्य modulators, अन्य बातों के अलावा, स्वस्थ मस्तिष्क कृंतक कि मस्तिष्क की चोट के 3, 4, 5 के बाद बदल रहे हैं आप में अनूठा शारीरिक वितरण पैटर्न है। Gangliosides सबसे लिपिड प्रजातियों की तुलना में एक उच्च बड़े पैमाने पर सीमा पर स्थित है, और इस प्रकार MALDI इमेजिंग मंच करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
चित्रा 1: MALDI आईएमएस प्रयोग की कार्यप्रवाह। उच्च बनाने की क्रिया का उपयोग कर एक MALDI आईएमएस प्रयोग के सामान्य कार्यप्रवाह का आरेख। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतक एक cryostat में sectioned है और 10 माइक्रोन वर्गों पिघलना प्रवाहकीय आईटीओ स्लाइड पर मुहिम शुरू कर रहे हैं। स्लाइड तो उच्च बनाने की क्रिया जब तक Desiccator में रखा गया है। SLIdes बनाने की क्रिया तंत्र में डाला जाता है और एक भी मैट्रिक्स की परत ऊतक का नमूना की सतह के लिए लागू किया जाता है। नमूने एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर तो 10 मिनट के लिए एक desiccator में रखा में रात भर जमे हुए हैं। एक बार मानकों लागू किया गया है, नमूने जहां एक लेजर ऊतक मैट्रिक्स योण बनाना में desorbed अणुओं के कारण भर में निर्देश दिया है MALDI साधन में डाला जाता है। आयनों एक उड़ान ट्यूब और अलग उनके द्रव्यमान (समय की उड़ान / TOF) के आधार पर जब तक वे डिटेक्टर तक पहुँचने के नीचे यात्रा करते हैं। एक पूर्व निर्धारित बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी (मी / z) सीमा के भीतर analytes की आयनिक बहुतायत के बारे में जानकारी दोनों एक आणविक छवि और जन स्पेक्ट्रम के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। इस डेटा दोनों कल्पना और imaged ऊतक के भीतर ब्याज की analyte की आयनिक बहुतायत मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नमूना तैयार करनाMALDI आईएमएस के लिए अत्यधिक चर के रूप में प्रक्रिया के प्रत्येक चरण ब्याज की analytes करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। MALDI आधारित प्रयोगों के निर्णायक सुविधा एक मैट्रिक्स कोटिंग नमूना की सतह विश्लेषण करने से पहले पर जमा का उपयोग है। अवशोषित और पृथक प्रक्रिया के दौरान लेजर से विकिरण ऊर्जा के हस्तांतरण की भूमिका के अलावा, मैट्रिक्स भी नमूने से विभिन्न analytes को अलग-थलग करने की है, जिससे ब्याज 6, 7 के यौगिकों के विश्लेषण की सुविधा में कार्य करता है। नमूना की सतह के लिए मैट्रिक्स के समरूप आवेदन नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। अनुचित मैट्रिक्स बयान बड़ी विषम मैट्रिक्स क्रिस्टल संरचनाओं और कलाकृतियों के विकास, कम आयन संकेत है, और गरीब reproducibility 7 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
कर सकते हैं कारण कुछ matrices की आत्मीयता विशिष्ट analytes को अलग करने के लिए, मैट्रिक्स के प्रकार के एक प्रयोग के लिए चुनाकाफी परिणाम बदल। प्रोटीन और पेप्टाइड्स की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया matrices अक्सर इमेजिंग लिपिड के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से अलग है और इस प्रक्रिया आगे इस तरह के आदेश को सफलतापूर्वक ऊतक से संकेतों का पता लगाने के लिए कपड़े धोने और पुनर्जलीकरण कदम के रूप में अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए जरूरत से जटिल है। हालांकि धोने कदम लिपिड संकेतों 8 को बढ़ाने के लिए मौजूद हैं, वे सबसे लिपिड प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक शर्त नहीं हैं। जब एक लिपिड इमेजिंग प्रयोग के लिए एक मैट्रिक्स का चयन, यह इस रूप में ब्याज की लिपिड के polarity विचार करने के लिए उपयुक्त matrices की सीमा संकीर्ण जाएगा महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, gangliosides सियालिक एसिड के अवशेष है जो उन्हें एक समग्र नकारात्मक polarity देने होते हैं। प्रभावी ढंग से desorb और ऊतकों से gangliosides योण सकते हैं कि matrices के एक नंबर रहे हैं; हालांकि, इस तरह के स्पेक्ट्रम और वैक्यूम के अंतर्गत मैट्रिक्स की स्थिरता में मैट्रिक्स व्युत्पन्न चोटियों के रूप में कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। 1,5-diaminonapthalene (डीएक) मैट्रिक्स इमेजिंग अनुप्रयोगों के बहुमत के लिए साधन निर्वात की स्थिति के तहत पर्याप्त रूप से स्थिर है और लिपिड desorption के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन किया है और दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड 2 में लिपिड के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दान मैट्रिक्स, जब इस तरह के dihydroxybenzoic एसिड (DHB), 9-aminoacridine (9-एए), और 5-क्लोरो-2-mercaptobenzothiazole (CMBT) के रूप में अन्य नकारात्मक लिपिड आत्मीयता के matrices की तुलना में सबसे अधिक कुशलता से चूहे के मस्तिष्क से gangliosides desorb करने में सक्षम था नकारात्मक आयन मोड (तैयारी में पांडुलिपि) में ऊतक।
मैट्रिक्स बयान की उचित विधि का चयन बराबर महत्व के मैट्रिक्स में ही चयन करने के लिए है। गीले मैट्रिक्स बयान तरीकों जिसमें ठोस मैट्रिक्स एक कार्बनिक विलायक में भंग कर रहा है, और साँस द्वारा जमा या स्वचालित स्प्रेयर या स्पॉटर, प्रोटीन और पेप्टाइड्स के desorption के लिए विशेष रूप से प्रभावी रूप में तरल नमूना अतिरिक्त के लिए अनुमति देने के लिए व्याप्त हैंयौगिकों और मैट्रिक्स के साथ सह-क्रिस्टलीकरण की ction। इन तकनीकों में भी लिपिड अनुप्रयोगों, analyte delocalization और असमान मैट्रिक्स क्रिस्टल संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि सॉल्वैंट्स में उच्च बहुतायत और लिपिड की घुलनशीलता के कारण आम घटनाओं, विशेष रूप से ऊतक 2, 9 में हैं। क्योंकि लिपिड आसानी से ऊतक से आयनित कर रहे हैं, इस तरह के उच्च बनाने की क्रिया के रूप में सूखी मैट्रिक्स बयान तकनीक, एक सरल, लागत प्रभावी विकल्प स्प्रेयर के लिए इन तकनीकों का दोष के कई circumventing जबकि पेशकश करते हैं। MALDI आईएमएस प्रयोगों में उच्च बनाने की क्रिया की सफलता गीला मैट्रिक्स तकनीक 1, 10 की तुलना में वृद्धि हुई reproducibility के लिए अग्रणी ऐसे माइक्रोक्रिस्टलाइन मैट्रिक्स आकृति विज्ञान जो बाध्यकारी मैट्रिक्स-analyte के लिए सतह क्षेत्र बढ़ जाती है, बढ़ मैट्रिक्स पवित्रता, और समरूप मैट्रिक्स बयान के रूप में सुविधाओं को जिम्मेदार ठहराया है।
उच्च बनाने की क्रिया invoएक ठंडा नमूना की सतह पाउडर मैट्रिक्स ऊतक का नमूना की सतह पर बयान के बाद की गैस चरण संक्रमण के लिए ठोस है, जिसके परिणामस्वरूप तुरंत नीचे वैक्यूम के अंतर्गत एक पाउडर मैट्रिक्स हीटिंग lves। उच्च बनाने की क्रिया के दौरान, मैट्रिक्स बयान ऐसे समय, तापमान और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करने के दबाव के रूप में अलग-अलग कारकों से नियंत्रित किया जा सकता है। एक भी उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग से चयनित मैट्रिक्स के प्रकार, कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, जो निपटान से पहले के आधार पर 5 से 20 मिनट के लिए कहीं भी ले जा सकते हैं। उपकरण स्वचालित स्प्रेयर की कीमत का एक अंश में व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है और आसानी से साफ सफाई और रखरखाव के लिए अलग से लिया जाता है। कम लागत और इस मैट्रिक्स बयान तकनीक के रिश्तेदार सादगी यह शुरुआत या MALDI आईएमएस में लिपिड इमेजिंग अनुप्रयोगों पर विस्तार शोधकर्ताओं के लिए आदर्श बनाते हैं। हालांकि आईएमएस के लिए ऊतकों की उच्च बनाने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल का ब्यौरा जानकारी 11 सूचित किया गया है, कुछ मानकीकृत प्रोटोकॉल डब्ल्यू मौजूदhich बुनियादी नकारात्मक आयन मोड में बड़े पैमाने पर उच्च लिपिड इमेजिंग के लिए एक उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग से बाहर ले जाने, यह मुश्किल व्यापक परीक्षण और त्रुटि के बिना तकनीक स्थापित करने के लिए बनाने के साथ शामिल कार्यप्रवाह पर ध्यान केंद्रित। निम्नलिखित एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उच्च संकल्प इमेजिंग और gangliosides का पता लगाने के लिए चूहे के मस्तिष्क वर्गों पर दान मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया के लिए इस जगह को भरने के लिए लक्ष्य है।
चित्रा 2: बनाने की क्रिया उपकरण। फोटोग्राफ (ए) और उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के योजनाबद्ध आरेख (बी)। वैक्यूम पंप एक ठंडा इथेनॉल के 300 एमएल के साथ भरा फंसाने के लिए रबर टयूबिंग से जुड़ा हुआ है। ठंड जाल तो उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के लिए रबर टयूबिंग से जुड़ा हुआ है। तंत्र के बने पदार्थ के दो अलग-अलग टुकड़ों है कि एक धातु यू के साथ मिलकर संयुक्त सील कर रहे हैं से बना है। sublimator के शीर्ष आधाकंडेनसर जो बर्फ कीचड़ से भर जाता है शामिल हैं। नमूना प्लेट संघनित्र के तल पर टेप है, मोहरबंद ग्लास तंत्र के अंदर। उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के नीचे आधा दान मैट्रिक्स, बाहर फैल समान रूप से नमूना थाली का सामना करना पड़ में शामिल है। उच्च बनाने की क्रिया के दौरान, कांच के उपकरण 140 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक रेत स्नान सीधे नीचे एक गर्म थाली द्वारा पर रखा गया है। तापमान जांच के लिए एक स्थिर प्रयोग के लिए पूर्व निर्धारित तापमान की तुलना में रेत स्नान तापमान की प्रतिक्रिया के माध्यम से उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग के दौरान तापमान को बनाए रखने में मदद करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
सभी पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं वेस्टर्न ओंटारियो के जानवरों की देखभाल समिति (2016-014) विश्वविद्यालय का पालन नीचे वर्णित है।
1. ऊतक तैयारी और सेक्शनिंग
- के रूप में "ताजा जमे हुए निष्कर्षण" (यूके) में जाना एक प्रक्रिया के माध्यम से चूहे से मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें।
- pentobarbital सोडियम की अधिक मात्रा के साथ चूहे euthanize और अंगों में सजगता की निगरानी। एक बार सभी सजगता रह गए हैं, चूहे एक गिलोटिन का उपयोग करने का सिर तोड़।
- ध्यान से खोपड़ी एक छुरी का उपयोग करने से मांसपेशियों और अन्य ऊतकों अलग। मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए, खोपड़ी (रंध्र मैग्नम) के आधार से अग्र भाग के लिए शुरू खोपड़ी को तोड़ने की हड्डी काटने संदंश का प्रयोग करें।
- एक बार मस्तिष्क सामने आ रहा है, इसे ध्यान से एक शल्य चिकित्सा रंग के साथ बाहर निकालना और तुरंत फ़्लैश ठंड के लिए कुचल सूखी बर्फ पर जगह है।
ध्यान दें: मस्तिष्क बहुत निंदनीय होगा। इसलिए, जब चरम देखभाल पर मस्तिष्क रखने के लिए लेसूखी बर्फ। मस्तिष्क कुचल या एक सतह के खिलाफ दबाया जाता है, तो यह अपने आकार में परिवर्तन और उस स्थिति में फ्रीज होगा।
- 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और सूखी बर्फ पर जगह - से ताजा जमे हुए ऊतक (formaldehyde के साथ नहीं perfused या अक्टूबर में एम्बेडेड) निकालें।
- पानी की कई बूँदें एक cryostat धारक हैं और या तो सूखी बर्फ या cryostat फ्रीज पट्टी पर जगह पर रखें। प्रेस ऊतक हल्के से cryostat धारक पर यह फ्रीज और धारण करने के लिए शुरू होता है ऊतक के आधार पर चारों ओर पानी जमा देता है और जब तक यह जगह में एंकर के रूप में। अतिरिक्त पानी आगे धारक पर ऊतक सुरक्षित करने के लिए यदि आवश्यक जोड़ें।
नोट: जल आदेश यौगिकों जो वांछित संकेत का पता लगाने प्रभावित कर सकते हैं के साथ ऊतक के प्रदूषण से बचने के लिए ऊतक बढ़ते के लिए अक्टूबर मीडिया के बजाय प्रयोग किया जाता है। - cryostat में स्थिति ऊतक। वांछित संरचनात्मक स्थान के लिए ऊपर धारा ऊतक। सुनिश्चित करें कि काटने मोटाई 8 के बीच है - 12 माइक्रोन।
नोट: जब सांप्रदायिक cryostat में ऊतक सेक्शनिंगउपकरणों, यह जरूरी है कि इस तरह के ब्लेड, ब्रश, विरोधी रोल सलाखों, और धारकों के रूप में अलग सामग्री यौगिकों embedding के साथ संक्रमण से बचने के क्रम में इस्तेमाल किया जाएगा। cryostat के अंदर भी अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए। - cryostat विरोधी रोल पट्टी का उपयोग करना, धीरे-धीरे खंड ऊतक वर्गों चपटा। छेद या ऊतक पर निशान हो सकता है यदि रोल बार प्लेसमेंट के गलत है या ब्लेड सुस्त है। मंच टुकड़ा करने की क्रिया साफ paintbrushes का उपयोग कर के केंद्र के लिए ऊतक ले जाएँ।
- बढ़ते
- उन्हें cryostat में रखकर जबकि टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा प्रवाहकीय स्लाइड या धातु प्लेट रुक। जब स्लाइड पूरी तरह से जमे हुए है, ध्यान से साफ paintbrushes का उपयोग स्लाइड की प्रवाहकीय सतह पर sectioned ऊतक चलते हैं। एक बार सभी ऊतक वर्गों स्लाइड पर सही ढंग से तैनात कर रहे हैं, स्लाइड के तहत एक उंगली जगह ऊतक विपरीत, और प्रेस जब तक खंड thaws।
नोट: धारा गुना या विगलन प्रक्रिया जब दौरान कर्ल कर सकते हैंइस बढ़ते विधि के प्रयोग से। इस cryostat में स्लाइड रखते हुए जब ऊतक विगलन द्वारा कम किया जा सकता है। इन मुद्दों समस्याग्रस्त हो, तो एक विकल्प है, गर्म माउंट विधि नीचे सूचीबद्ध है। - वैकल्पिक रूप से, एक कमरे के तापमान ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) स्लाइड (या धातु की थाली) ले और हल्के, प्रवाहकीय ओर नीचे टुकड़ा करने की क्रिया मंच सतह पर जमे हुए ऊतक खंड पर नीचे प्रेस। यह समान रूप से थोड़ा कर्लिंग या ऊतक की तह के साथ स्लाइड की सतह पर ऊतक अनुभाग विगलन को बढ़ावा मिलेगा।
नोट: जब इस विधि जो कुछ प्रोटीन और लिपिड का नुकसान हो सकता है का उपयोग करते हुए बढ़ते संघनन अनुभाग नीचे दिखाई दे सकते हैं।
- उन्हें cryostat में रखकर जबकि टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा प्रवाहकीय स्लाइड या धातु प्लेट रुक। जब स्लाइड पूरी तरह से जमे हुए है, ध्यान से साफ paintbrushes का उपयोग स्लाइड की प्रवाहकीय सतह पर sectioned ऊतक चलते हैं। एक बार सभी ऊतक वर्गों स्लाइड पर सही ढंग से तैनात कर रहे हैं, स्लाइड के तहत एक उंगली जगह ऊतक विपरीत, और प्रेस जब तक खंड thaws।
- 10 मिनट - ऊतक के साथ स्लाइड 5 के लिए एक desiccator में रखें।
2. Sublimator उपकरण सेट-अप
ध्यान दें: एक धूआं हुड में इन चरणों का प्रदर्शन।
- एक एल्यूमीनियम कंटेनर में एक रेत स्नान एक गर्म थाली पर जगह एक धातु कैंची उठा पर गर्म थाली के साथ,उचित सतह क्षेत्र (यानी गर्म थाली से बड़ा) का। गर्म थाली पर मुड़ें और 140 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना की।
नोट: दान मैट्रिक्स के लिए गलनांक 187 के बीच है - ° 190 सी। hotplate पर इस तापमान से अधिक नहीं है।- गर्म थाली एक तापमान प्रतिक्रिया जांच के साथ सुसज्जित है, प्रयोग के दौरान रेत के तापमान पर नजर रखने और तापमान स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करें। यह सुविधा विभिन्न उच्च बनाने की क्रिया प्रयोगों भर में प्रयोग reproducibility के साथ सहायता कर सकते हैं।
ध्यान दें: रेत स्नान एक ग्लास कंटेनर के रूप में एक एल्यूमीनियम कंटेनर के भीतर समाहित किया जाना चाहिए उच्च तापमान पर टूट सकता है।
- गर्म थाली एक तापमान प्रतिक्रिया जांच के साथ सुसज्जित है, प्रयोग के दौरान रेत के तापमान पर नजर रखने और तापमान स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करें। यह सुविधा विभिन्न उच्च बनाने की क्रिया प्रयोगों भर में प्रयोग reproducibility के साथ सहायता कर सकते हैं।
- दान मैट्रिक्स के 300 मिलीग्राम बनाने की क्रिया तंत्र के नीचे की सतह पर रखें। तंत्र के केंद्र में मैट्रिक्स की जगह और sublimated जा रहा अनुमानित चौड़ाई और स्लाइड की लंबाई में एक भी परत में फैल गए।
चेतावनी: दान मैट्रिक्स विषैला होता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण पहनने के दस्ताने, मास्क, और सुरक्षा हैसभी समय पर काले चश्मे पाउडर मैट्रिक्स से निपटने है। दान अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए, क्योंकि यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। - प्लेट संघनित्र के नीचे के साथ सीधा संपर्क बनाने के क्रम में तापमान उच्च बनाने की क्रिया के दौरान स्लाइड की पूरी सतह भर में ठंडा करने का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए तंत्र की अंदरूनी सतह पर एक धातु की थाली टेप। वैकल्पिक रूप से, रेत कंडेनसर के नीचे एक सपाट सतह सुनिश्चित करने के लिए।
- टेप थाली के बाहरी किनारों के साथ रखें और भीतरी कांच के बने पदार्थ के पक्ष का पालन करें। टेप प्लेट के नीचे रखा और भीतरी कांच की सतह के नीचे का पालन करता है, तो तापमान वितरण भी नहीं हो सकता है और स्लाइड की सतह भर में असमान वितरण मैट्रिक्स में परिणाम सकता है।
- टेप एक खाली (परीक्षण) टेप फिर से स्लाइड के बाहरी किनारों पर रखा के साथ धातु की थाली की सतह भर तिरछे स्लाइड।
- तंत्र के ऊपर और नीचे के हिस्सों को कनेक्ट, wबीच में एक रबर O- अंगूठी ith एक पूरा मुहर सुनिश्चित करने के लिए।
- एक धातु यू संयुक्त तंत्र के केंद्र के चारों ओर की जगह और दोष कसने तक तंत्र के ऊपर और नीचे आधा कसकर एक साथ सील कर रहे हैं। रेत स्नान ऊपर धातु हे अंगूठी में रखें।
- कुचल बर्फ की एक मुट्ठी भर लो और कंडेनसर में जगह है। कंडेनसर भरें ¼ ठंडे पानी से भरा हुआ आधा करने के लिए बर्फ कीचड़ बनाने के लिए। बर्फ कीचड़ तंत्र के अंदर और बाद में स्लाइड इसका पालन पर धातु की थाली ठंडा हो जाएगा। तापमान के लिए कम से कम 5 मिनट रुको एक स्थिर अवस्था तक पहुँचने के लिए।
- ठंड जाल कंटेनर में इथेनॉल के 300 एमएल डालो और कंटेनर में कांच के बने पदार्थ जगह है। ठंड जाल कंटेनर के तल में इथेनॉल में सूखी बर्फ के 3 छोटे-छोटे टुकड़ों - 2 गिरा। जबकि उत्पादन नहीं करता ठंड जाल इनपुट, एक ग्लास ट्यूब सिलेंडर की तह तक चल रहा है।
- रबर टयूबिंग का उपयोग कर ठंड जाल उत्पादन करने के लिए वैक्यूम पंप कनेक्ट करें। रबर का एक टुकड़ा का प्रयोग करेंट्यूबिंग उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के लिए ठंड जाल इनपुट कनेक्ट करने के लिए। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग कसकर यदि उपलब्ध हो तो धातु clamps का उपयोग कर सुरक्षित है।
- 50 लाख टन - 30 के एक निर्वात देने के लिए वैक्यूम पंप का प्रयोग करें। पंप दबाव संतुलन के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए चलाने की अनुमति दें। उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के यू-अंगूठी पर फैलाया एक बार वैक्यूम पंप तंत्र में कमी आई दबाव की वजह से चालू है फिर से कड़ा किया जा सकता है।
नोट: यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि एक वैक्यूम गेज प्रयोग के दौरान वैक्यूम का दबाव नजर रखने के लिए और व्यवस्था प्रयोगों के बीच उच्चतम संभव reproducibility के लक्ष्य को हासिल करने के लिए दबाव में लीक के लिए परीक्षण करने के लिए पंप के साथ संलग्न किया। हालांकि, ज्यादातर पंपों एक लगातार दबाव बनाए रखने के लिए तैयार कर रहे हैं, इसलिए गेज अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए आवश्यक नहीं हो सकता। इसके अतिरिक्त, वैक्यूम मुहर तेल में मदद करने के लिए वैक्यूम दबाव बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
3. उच्च बनाने की क्रिया
- सुनिश्चित रेत स्नान तापमान stabil है कि140 डिग्री सेल्सियस पर और उस तंत्र से जुड़े सभी ट्यूबिंग के साथ रेत स्नान ऊपर धातु हे अंगूठी में सुरक्षित है और वैक्यूम चालू ized।
- 7 मिनट के लिए टाइमर सेट लेकिन टाइमर शुरू नहीं है। धीरे-धीरे उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के लिए कैंची उठा और रेत स्नान ऊपर उठाने जब तक sublimator के यू-संयुक्त अच्छी तरह से धातु हे अंगूठी से ऊपर है। इस अतिरिक्त स्थान रेत पर तंत्र के समायोजन के लिए अनुमति देता है।
- जल्दी सुनिश्चित करने के लिए कि तंत्र रेत पर समान रूप से बैठा है रेत की सतह पर धीरे sublimator प्रेस, और फिर तुरंत टाइमर शुरू।
- जब सिपाही लगता है, वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं और ध्यान से कैंची उठा जब तक sublimator नहीं रह रेत स्नान को छू रहा है और धातु हे अंगूठी में सुरक्षित रूप से बैठा है कम है।
- धीरे-धीरे तंत्र में दबाव जारी करने के लिए माइक्रो-वेंट वाल्व ढीला। उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के रबर टयूबिंग आसपास धातु दबाना ढीला और धीरे-धीरे ट्यूब ढीला करने के लिए शुरू करते हैं। एक बार आरयूbber ट्यूब थोड़ा ढीला कर दिया गया है, एक तरफ करने के लिए ट्यूब मोड़ अवशिष्ट दबाव से बचने के लिए अनुमति देने के लिए।
- परिवेश के दबाव रिटर्न, ध्यान से उच्च बनाने की क्रिया तंत्र से रबर टयूबिंग निकालें।
- तंत्र के यू-संयुक्त पर दोष ढीला और हटा दें। ध्यान से उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के दो हिस्सों को अलग किया और भीतर का कांच के बने पदार्थ के ऊपर से स्लाइड खींच। स्लाइड की जांच करने मैट्रिक्स वितरण भी इस बात की पुष्टि करने के लिए।
नोट: यदि मैट्रिक्स असमान है, sublimator के तल में पाउडर मैट्रिक्स repositioned किया जा सकता है या sublimator तंत्र अगली स्लाइड के लिए रेत में repositioned किया जा सकता है। उच्च बनाने की क्रिया प्रक्रिया एक ही मैट्रिक्स का उपयोग कर कई बार दोहराया जा सकता है, हालांकि, मैट्रिक्स अंत में दोहराया गर्मी जोखिम और पाउडर की मात्रा से गहरा हो कि इस तरह के उच्च बनाने की क्रिया समय की भरपाई के लिए थोड़ा समायोजित करना होगा कम हो जाएगा होगा। इस कारण से, यह मैट्रिक्स बी की राशि की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हैएनजी स्लाइड्स के बीच मैट्रिक्स बयान में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक प्रयोग के बाद sublimated - वितरण और मैट्रिक्स की राशि sublimated के लिए पर्याप्त है, तो sublimator और दोहराने की धारा 3 के अंदर पर ऊतक के साथ एक नई स्लाइड टेप।
नोट: गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के प्रयोजनों के लिए, sublimated मैट्रिक्स की राशि पहले और उच्च बनाने की क्रिया के बाद स्लाइड वजन और स्लाइड 2 की सतह क्षेत्र के साथ sublimated मैट्रिक्स के वजन को विभाजित करके एक प्रयोग के बाद मापा जा सकता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 4 दशमलव अंक और तराजू के बीच परिवर्तनशीलता से परे सबसे तराजू की परिशुद्धता की कमी के कारण, इन मापों केवल इष्टतम मैट्रिक्स बयान के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा किया जाना चाहिए जब तक कि एक उच्च परिशुद्धता संतुलन प्रयोग किया जाता है क्यूसी की एक पूरी तरह से मात्रात्मक साधन करने का विरोध किया (आंकड़ा देखें 3)।
4. ऊतक भंडारण / पुनर्जलपूरण
- उच्च बनाने की क्रिया के बाद, दुकान एक मोहरबंद कंटेनर या छोटे Cass में स्लाइडमोहरबंद प्लास्टिक की थैली में ette।
- 2 घंटे या रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्लाइड्स सेते हैं।
नोट: जमने की प्रक्रिया के लक्ष्य मैट्रिक्स में ऊतक सामग्री के desorption के लिए एक पुनर्जलीकरण कदम के रूप में कार्य करने के लिए है। जमने की प्रक्रिया भी जब डिग्री सेल्सियस 12 -80 में संग्रहीत अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए लिपिड संकेतों की गिरावट को रोकने के लिए दिखाया गया है। इस कारण से, राशि समय के नमूने फ्रीजर में जमा हो जाती है एक निश्चित डिग्री करने के लिए अलग किया जा सकता है काफी संकेत का पता लगाने में फेरबदल (हमारी प्रयोगशाला में मनाया के रूप में) के बिना प्रयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप। हालांकि, हम मैट्रिक्स के कुछ मलिनकिरण देखा है जब नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर अब से 24 घंटे के लिए जमे हुए हैं। इस प्रकार, हम उस समय से पहले sublimated ऊतक इमेजिंग या अब ऊष्मायन अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक के भंडारण सलाह देते हैं। - 10 मिनट - 5 के लिए एक desiccator में फ्रीजर (और कंटेनर) और जगह से स्लाइड्स निकालें।
5. इमेजिंग और एकnalysis
- desiccator से स्लाइड्स निकालें और साधन मानकों को लागू इमेजिंग के दौरान MALDI साधन की बड़े पैमाने पर सटीकता सुनिश्चित करने के लिए। मानकों के प्रकार इंस्ट्रूमेंटेशन के आधार पर अलग अलग होंगे। मानक आम तौर पर पूरे स्लाइड भर में समान रूप से लागू कर रहे हैं, आसपास के ऊतकों imaged किया जा चित्रा (3 डी)।
- MALDI साधन में स्लाइड डालें और इमेजिंग प्रयोगों के लिए निर्माता के निर्देशों (साधन तरीकों के लिए एक 1000 के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए - 2,000 जन रेंज) का पालन करें। प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 4) एक 70 माइक्रोन रास्टर और 20 शॉट्स / स्पेक्ट्रम (अधिग्रहण समय ~ 2 ज) के साथ reflectron नकारात्मक मोड में अधिग्रहण कर लिया था।
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Representative Results
उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग के पूरा होने पर, कांच के उपकरण के दो हिस्सों, धूआं डाकू और स्लाइड में अलग हो रहे हैं कंडेनसर के लिए टेप, हटाया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। इस बिंदु पर, स्लाइड असमान वितरण मैट्रिक्स और समय, तापमान, या नियुक्ति रेत स्नान में तंत्र के लिए जांच की जानी चाहिए अगली स्लाइड के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक सफल बनाने की क्रिया दान प्रयोग स्लाइड जहां ऊतक की शारीरिक विशेषताओं को स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं और कांच की स्लाइड पर मैट्रिक्स की राशि की सतह के साथ ग्रे / भूरे रंग मैट्रिक्स का एक भी कोटिंग में परिणाम होगा ऊतक पर राशि के समान है (चित्रा 3 बी)। उदाहरण के लिए, अगर बहुत ज्यादा मैट्रिक्स ऊतक पर sublimated कर दिया गया है, मैट्रिक्स की मोटाई ऊतक और केवल सामान्य आकार की सुविधाओं को कवर discernable किया जाएगा। हालांकि, अगर बहुत कम मैट्रिक्स sublimated है, ऊतक हा जाएगास्लाइड (चित्रा 3 सी) के बाकी की तुलना में एक गहरे रंग की उपस्थिति ve। दोनों बहुत ज्यादा है और बहुत कम मैट्रिक्स MALDI साधन में गरीब संकेत में परिणाम होगा। गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए, थॉमस एट अल। स्लाइड पर जमा मैट्रिक्स की राशि तौला और स्लाइड की सतह क्षेत्र से वजन विभाजित। वे दान (110 माइक्रोग्राम / सेमी ²) 2 सहित कई matrices के लिए मैट्रिक्स बयान की एक अधिकतम राशि की सूचना दी। यद्यपि अधिकांश शेष राशि सटीक तरह के परिणाम को दोहराने की जरूरत की कमी है, हम क्यूसी की इस पद्धति का प्रयास किया है; हालांकि, परिवर्तनशीलता के एक उच्च डिग्री के कारण, हम केवल सलाह दे सकते हैं मैट्रिक्स बयान पाया की एक उपयुक्त सीमा बनाम दान मैट्रिक्स के साथ असफल बनाने की क्रिया सफल प्रयोगों जुड़े होने के रूप में साधन में संकेत का पता लगाने के माध्यम से निर्धारित की। नीचे 100 माइक्रोग्राम / सेमी ² के एक मैट्रिक्स माप "बहुत कम 'मैट्रिक्स शर्तों के साथ जुड़े थे, जबकि 140 से ऊपर माइक्रोग्राम / सेमी ² की एक माप था"बहुत ज्यादा" के साथ जुड़े। 100 और 140 माइक्रोग्राम / सेमी ² के बीच मैट्रिक्स बयान दान मैट्रिक्स के साथ इमेजिंग के लिए एक इष्टतम मात्रा में होना पाया गया। औजार मानकों का पता चला आईएमएस संकेतों की बड़े पैमाने पर सटीकता सुनिश्चित करने के ऊतकों के नमूनों के चारों ओर कांच स्लाइड पर लागू किया जाना चाहिए (चित्रा 3 डी)
एक MALDI आईएमएस प्रयोग में, आणविक छवि किसी अज्ञात प्रजाति है कि एक दिया जन रेंज में मौजूद हो सकता है के साथ-साथ ब्याज की analyte के स्थानिक वितरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस प्रयोग में gangliosides की आणविक छवियों ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चूहे के मस्तिष्क (चित्रा 4 ए) के cortical और subcortical क्षेत्रों में कई ganglioside प्रजातियों के संरचनात्मक वितरण दिखाने के लिए मढ़ा गया। मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में gangliosides एक सीरीज प्रजातियों GD1a और GM1 लेकिन यह भी शामिल gangliosides GM2 और GM3 सभी के बीच पाया जा सकता है जो कर रहे हैं1,000-2,000 मी / z जन रेंज, सबसे आम मस्तिष्क लिपिड तुलना में एक उच्च जन रेंज, इन gangliosides स्पेक्ट्रम (चित्रा 4 बी) के साथ की पहचान करने के लिए आसान बना रही है। प्रत्येक ganglioside प्रजातियों में से आयनिक बहुतायत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक ही छवि के भीतर ganglioside प्रजातियों में मतभेद या परिवर्तन अर्द्ध यों। नमूना प्रस्तुत करने में परिवर्तनशीलता की एक निश्चित राशि, आईएमएस में टाला नहीं जा सकता बीच स्कैन तुलना अर्द्ध मात्रात्मक माना जाता है क्योंकि।
चित्रा 3. दान बनाने की क्रिया। चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों पर दान मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया के प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) बनाने की क्रिया के पूरा होने पर, तंत्र के दो हिस्सों को अलग कर रहे हैं और स्लाइड कंडेनसर से निकाल दिया जाता है। (बी) Dan मैट्रिक्स स्लाइड की सतह पर कई चूहे के मस्तिष्क ऊतक वर्गों में समान रूप से फैलता है अत्यधिक रेपर के लिए अनुमति देने के लिएoducible परिणाम (100 के बीच - 150 माइक्रोग्राम / सेमी ²)। (सी) विफल बनाने की क्रिया प्रयोगों जहां बहुत कम मैट्रिक्स (बाएं - <90 माइक्रोग्राम / सेमी ²) या बहुत ज्यादा मैट्रिक्स (सही -> के उदाहरण 150 माइक्रोग्राम / सेमी ²) जमा किया गया था। बहुत कम मैट्रिक्स, analytes की अपर्याप्त desorption में परिणाम है, जबकि बहुत ज्यादा मैट्रिक्स लेजर अधिग्रहण के दौरान ऊतकों को घुसना करने के लिए, कम आयन का पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप की अनुमति नहीं होगी। (डी) चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों को लागू किया दान मैट्रिक्स और अंशांकन मानकों के साथ sublimated वर्गों युक्त स्लाइड इमेजिंग के लिए MALDI साधन में सम्मिलन के लिए तैयार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा चूहे के मस्तिष्क में gangliosides 4. MALDI आईएमएस। representativई MALDI आईएमएस आणविक छवि और दान मैट्रिक्स के साथ बनाने की क्रिया के बाद चूहे के मस्तिष्क में gangliosides की बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम। आणविक की छवि स्पेक्ट्रम मढ़ा में कई ganglioside प्रजातियों में से एक समग्र है और छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मस्तिष्क भर ganglioside प्रजातियों की अनूठी संरचनात्मक वितरण दिखाने के लिए pseudocolored। प्रजाति GM1d18: 1 (लाल, जन ~ 1,547 दा), GM1d20: 1 (हरे, जन ~ 1573 दा), GM3d18: 1 (नीले, जन ~ 1,178 दा), और GM3d20: 1 (चैती, जन ~ 1,207 दा) कर रहे हैं का प्रतिनिधित्व किया। 2,000 जन रेंज - 1,000 के भीतर analytes की जन स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है आयनिक बहुतायत। प्रमुख एक सीरीज gangliosides स्पेक्ट्रम के साथ लेबल रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह काम एक मानकीकृत ऐसे gangliosides के रूप में नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड, MALDI आईएमएस प्रयोगों में, का पता लगाने के लिए ऊतक पर मैट्रिक्स बनाने की क्रिया के प्रोटोकॉल का विवरण। MALDI आईएमएस के लिए नमूना तैयार अत्यधिक परिवर्तनशील है और ब्याज की analyte की अद्वितीय गुण के अनुरूप अनुकूलित किया जाना चाहिए। ऊतक का नमूना की सतह पर मैट्रिक्स के आवेदन आईएमएस में परिणामों की गुणवत्ता के संबंध के साथ नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण पहलू है। विशेष देखभाल जब matrices का चयन, यह सुनिश्चित करना कि मैट्रिक्स ब्याज की analyte साथ संगत है और स्पेक्ट्रम में मैट्रिक्स व्युत्पन्न कलाकृतियों के लिए स्वतंत्र है लिया जाना चाहिए। उच्च बनाने की क्रिया एक सूखी मैट्रिक्स बयान तकनीक है जो ऊतकों पर लिपिड के छोटे delocalization साथ मैट्रिक्स क्रिस्टल एकरूपता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है। विशेष रूप से दान मैट्रिक्स नकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली लिपिड gangliosides कहा जाता है के एक समूह के desorption के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री, चूहे के मस्तिष्क में प्रदर्शन के रूप में दिखातावर्गों, और इमेजिंग अनुप्रयोगों के बहुमत के साथ संगतता के लिए अनुमति देता है, समय की विस्तारित अवधि के लिए वैक्यूम के तहत स्थिर है। दान मैट्रिक्स भी सकारात्मक आरोप लगाया लिपिड प्रजातियों के लिए एक उच्च संबंध रहा है, इस प्रकार MALDI आईएमएस अनुप्रयोगों 2 के लिए इस मैट्रिक्स की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाने की अतिरिक्त लाभ है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि फॉस्फोलिपिड सहित कई लिपिड प्रजातियों, एक साथ पता लगाया जा सकता है जब इस आईएमएस प्रोटोकॉल का उपयोग।
9 अन्य आमतौर पर इस्तेमाल matrices की तुलना के रूप में दान मैट्रिक्स की संपत्तियों की एक पूरी तरह से परीक्षा में पहले से प्रकाशित किया गया है 2। इस अनुच्छेद में, लेखकों दान का उपयोग उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए क्षमता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जांच की अन्य matrices की तुलना में नकारात्मक आयन मोड में दान मैट्रिक्स की वृद्धि की संवेदनशीलता पर प्रकाश डाला। दान मैट्रिक्स नकारात्मक polarity आयनों के लिए उच्चतम समग्र प्रदर्शन है पाया गया था। दिलचस्प बात यह है equa प्रदर्शनlly अच्छी तरह से सकारात्मक polarity आयनों के लिए। अन्य आम matrices जो नकारात्मक polarity आयनों के लिए उच्च आत्मीयता का प्रदर्शन किया है डीएचए, DHB, और 9-एए शामिल हैं। एक मैट्रिक्स के रूप में डीएचए की दक्षता वैक्यूम के अंतर्गत अपनी कम स्थिरता जो यह सबसे इमेजिंग अनुप्रयोगों 2 के लिए अव्यावहारिक है द्वारा सीमित है। DHB मैट्रिक्स 13 की तुलना में नकारात्मक मोड में 950 जन रेंज - 9-एए कम पृष्ठभूमि शोर और 750 में sulfatide संकेतों के प्रदर्शन संवर्धन के उत्पादन के लाभ है। हालांकि DHB सकारात्मक मोड में बहुत प्रभावी होना दिखाया गया है, यह के रूप में दान मैट्रिक्स 2 की तुलना में कम नकारात्मक polarity आयन संकेत अर्जित करता है। DHB 2 की तुलना में - दान मैट्रिक्स भी कम द्रव्यमान रेंज (950 650) में नकारात्मक आयन मोड में वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, यह बताया गया है कि DHB 750 के लिए नकारात्मक आयन मोड दा 2 में महत्वपूर्ण मैट्रिक्स समूहों के रूप में कर सकते हैं।
एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। है, जिसमें जमीन मैट्रिक्स एक ठीक छलनी के माध्यम से पारित कर दिया और नमूना की सतह पर जमा किया जाता है। लेखकों को एक गीला मैट्रिक्स मैनुअल स्प्रे तकनीक के लिए मैट्रिक्स बयान के इस शुष्क विधि तुलना की और पाया कि वे 450 में फॉस्फोलिपिड के लिए तुलनीय संकेत दिया - 1,200 जन रेंज 14। एक अध्ययन में फॉस्फोलिपिड अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक चलनी के साथ दोनों उच्च बनाने की क्रिया और सूखी कोटिंग का इस्तेमाल किया, हालांकि, लेखकों कैसे दो तकनीकों छवि संकल्प या आयन संकेत उपज 15 के संदर्भ में तुलना पर कोई टिप्पणी नहीं की।
आदेश प्रयोज्यता की अधिकतम संभव सीमा सुनिश्चित करने के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक बुनियादी कार्यप्रवाह है कि MALDI आईएमएस के दोनों नए और अधिक विशिष्ट उपयोगकर्ताओं लिपिड इमेजिंग आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देगा था। हालांकि, उच्च बनाने की क्रिया प्रोटोकॉल uniqu को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैप्रयोग के ई परिस्थितियों। उदाहरण के लिए, ठीक मैट्रिक्स क्रिस्टल बनाने की क्रिया द्वारा प्रदान बयान पूर्व कोटिंग स्लाइड्स द्वारा नमूना तैयार करने का आदेश रिवर्स करने का विकल्प / ऊतक बढ़ते से पहले मैट्रिक्स के साथ प्लेटों के लिए अनुमति देता है। मैट्रिक्स अग्रिम में प्रवाहकीय सतह पर sublimated और बाद में उपयोग इस प्रकार कम करने नमूना तैयार करने के लिए समय के बाद सेक्शनिंग जबकि अभी भी लिपिड का पता लगाने के 16, 17 के लिए उच्च संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए एक अंधेरे वातावरण में संग्रहित किया जा सकता है। एक अन्य संशोधन है कि इस प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है लिपिड का पता लगाने के लिए संकेत बढ़ाने के लिए अमोनियम formate 8 के साथ एक 2 मिनट धो रहा है।
हालांकि उच्च बनाने की क्रिया इस तरह के छोटे रूप में सबसे गीला बयान तकनीक, की खामियों के कई नाकाम कर सकते हैं, अधिक समरूप मैट्रिक्स क्रिस्टल बयान 1, analytes की delocalization, और कम लागत में कमी आई स्वचालित स्प्रेयर की तुलना में है, इसलिएमुझे नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में परिवर्तनशीलता अपरिहार्य है। उच्च बनाने की क्रिया के मामले में, वहाँ कई कारक हैं जो एक दूसरे के प्रयोग से मिनट मतभेद और कारण हो सकता है जिसके बाद हमारी प्रयोगशाला में देखा गया है शामिल कर सकते हैं। वहाँ रेत पर उच्च बनाने की क्रिया तंत्र की स्थिति में मतभेद हो सकते हैं। जब कई उच्च बनाने की क्रिया प्रयोगों वापस करने के लिए वापस चल रहा है, रेत स्नान में रेत में अपनी स्थिति जो रेत स्नान के दौरान गर्मी के फैलाव को प्रभावित कर सकते हैं शिफ्ट करने के लिए शुरू कर सकते हैं। उच्च बनाने की क्रिया के प्रत्येक दौर से पहले रेत सपाट भी रेत है कि एक समान तापमान पर लौटने के लिए समय लग सकता है विस्थापित कर दिया गया है के रूप में गर्मी के फैलाव को बदल सकते हैं। उच्च बनाने की क्रिया समय रेत स्नान में रेत स्थानांतरण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए प्रत्येक दौर के बीच थोड़ा समायोजित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक तेल स्नान का उपयोग अधिक समरूप गर्मी फैलाव हो सकता है।
दूसरे, sublimator के तल पर मैट्रिक्स की राशि भिन्न हो सकते हैं। दान मातृएक्स एक clumpy ग्रे रूप दिया है और बड़े समूहों के रूप में करने के लिए एक प्रवृत्ति है। इन समूहों मैन्युअल टूट किया जा सकता है और sublimator के तल में व्यवस्था की है, लेकिन पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है। मैट्रिक्स के बड़े समूहों में लंबा समय लग गर्मी और छोटे टुकड़े जो उच्च बनाने की क्रिया के अंत उत्पाद को प्रभावित कर सकते हैं की तुलना में ऊंचा करने के लिए होगा।
उच्च बनाने की क्रिया तंत्र पर निर्वात उत्पादन एक और महत्वपूर्ण कारक है। अधिकांश sublimators एक भी वैक्यूम उत्पादन पर जो ट्यूबिंग उच्च बनाने की क्रिया के दौरान वैक्यूम पंप से कनेक्ट करने के लिए जुड़ा हुआ है के साथ बना रहे हैं। क्योंकि दबाव तंत्र के उस तरफ विनियमित किया जा रहा है, वहाँ अधिक निर्वात उत्पादन के साथ कंधे पर जमा होने के साथ मैट्रिक्स बयान के एक मामूली असमता हो सकता है। यह कुछ हद तक या तो रेत में तंत्र की स्थिति स्थानांतरण द्वारा, sublimator के तल में मैट्रिक्स की स्थिति, या कंडेनसर पर स्लाइड / प्लेट की स्थिति को बदलने के लिए मुआवजा दिया जा सकता। ये सच हैओआरएस बनाने की क्रिया तकनीक का मुख्य कमियां हैं और इस कारण यह प्रयोगात्मक नमूना चल रहा है तो उस समय इन चर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए समायोजित किया जा सकता से पहले उच्च बनाने की क्रिया प्रक्रिया के माध्यम से एक परीक्षण स्लाइड चलाने के लिए महत्वपूर्ण है।
उच्च बनाने की क्रिया का एक अन्य सूचना दोष यह है कि बड़े पैमाने पर उच्च analytes का पता लगाने के लिए अपर्याप्त analyte निकासी और / या मैट्रिक्स के साथ मिश्रण से सीमित है। उच्च बनाने की क्रिया के बाद एक पुनर्जलीकरण कदम इन उच्च द्रव्यमान analytes बाहर खींच इस मुद्दे को दरकिनार करने में मदद कर सकते हैं। यह आमतौर पर एक आर्द्रता चैम्बर 18 का उपयोग कर हासिल की है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, एक ठंड कदम बनाने की क्रिया है जो एक ही उद्देश्य को प्राप्त करने के बाद जोड़ा गया है। ठंड और बाद विगलन (Desiccator में) नमूने के सम्मिलन से पहले MALDI साधन में नमूना की सतह जबकि तिवारी संरक्षण जो अस्थायी रूप से नमूना rehydrates उच्च द्रव्यमान लिपिड की निकासी के लिए अनुमति देने के लिए पर फार्म के लिए संक्षेपण का कारण बनता हैविश्लेषण 12, 17 के लिए ssue।
कुल मिलाकर, उच्च बनाने की क्रिया MALDI आईएमएस प्रयोगों में लिपिड का पता लगाने के लिए मैट्रिक्स आवेदन की एक बेहद संवेदनशील और लागत प्रभावी तरीका है। दरअसल, हमारे समूह आईएमएस परिणामों में महत्वपूर्ण सुधार देखा गया है जब हम मैट्रिक्स बयान के लिए एक उच्च बनाने की क्रिया विधि 4 के लिए एक एयर स्प्रे विधि 3 का उपयोग करने से स्थानांतरित कर दिया। वर्तमान प्रोटोकॉल लिपिड इमेजिंग आवेदनों की संख्या के लिए उपयुक्त है लेकिन प्रयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
