Abstract
Probenvorbereitung ist der Schlüssel für eine optimale Detektion und Visualisierung von Analyten in Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) Experimenten. Bestimmen des geeigneten Protokolls während der Probenvorbereitungsprozess folgen kann schwierig sein, da jede Stufe optimiert werden, müssen mit den einzigartigen Eigenschaften der Analyten von Interesse entsprechen. Dieser Prozess beinhaltet nicht nur eine kompatible Matrix zu finden, die die Moleküle von Interesse effizient desorbieren und ionisieren kann, sondern auch die entsprechende Matrix Abscheidungstechnik ausgewählt wird. Beispielsweise eine nasse Matrix Abscheidungstechnik, die eine Matrix in einem Lösungsmittel aufgelöst ist, beinhaltet, superior zur Desorption der meisten Proteine und Peptide, während trockene Matrix Abscheidungstechniken besonders wirksam sind für die Ionisation von Lipiden. Sublimation hat sich als hocheffizientes Verfahren zur Trockenmatrixablagerung zum Nachweis von Lipiden in Gewebe durch MALDI IMS aufgrund der homogenei berichtetty der Matrix Kristallablagerung und minimale Analyten Delokalisierung im Vergleich zu vielen Nassabscheidungsverfahren 1, 2. Im weitesten Sinne handelt es mit den Proben gegen eine kalte Oberfläche gepresst in einer vakuumdichten Kammer, die eine Probe und pulverisierten Matrix platzieren. Die Vorrichtung wird dann in ein erwärmtes Bad (Sand oder Öl) gesenkt, was zu Sublimation des pulverförmigen Matrix auf der Probenoberfläche gekühlt Gewebe. Hier beschreiben wir ein Sublimations-Protokoll 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) -Matrix für die Detektion und Darstellung von Gangliosiden in dem Rattenhirn unter Verwendung von MALDI IMS.
Introduction
Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) entwickelt sich zu einem sehr begehrt Technik zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Lipiden, Peptiden und Proteinen in intakten Probenoberflächen. MALDI IMS wurde zuvor als analytische Technik für die vorgereinigten Analyten bekannt, aber in den letzten Jahren hat es sich in vielen anderen Disziplinen wegen der Fähigkeit, die Genauigkeit der Massenspektrometrie zu kombinieren mit einer hohen Auflösung optisch / anatomischer Referenzpunkte ohne das die Aufmerksamkeit müssen für jede externe Kennzeichnung. Da die wissenschaftliche Pool von Forschern diese Technik verwendet wird, weiter zu wachsen ist Bedarf an standardisierten, einfach zu folgen Protokolle erhöht in der Entwicklung und Optimierung von IMS Experimente zu unterstützen. Ganglioside, eine Gruppe von Membranlipiden sehr reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, sind ideal für MALDI IMS Experimente wie ihre Lage in der Membran eingebettet ist, stellt sicher, speziES unmöglich mit konventionellen Immuno-Kennzeichnung zu erkennen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, MALDI IMS verwenden, dass diese Lipide, die als Modulatoren von Zellsignalen funktionieren, unter anderem einzigartige anatomische Verteilungsmuster im gesunden Gehirn von Nagetieren, die 3 nach einer Hirnschädigung verändert, 4, 5. Ganglioside werden mit einer höheren Massenbereich im Vergleich zu den meisten Lipidspezies, und sind daher am meisten geeignet für die MALDI Bildgebungs Plattform befinden.
Abbildung 1: Workflow von MALDI IMS Experiment. Schematische Darstellung des allgemeinen Arbeitsablauf eines MALDI IMS Experiment unter Verwendung von Sublimation. Gewebe bei -80 ° C eingefroren ist in einem Kryostaten geschnitten und 10 & mgr; m Abschnitte sind thaw auf leitfähigen ITO Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wird dann in einem Exsikkator bis zur Sublimation platziert. slides in die Sublimation Vorrichtung eingeführt und eine gleichmäßige Schicht der Matrix ist auf der Gewebeprobenoberfläche aufgetragen. Die Proben werden über Nacht in einem -20 ° C Gefrierschrank eingefroren dann in einem Exsikkator für 10 Minuten gestellt. Sobald Normen angewandt wurden, werden die Proben in das MALDI Instrument eingeführt, wo ein Laser über das Gewebe gerichtet ist, verursacht desorbierten Moleküle in der Matrix zu ionisieren. Die Ionen wandern ein Flugrohr nach unten und getrennt auf der Grundlage ihrer Masse (time-of-flight / TOF), bis sie den Detektor erreichen. Die Informationen über die Ionenfluss von Analyten in einem vorbestimmten Masse-zu-Ladung (m / z) -Bereich wird sowohl als Molekularbild und Massenspektrum angezeigt. Diese Daten können verwendet werden, um sowohl zu visualisieren und die Ionenfluss des Analyten von Interesse innerhalb des abgebildeten Gewebes zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Probenvorbereitungfür MALDI IMS ist sehr variabel, da jeder Schritt des Verfahrens an den Analyten von Interesse angepasst werden müssen. Das bestimmende Merkmal der MALDI-basierten Experimenten ist die Verwendung einer Matrix-Beschichtung auf die Probenoberfläche vor der Analyse abgeschieden. Zusätzlich zu der Rolle zu absorbieren und Strahlungsenergie von dem Laser während des Ablationsprozesses zu übertragen, dient die Matrix auch verschiedene Analyten aus der Probe zu isolieren, wodurch die Analyse der Verbindungen von Interesse zu erleichtern 6, 7. Homogenes Aufbringen der Matrix auf die Probenoberfläche ist der wichtigste Schritt bei der Probenvorbereitung. Eine falsche Matrix Abscheidung kann zu großen heterogenen Matrix Kristallformationen führen und die Entwicklung von Artefakten, niedrige Ionensignal und schlechte Reproduzierbarkeit 7.
Aufgrund der Affinität bestimmter Matrices spezifischen Analyten zu isolieren, kann die Art der Matrix für ein Experiment ausgewähltdeutlich das Ergebnis zu verändern. Die Matrizen verwendet für die Bildgebung von Proteinen und Peptiden unterscheiden sich oft von denen, für die Bildgebung verwendeten Lipide und das Verfahren wird weiter durch die Notwendigkeit für zusätzliche Verfahren, wie Waschen und Rehydratation Schritte, um kompliziert erfolgreich Signale von Gewebe erkennen. Obwohl Waschschritte zur Verbesserung der Lipidsignale existieren 8, sind sie keine Voraussetzung für die Detektion der meisten Lipidspezies. Wenn eine Matrix für eine Lipidbildgebungsexperiment auswählt, ist es wichtig, dass die Polarität des Lipids von Interesse, da dies zu prüfen, wird der Bereich von geeigneten Matrizen renzen. Enthalten beispielsweise Ganglioside Sialinsäurereste, die sie insgesamt eine negative Polarität geben. Es gibt eine Reihe von Matrizen, die effektiv zu desorbieren und zu ionisieren Ganglioside aus Gewebe; jedoch Faktoren wie Matrix abgeleiteten Peaks im Spektrum und Stabilität der Matrix unter Vakuum muß in Betracht gezogen werden. 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) Matrix ist ausreichend stabil , um unter Vakuumbedingungen Instrument für die meisten Abbildungsanwendungen und hat einen hohen Grad an Empfindlichkeit für Lipid Desorption gezeigt und kann sowohl in 2 positive und negative Ionenarten für die Analyse von Lipiden verwendet werden. DAN Matrix, wenn im Vergleich zu anderen negativen Lipid Affinitätsmatrizen wie Dihydroxybenzoesäure (DHB), 9-Aminoacridin (9-AA) und 5-Chloro-2-Mercaptobenzothiazol (CMBT), konnte am effizientesten Gangliosiden aus Rattenhirn desorbieren Gewebe im negativen Ionenmodus (Manuskript in Vorbereitung).
die entsprechende Methode der Matrixablagerung Auswahl von gleicher Bedeutung ist selbst die Matrix zu wählen. Nassmatrixabscheidungsverfahren, wobei die feste Matrix in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird, und durch pneumatische oder automatisierten Sprüher oder spotters abgeschieden sind besonders wirksam für die Desorption von Proteinen und Peptiden als die Flüssigkeit die Probe für zusätzliche zuzulassen permeiertction von Verbindungen und Co-Kristallisation mit der Matrix. Obwohl diese Techniken auch für die Lipid - Anwendungen verwendet werden kann, Analyt Delokalisierung und ungleichmäßige Matrix Kristallformationen sind häufige Vorkommen aufgrund der hohen Menge und Löslichkeit von Lipiden in Lösungsmitteln, insbesondere in Gewebe 2, 9. Weil Lipiden leicht aus Gewebe ionisiert werden, trockene Matrix Abscheidungstechniken, wie Sublimation, bieten eine einfache, kostengünstige Alternative zu Sprüher während viele der Nachteil dieser Techniken zu umgehen. Der Erfolg der Sublimierung in MALDI IMS Experimente auf Merkmale wie mikrokristalline Matrix Morphologie zugeschrieben , die für Matrix-Analyt - Bindung, erhöhte Matrix Reinheit der Oberfläche erhöht, und homogene Matrix Ablagerung zu einer erhöhten Reproduzierbarkeit im Vergleich zu nassen Matrixtechniken , 1, 10.
Sublimation invoLves eine pulverisierte Matrix unter Vakuum unmittelbar unterhalb einer gekühlten Probenoberfläche Heizgas-Phasenübergang des pulverförmigen Matrix, gefolgt von der Abscheidung auf die Gewebeprobenoberfläche in Feststoff zu ergeben. Während der Sublimation, können Matrixablagerung durch Variieren Faktoren wie Zeit, Temperatur und Druck zu liefern hoch reproduzierbare Ergebnisse gesteuert werden. Ein einzelnes Sublimation Experiment kann überall nehmen von 5 bis 20 min in Abhängigkeit von der Art der Matrix ausgewählt wird, die mehrmals vor der Entsorgung wieder eingesetzt werden können. Die Vorrichtung kann zu einem Bruchteil des Preises von automatischen Sprüher im Handel erworben werden und ist leicht auseinander zur Reinigung und Wartung entnommen. Die niedrigen Kosten und die relative Einfachheit dieser Matrix-Abscheidungstechnik machen es für die Forscher ideale Beginn oder die Erweiterung auf Lipid-Imaging-Anwendungen in MALDI IMS. Auch wenn die Informations Protokolle für die Sublimation von Geweben für IMS haben Detaillierung 11 berichtet worden, einige standardisierte Protokolle existieren which konzentrieren sich auf die Basis-Workflow beteiligt mit einer Sublimation Experiment Durchführung für die Bildgebung mit hoher Masse Lipide im Negativ-Ionen-Modus, so dass es schwierig ist, die Technik ohne aufwendige Versuch und Irrtum zu etablieren. Im Folgenden ist ein experimentelles Protokoll, diese Lücke für die Sublimation von DAN Matrix auf Rattenhirnschnitten für hochauflösende Bildgebung und Detektion von Gangliosiden zu füllen Ziel.
Abbildung 2: -Sublimationsapparatur. Fotografie (A) und schematische Darstellung (B) der -Sublimationsapparatur. Die Vakuumpumpe wird durch Gummischlauch in eine Kühlfalle, gefüllt mit 300 ml Ethanol verbunden. Die Kühlfalle wird dann durch Gummischlauch zur Sublimation Vorrichtung verbunden. Die Vorrichtung besteht aus zwei separaten Teilen von Glaswaren, die zusammen mit einem Metall-U-joint abgedichtet sind. Die obere Hälfte des Sublimatorschiffchenenthält den Kondensator, der mit Eisbrei gefüllt ist. Die Probenplatte wird auf den Boden des Kondensators abgeklebt, im Inneren des abgedichteten Glasapparatur. Die untere Hälfte der -Sublimationsapparatur enthält die DAN-Matrix gleichmäßig verteilt die Probenplatte gegenüber. Während der Sublimation wird die Glasapparatur auf einem Sandbad mit einer heißen Platte erhitzt auf 140 ° C gebracht direkt darunter. Der Temperaturfühler trägt, durch Rückkopplung des Sandbad Temperatur im Vergleich zu der voreingestellten Temperatur für das Experiment eine stabile Temperatur während der Sublimation Experiments aufrechtzuerhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
Alle Tier Verfahren für den Umgang unten, um sich an der University of Western Ontario Tierpflege Komitee (2016-014) beschrieben.
1. Gewebepräparation und Sectioning
- Extrahieren Hirngewebe von Ratten durch einen Prozess bekannt als "frisch gefroren Extraction" (FFE).
- Euthanize die Ratte mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium und überwachen Reflexe in den Gliedern. Sobald alle Reflexe aufgehört haben, trennen den Kopf der Ratte eine Guillotine mit.
- Trennen Sie vorsichtig die Muskeln und andere Gewebe aus dem Schädel mit einem Skalpell. Verwenden Knochenschneidezangen den Schädel zu brechen, das Gehirn zu belichten, von der Basis des Schädels (Foramen magnum) mit dem vorderen Teil beginnen.
- Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, es vorsichtig mit einem Spatel chirurgischen aushöhlen und sofort für Flash Einfrieren auf zerstoßenem Trockeneis statt.
HINWEIS: Das Gehirn wird sehr formbar sein. Daher extreme Vorsicht walten, wenn das Gehirn Platzierung aufTrockeneis. Wenn das Gehirn zerdrückt oder gegen eine Oberfläche gedrückt wird, wird er seine Form ändert und in dieser Position fixieren.
- Entfernen Sie frische gefrorene Gewebe (nicht mit Formaldehyd durchbluteten oder in OCT eingebettet) von - 80 ° C Gefrierschrank und auf Trockeneis.
- Legen Sie einige Tropfen Wasser auf einem Kryostat Halter und auf entweder Trockeneis oder Kryostaten freeze bar. Drücken Sie Gewebe leicht auf Kryostaten Halter, wie es beginnt, bis das Wasser gefriert um die Basis des Gewebes und verankert sie an Ort und Stelle zu frieren und zu halten. Fügen Sie zusätzliches Wasser weiter in das Gewebe an der Halterung zu sichern, falls erforderlich.
HINWEIS: Das Wasser wird zur Montage Gewebe, um anstelle der OCT Medien verwendet, um eine Kontamination des Gewebes mit den Verbindungen zu vermeiden, die die Erfassung des gewünschten Signals beeinflussen können. - Position Gewebe in Kryostaten. § Gewebe bis zur gewünschten anatomischen Lage. Stellen Sie sicher, dass die Schnittstärke zwischen 8 - 12 & mgr; m.
HINWEIS: Wenn Gewebe in kommunalen Kryostaten sectioningGeräte, ist es zwingend notwendig, dass getrennte Materialien wie Messer, Bürsten, Stabis und Halter, um eine Kontamination mit Vergussmassen zu vermeiden, verwendet werden. Das Innere des Kryostaten sollte auch gründlich mit Ethanol vor der Verwendung gereinigt werden. - Unter Verwendung des Kryostaten Stabilisator, abgeflachte langsam Abschnitt Gewebeschnitten. Löcher oder Markierungen auf dem Gewebe kann auftreten, wenn der Überrollbügel Platzierung ist falsch oder Klinge ist stumpf. Bewegen Sie das Gewebe in die Mitte des Schneidens Plattform sauber Pinseln verwenden.
- Montage
- Frieren leitfähigen Folien oder Metallplatten, die durch sie in den Kryostaten platziert, während das Schneiden. Wenn der Schlitten vollständig gefroren, vorsichtig das geschnittene Gewebe auf die leitfähige Oberfläche des sauberen Pinseln mit Folie zu gelangen. Sobald alle Gewebeschnitte korrekt auf der Folie positioniert sind, legen Sie einen Finger unter der Folie, gegenüber dem Gewebe, und drücken Sie, bis der Abschnitt auftaut.
HINWEIS: Abschnitte während des Auftauprozeß falten oder rollen kann, wennVerwendung dieses Montageverfahren. Dies kann durch Halten der Folie in dem Kryostaten verringert werden, wenn das Gewebe aufgetaut. Wenn diese Fragen problematisch werden, eine Alternative ist warm Einhängemethode unten aufgeführt. - Alternativ nehmen Sie ein Raumtemperatur Indiumzinnoxid (ITO) Schieber (oder Metallplatte) und leicht auf gefrorenen Gewebeschnitt nach unten auf das Aufschneiden Plattformoberfläche, leitfähige Seite nach unten drücken. Dies wird zu dem Gewebeschnitt Auftauen führen gleichmäßig auf die Oberfläche der Folie mit wenig Kräuseln oder Falten des Gewebes.
HINWEIS: Die Kondensation unter dem Abschnitt auftreten können bei der Montage mit dieser Methode, die zum Verlust bestimmter Proteine und Lipide führen kann.
- Frieren leitfähigen Folien oder Metallplatten, die durch sie in den Kryostaten platziert, während das Schneiden. Wenn der Schlitten vollständig gefroren, vorsichtig das geschnittene Gewebe auf die leitfähige Oberfläche des sauberen Pinseln mit Folie zu gelangen. Sobald alle Gewebeschnitte korrekt auf der Folie positioniert sind, legen Sie einen Finger unter der Folie, gegenüber dem Gewebe, und drücken Sie, bis der Abschnitt auftaut.
- Die Objektträger mit dem Gewebe in einem Exsikkator während 5 - 10 min.
2. Sublimatorschiffchen Gerät Set-up
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einem Abzug.
- Legen Sie ein Sandbad in einem Aluminiumbehälter auf einer heißen Platte, mit der heißen Platte auf einem Metall-Scherenbühnegeeigneter Oberfläche (dh größer als die Kochplatte). Schalten Sie auf der heißen Platte und die Temperatur auf 140 ° C.
HINWEIS: Der Schmelzpunkt für DAN-Matrix ist zwischen 187 bis 190 ° C. Verpassen Sie nicht diese Temperatur auf der Heizplatte nicht überschreiten.- Wenn die heiße Platte mit einer Temperatur-Feedback-Sonde ausgestattet ist, verwenden Sie es Sandtemperatur während des Experiments zu überwachen und Temperaturkonstanz zu gewährleisten. Diese Funktion kann über verschiedene Sublimation Experimente mit dem Experiment Reproduzierbarkeit unterstützen.
HINWEIS: Das Sandbad sollte in einem Aluminiumbehälter als Glasbehälter enthalten sein können, bei hohen Temperaturen zerbrechen.
- Wenn die heiße Platte mit einer Temperatur-Feedback-Sonde ausgestattet ist, verwenden Sie es Sandtemperatur während des Experiments zu überwachen und Temperaturkonstanz zu gewährleisten. Diese Funktion kann über verschiedene Sublimation Experimente mit dem Experiment Reproduzierbarkeit unterstützen.
- Platzieren 300 mg von DAN-Matrix auf der Bodenfläche des -Sublimationsapparatur. Legen Sie die Matrix in der Mitte der Vorrichtung und verteilt in einer gleichmäßigen Schicht in der ungefähren Breite und Länge des Schlittens sublimiert werden.
VORSICHT: DAN-Matrix ist giftig. Daher ist es wichtig, Handschuhe tragen, Masken und SicherheitSchutzbrille zu allen Zeiten, wenn das pulverförmige Matrix Handhabung. DAN sollte im Dunkeln gelagert werden, da sie lichtempfindlich ist. - Band, das eine Metallplatte, auf die innere Oberfläche der Vorrichtung mit der Platte über die gesamte Oberfläche des Objektträgers während der Sublimation Kühl direkten Kontakt mit dem Boden des Kondensators, um sicherzustellen, gleichmäßige Verteilung der Temperatur zu machen. Alternativ Sand der Boden des Kondensators um eine flache Oberfläche zu gewährleisten.
- Legen Sie das Band entlang der äußeren Kanten der Platte und sich an den Seiten des inneren Glaswaren. Wenn das Band unter der Platte angeordnet ist, und haftet an dem Boden der inneren Glasoberfläche kann die Temperaturverteilung nicht gleichmäßig sein und in ungleichmäßigen Matrix Verteilung über die Oberfläche des Objektträgers führen könnte.
- Kleben Sie ein Leerzeichen (Test) gleiten diagonal über die Oberfläche der Metallplatte mit dem Band wieder an den äußeren Rändern des Schlittens platziert.
- Verbinden Sie die oberen und unteren Abschnitte der Vorrichtung, wit einem Gummi-O-Ring in der Mitte eine vollständige Abdichtung zu gewährleisten.
- Legen Sie ein Metall U-Gelenk um die Mitte des Gerätes und ziehen Laster, bis die obere und die untere Hälfte der Vorrichtung sind eng miteinander versiegelt. Legen Sie in den Metall-O-Ring über dem Sandbad.
- Nehmen Sie eine Hand voll zerstoßenes Eis und legen Sie es in den Kondensator. Füllen Kondensator ¼ mit kaltem Wasser auf ½ Eisbrei zu schaffen. Die Eisbrei wird die Metallplatte auf der Innenseite der Vorrichtung kühlen und anschließend den Schieber daran haften. Warten mindestens 5 min für die Temperatur einen stabilen Zustand zu erreichen.
- Gießen Sie 300 ml Ethanol in der Kühlfalle Behälter und legen Sie das Glas in den Behälter. Drop 2 bis 3 kleine Stücke Trockeneis in das Ethanol in der Unterseite des Kühlfalle Behälter. Die Kühlfalle Eingang hat ein Glasrohr mit dem Boden des Zylinders ausgeführt wird, während das Ausgangssignal nicht.
- Schließen Sie die Vakuumpumpe an den Kühlfalle Ausgang Gummischlauch mit. Verwenden Sie ein anderes Stück GummiSchlauch der Kühlfalle Eingang mit dem -Sublimationsapparatur zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch fest Metallklammern verwenden, wenn verfügbar gesichert ist.
- Verwenden Sie die Vakuumpumpe ein Vakuum von 30 zu liefern - 50 mT. Die Pumpe für mindestens 5 min für Druckausgleich auszuführen. Schraubstöcke auf U-Ring der Sublimation Vorrichtung kann wieder festgezogen werden müssen, sobald die Vakuumpumpe aufgrund von vermindertem Druck in die Vorrichtung eingeschaltet wird.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass ein Vakuum-Messgerät an der Pumpe angebracht werden, um den Druck des Vakuums während des Experiments zu überwachen und auf undichte Stellen in Druck zu testen, um die höchstmögliche Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu erreichen. Allerdings sind die meisten Pumpen einen konstanten Druck aufrecht zu erhalten, damit der Sensor möglicherweise nicht für erfahrene Anwender wesentlich sein. Außerdem können Vakuumdichtung Fett verwendet werden, um Vakuumdruck helfen halten.
3. Sublimation
- Stellen Sie sicher, dass das Sandbad Temperatur stabilized bei 140 ° C und daß die Vorrichtung in dem Metall-O-Ring über dem Sandbad mit allen Schlauch verbunden gesichert ist und das Vakuum eingeschaltet.
- Zeitschaltuhr für 7 min, aber nicht Timer starten. Langsam heben auf die -Sublimationsapparatur die Scherenbühne und Sandbad, bis die U-Gelenk des Sublimatorschiffchen deutlich über dem O-Ring-Metall ist. Dieser zusätzliche Platz kann für die Einstellung der Vorrichtung auf dem Sand.
- drücken Sie schnell die Sublimatorschiffchen sanft auf der Sandoberfläche, um sicherzustellen, dass die Vorrichtung gleichmäßig auf dem Sand sitzt, und dann sofort den Timer zu starten.
- Wenn der Timer ertönt, schalten Sie die Vakuumpumpe und vorsichtig absenken die Scherenbühne, bis der Sublimatorschiffchen ausgeschaltet ist nicht mehr das Sandbad zu berühren und sicher in der Metall-O-Ring sitzt.
- Langsam die Mikro-Entlüftungs lösen Ventildruck in der Vorrichtung zu lösen. Lösen Sie die Metallschelle um den Gummischlauch der -Sublimationsapparatur und beginnen langsam das Rohr zu lösen. Sobald die rubber Rohr leicht biegen, um die Röhre zu einer Seite zu ermöglichen, Restdruck entweichen gelockert wurde.
- Bei Umgebungsdruck zurückkehrt, vorsichtig den Gummischlauch von der -Sublimationsapparatur entfernen.
- Lösen Sie die Laster auf der U-Verbindung des Gerätes und zu entfernen. Trennen Sie vorsichtig die beiden Hälften der -Sublimationsapparatur und ziehen Sie die Folie von der Oberseite des inneren Glaswaren aus. Untersuchen Folie zu bestätigen auch Matrix-Verteilung.
HINWEIS: Wenn Matrix uneben ist, kann die pulverförmige Matrix in dem Boden des Sublimators neu positioniert werden, oder der Sublimator Vorrichtung kann für die nächste Folie in den Sand neu positioniert werden. Die Sublimation Vorgang mehrmals wiederholt werden, können die gleiche Matrix, jedoch wird die Matrix wird schließlich dunkler aus wiederholten Wärmebelastung und der Menge an Pulver, verringert sich, dass die Sublimation der Zeit geringfügig angepasst werden müssen kompensiert werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Menge von Matrix bei überwachenng sublimierte nach jedem Experiment Konsistenz in Matrixablagerung zwischen den Folien, um sicherzustellen, - Wenn die Verteilung und Menge der Matrix sublimiert ausreichend ist, kleben Sie eine neue Folie mit Gewebe auf der Innenseite des Sublimatorschiffchen und wiederholen Sie Abschnitt 3.
HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle (QC) Zwecke kann die Menge der Matrix sublimierte nach jedem Experiment gemessen werden , indem die Folie vor und nach der Sublimation Wiege- und das Gewicht der sublimierten Matrix mit der Oberfläche des Schiebers Dividieren 2 sollte beachtet werden , dass aufgrund der mangelnden Präzision der meisten Skalen über vier Dezimalstellen und Variabilität zwischen den Skalen sollten diese Messungen nur einen Leitfaden für die optimale Matrix Ablagerung auf eine voll quantifizierbare Mittel der QC im Gegensatz verwendet werden, sofern nicht ein hoher Präzisionswaage (siehe Abbildung verwendet wird , 3).
4. Tissue Storage / Rehydrierung
- Nach Sublimation, Dias lagern in einem verschlossenen Behälter oder kleine Cassette in verschlossenen Plastikbeutel.
- Inkubieren Dias in -20 ° C Gefrierschrank für 2 Stunden oder über Nacht.
HINWEIS: Das Ziel des Gefriervorgangs ist als Rehydratisierungsschritt für die Desorption von Gewebematerialien in die Matrix zu wirken. Der Gefriervorgang ist auch gezeigt worden für bis zu 1 Woche Abbau von Lipidsignalen zu verhindern , wenn bei -80 ° C 12 gespeichert. Aus diesem Grund wird der Zeit die Menge der Proben in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden kann bis zu einem gewissen Grad variiert werden, um die Bedürfnisse des Experimentators zu entsprechen, ohne Signalerfassungs signifikant zu verändern (wie in unserem Labor beobachtet). Wir haben jedoch eine gewisse Verfärbung der Matrix bemerkt, wenn Proben länger als 24 h bei -20 ° C eingefroren. Daher empfehlen wir die Abbildung der sublimierten Gewebe vor dieser Zeit oder Gewebe bei -80 ° C für längere Inkubationszeiten zu speichern. - Objektträger aus der Gefriertruhe (und Behälter) und in einem Exsikkator 5 - 10 min.
5. Imaging und Analyse
- Die Objektträger aus Exsikkator und gelten Instrument Standards Massengenauigkeit von MALDI Instrument während der Bildgebung zu gewährleisten. Die Art der Standards werden in Abhängigkeit von Instrumentierungs variieren. Standards sind in der Regel gleichmäßig über den gesamten Objektträger, das umgebende Gewebe abgebildet werden (3D) angewendet.
- Legen Sie Abgleiten in MALDI Instrument und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Bildgebung Experimente (Instrumentenverfahren für eine 1000 optimiert werden soll - 2000 Massenbereich). Repräsentative Ergebnis (Abbildung 4) wurde in Reflectron Negativ - Modus mit einer 70 & mgr; m - Raster und 20 Schüsse / Spektrum (Erfassungszeit ~ 2 h) erworben.
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Representative Results
Nach Beendigung der Sublimation Experiment wurden die beiden Hälften der Glasapparatur sind in der Abzugshaube und dem Schieber getrennt ist , zu dem Kondensator abgeklebt, kann (3A) entfernt werden. An dieser Stelle sollte der Schieber für unebene Matrix Verteilung und die Zeit, die Temperatur oder die Platzierung der Vorrichtung in dem Sandbad untersucht werden kann für die nächste Folie angepasst werden. Eine erfolgreiche DAN Sublimation Experiment in eine gleichmäßige Beschichtung von grau / braun Matrix entlang der Oberfläche des Schiebers führt, wo die anatomischen Merkmale des Gewebes deutlich und die Menge der Matrix auf dem Glasobjektträger visualisiert werden, ist ähnlich zu der Menge auf dem Gewebe (3B). Zum Beispiel hat, wenn zu viel Matrix auf dem Gewebe sublimiert wurde, die Dicke der Matrix die Eigenschaften des Gewebes abzudecken und nur die allgemeine Form wird erkennbar sein. Wenn jedoch zu wenig Matrix sublimiert wird, wird das Gewebe have ein dunkleres Aussehen als der Rest des Schiebers (3C). Sowohl zu viel und zu wenig Matrix wird in einem schlechten Signal in der MALDI-Instrument zur Folge haben. Für Zwecke der Qualitätskontrolle, Thomas et al. gewogen, um die Menge der Matrix auf der Folie und das Gewicht dividiert durch die Oberfläche des Schlittens aufgebracht. Sie berichteten , eine optimale Menge an Matrixablagerung für mehrere Matrizen einschließlich DAN (110 ug / cm²) 2. Obwohl die meisten Waagen die Genauigkeit benötigt fehlen solche Ergebnisse zu replizieren, haben wir diese Methode der QC versucht; jedoch aufgrund eines hohen Grad an Variabilität, können wir nur ein geeigneter Bereich der Matrixablagerung raten gefunden mit DAN-Matrix im Vergleich zu erfolglosen Sublimation Experimente erfolgreich in Verbindung gebracht werden, wie durch die Signalerfassung in dem Instrument bestimmt. Eine Matrix Messung von unter 100 & mgr; g / cm² wurde mit "zu wenig" matrix Bedingungen verbunden, während eine Messung von über 140 ug / cm² warim Zusammenhang mit "zu viel". Matrix Ablagerung zwischen 100 und 140 & mgr; g / cm² wurde eine optimale Menge zu sein, für die Bildgebung mit DAN Matrix gefunden. Eichstandards sollten auf dem Glasträger um die Gewebeproben angewendet werden , um die Massengenauigkeit der detektierten Signale IMS (3D) , um sicherzustellen ,
In einem MALDI-IMS-Experiment ermöglicht die molekulare Bild für die Visualisierung der räumlichen Verteilung des Analyten von Interesse zusammen mit irgendwelchen unbekannten Spezies, die in einem bestimmten Massenbereich vorhanden sein können. Die molekularen Bilder von Gangliosiden in diesem Experiment wurden unter Verwendung ImageJ Software überlagert über die kortikalen und subkortikalen Regionen des Rattenhirns (4A) die anatomische Verteilung mehrerer Gangliosid Spezies zu zeigen. Die am häufigsten vorkommende Ganglioside im Gehirn sind die A-Serie Spezies GD1a und GM1 sondern auch Ganglioside GM2 und GM3 enthalten, die alle zwischen der finden1.000-2.000 m / z Massenbereich, eine höhere Massenbereich als häufigste Hirnlipiden, diese Ganglioside machen einfach entlang des Spektrums (4B) zu identifizieren. Die ionische reiches Vorkommen jedes Gangliosid Spezies kann verwendet werden, semi-quantitativ Unterschiede oder Änderungen in Gangliosid Arten innerhalb des gleichen Bildes. Weil eine gewisse Variabilität in der Probenvorbereitung kann nicht in IMS vermieden werden, zwischen Scan Vergleiche gelten semi-quantitative sein.
Abbildung 3. DAN Sublimation. Repräsentative Ergebnisse der Sublimation von DAN Matrix auf Rattenhirngewebe. (A) Nach Beendigung der Sublimation, die beiden Hälften der Vorrichtung getrennt werden und der Objektträger wird aus dem Kondensator entfernt wird . (B) DAN Matrix verteilt sich gleichmäßig über mehrere Rattenhirngewebeschnitten auf der Oberfläche des Schiebers für hoch repr zu ermöglichenoducible Ergebnisse (zwischen 100 bis 150 g / cm²). (C) Beispiele gescheiterter Sublimation Experimenten , bei denen zu wenig Matrix (links - <90 & mgr; g / cm²) oder zu viel Matrix (rechts -> 150 ug / cm²) abgeschieden. Zu wenig Matrix in einer unzureichenden Desorption von Analyten führen, während zu viel Matrix wird nicht der Laser erlauben auf das Gewebe während der Erfassung eindringen, was zu niedrigen Ionennachweis führt. (D) Folie mit Rattenhirngewebeschnitten sublimierte mit DAN - Matrix und Kalibrierungsstandards angelegt ist bereit für die Einführung in MALDI Instrument für die Bildgebung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. MALDI IMS von Gangliosiden in Rattenhirn. representative MALDI IMS Molekular Bild und das Massenspektrum von Gangliosiden in dem Rattengehirn mit DAN Matrix nach Sublimation. Das Molekular Bild ist eine Zusammensetzung von mehreren Gangliosid Spezies im Spektrum überlagert und pseudocolored Bild J Software im gesamten Gehirn die einzigartige anatomische Verteilung von Gangliosid Spezies zu zeigen. Species GM1d18: 1 (rot, Masse ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (grün, Masse ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (blau, Masse ~ 1178 Da) und GM3d20: 1 (aquamarin, Masse ~ 1207 Da) sind repräsentiert. Das Massenspektrum zeigt ionische Fülle von Analyten innerhalb einer 1.000 - 2.000 Massenbereich. Die wichtigsten A-Serie Ganglioside sind entlang des Spektrums markiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Arbeit Details eines standardisierten Protokolls von Matrix Sublimation auf das Gewebe für die Detektion von negativ geladenen Lipiden, wie Ganglioside, in MALDI IMS Experimenten. Probenvorbereitung für MALDI IMS ist sehr variabel und muss angepasst werden, um die einzigartigen Eigenschaften des Analyten von Interesse zu passen. Die Anwendung der Matrix auf die Gewebeprobenoberfläche ist ein wichtiger Aspekt des Probenherstellungsverfahrens im Hinblick auf die Qualität der Ergebnisse in IMS. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn Matrizen ausgewählt, um sicherzustellen, dass die Matrix mit dem Analyten von Interesse vereinbar ist und frei von Matrix abgeleitete Artefakte im Spektrum. Sublimation ist eine trockene Matrix Abscheidungstechnik, die mit wenig Delokalisierung von Lipiden auf das Gewebe einen hohen Grad der Matrixkristall Homogenität liefert. DAN Matrix zeigt insbesondere eine hohe Empfindlichkeit für die Desorption aus einer Gruppe von negativ geladenen Membranlipiden Ganglioside genannt wird, wie im Rattenhirn nachgewiesenAbschnitte und ist für längere Zeiträume unter Vakuum stabil, mit der Mehrzahl der Bilderzeugungsanwendungen für die Kompatibilität ermöglicht. DAN Matrix hat den zusätzlichen Vorteil, auch für positiv geladene Lipidspezies eine hohe Affinität aufweisen, wodurch die Vielseitigkeit dieser Matrix für MALDI IMS - Anwendungen 2 erhöht. Es sollte auch beachtet werden, dass mehrere Lipidspezies, einschließlich Phospholipide, können gleichzeitig erfasst werden, wenn dieses IMS-Protokoll.
Eine gründliche Untersuchung der Eigenschaften von DAN Matrix im Vergleich zu 9 anderen häufig verwendeten Matrizen wurde bereits 2 veröffentlicht. In diesem Artikel heben die Autoren die erhöhte Empfindlichkeit von DAN-Matrix in negativer Ionen-Modus zu den anderen Matrizen sowie die Fähigkeit für hochauflösende Abbildung unter Verwendung DAN sucht verglichen. DAN-Matrix wurde die höchste Gesamtleistung zu haben für negative Polarität Ionen gefunden. Interessanterweise durchgeführt equally gut für positive Polarität Ionen. Andere häufige Matrices, die eine hohe Affinität für negative Polarität Ionen nachgewiesen haben, umfassen DHA, DHB und 9-AA. Die Effizienz von DHA als Matrix zeichnet sich durch seine geringe Stabilität unter Vakuum begrenzt , die für die meisten Bildbearbeitungsanwendungen 2 es unpraktisch macht. 9-AA hat den Vorteil der Herstellung von geringem Hintergrundrauschen und zeigte Anreicherung von Sulfatid Signale im 750-950 Massenbereich in negativen Modus im Vergleich zu DHB - Matrix 13. Obwohl DHB im positiven Modus als sehr wirksam gezeigt hat, ergibt sie niedriger negativer Polarität Ionensignal im Vergleich zu DAN Matrix 2. DAN Matrix zeigte auch eine erhöhte Empfindlichkeit in Negativ - Ionen - Modus im unteren Massenbereich (650-950) im Vergleich zum DHB 2. Zusätzlich wurde berichtet , dass DHB signifikante Matrix Clustern in negativer Ionenmodus bis zu 750 Da 2 bilden kann.
et al. , In der Bodenmatrix wird durch ein feines Sieb und abgeschieden auf die Probenoberfläche geleitet. Die Autoren verglichen diese trockene Methode der Matrix Ablagerung auf einer nassen Matrix manuellen Spritztechnik und festgestellt , dass sie vergleichbare Signal für Phospholipide in der 450 gab - 1200 Massenbereich 14. Eine Studie verwendet , um sowohl Sublimation und Trockenpanade mit einem Sieb Phospholipid - Expression zu untersuchen, aber die Autoren nicht auf äußerte sich, wie die beiden Techniken im Vergleich in Bezug auf die Bildauflösung oder Ionensignalausbeute 15.
Um ein möglichst breites Spektrum der Anwendbarkeit zu gewährleisten, stellte das Protokoll war ein Basis-Workflow, die sowohl neue als auch speziellere Benutzer von MALDI IMS ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse für eine Vielzahl von Lipid-Imaging-Anwendungen zu erreichen. Sublimation Protokolle können jedoch geändert werden, um die uniqu zu treffene Umstände des Experiments. Zum Beispiel erlaubt die feine Matrixkristallabscheidung durch Sublimation für die Option bereitgestellt, um die Reihenfolge der Probenvorbereitung durch Vorbeschichtung Folien / Platten mit der Matrix vor dem Anbringen des Gewebes umzukehren. Die Matrix kann somit für eine spätere Verwendung in einer dunklen Umgebung im Voraus gespeichert auf die leitfähige Oberfläche sublimiert werden reduzierendem Probenvorbereitungszeit post-sectioning während immer noch eine hohe Empfindlichkeit für die Lipid - Detektions 16 aufrechterhalten wird , 17. Eine weitere Modifikation, die an diesem Protokoll vorgenommen werden können , Signal zum Nachweis von Lipiden zu erhöhen ist ein 2 min Waschen mit Ammoniumformiat 8.
Obwohl Sublimation viele der Nachteile der meisten Nassablagerungsverfahren umgehen kann, wie beispielsweise kleinere, homogene Matrix Kristallablagerung 1, verminderte Delokalisierung von Analyten und niedrige Kosten im Vergleich zu automatischen Sprüher, somich Variabilität in der Probenvorbereitung ist nicht zu vermeiden. Im Falle der Sublimation, gibt es mehrere Faktoren, die zu einem anderen winzigen Unterschiede von einem Experiment verursachen und kann folgende umfassen, die in unserem Labor beobachtet. Es kann auf dem Sand Unterschiede in der Position der -Sublimationsapparatur sein. Wenn mehrere Sublimation Experimente laufen Back-to-back, kann der Sand im Sandbad damit beginnen, seine Position zu verschieben, die die Verteilung der Wärme im Sandbad beeinflussen können. Abflachen des Sandes vor jeder Runde der Sublimation ändern kann auch die Dispersion von Wärme als Sand, der verschoben wurde Zeit auf eine einheitliche Temperatur zurückfinden kann. Sublimation Zeit leicht zwischen jeder Runde angepasst werden müssen, kann zum Verschieben Sand im Sandbad zu kompensieren. Alternativ dazu kann die Verwendung eines Ölbades zu homogener Wärmeverteilung führen.
Zweitens kann die Menge der Matrix am Boden des Sublimators variieren. DAN matrix hat einen clumpy graues Aussehen und hat eine Tendenz, große Cluster zu bilden. Diese Cluster können manuell in den Boden des Sublimators aufgebrochen und angeordnet sein, kann aber nicht vollständig beseitigt werden. Große Cluster von Matrix wird länger dauern, zu heizen und zu sublimieren als kleinere Stücke, die das Endprodukt der Sublimation beeinflussen können.
Die Vakuumausgang auf der -Sublimationsapparatur ist ein weiterer kritischer Faktor. Die meisten sublimators sind mit einer einzigen Vakuumausgang hergestellt, auf die Rohrleitung angebracht ist, während der Sublimation der Vakuumpumpe zu verbinden. Da der Druck auf der Seite der Vorrichtung geregelt wird, kann eine geringe Unebenheit der Matrixablagerung sein, mit mehr mit dem Vakuum-Ausgang auf der Seite abgelegt wird. Dies kann etwas entweder durch Verschieben der Position der Vorrichtung in dem Sand kompensiert werden, die Position der Matrix in dem Boden des Sublimators, oder durch auf dem Kondensator die Position des Schlittens / Platte zu verändern. Diese Tatsacheors sind die Hauptnachteile der Sublimationstechnik und aus diesem Grund ist es wichtig, einen Test gleiten durch das Sublimationsverfahren laufen, bevor Versuchsprobe ausgeführt, so dass die Zeit für diese Variablen zu kompensieren, eingestellt werden.
Ein weiterer Nachteil, berichtet der Sublimation ist, dass der Nachweis von höherer Masse Analyten durch unzureichende Analytextraktion begrenzt und / oder Mischen mit Matrix. Ein Rehydrierung Schritt nach der Sublimation kann helfen, diese höheren Masse Analyten herausziehen um dieses Problem zu umgehen. Dies ist typischerweise eine Feuchtigkeitskammer 18 erreicht werden. Jedoch wird in diesem Protokoll wird ein Gefrierschritt nach der Sublimation hinzugefügt, die den gleichen Zweck erfüllt. Das Einfrieren und anschließendes Auftauen (im Exsikkator) der Proben vor dem Einbringen in das MALDI Instrument verursacht Kondensation auf der Oberfläche der Probe zu bilden, die vorübergehend die Probe rehydratisiert zur Extraktion von Lipiden höherer Masse zu ermöglichen, während die Ti-KonservierungsUSGABE für die Analyse 12, 17.
Insgesamt ist Sublimation ein hochempfindliches und kostengünstige Methode der Matrix Anwendung zum Nachweis von Lipiden in MALDI IMS Experimenten. Tatsächlich hat unsere Gruppe wesentliche Verbesserungen an IMS Ergebnisse bemerkt , wenn wir von der Verwendung eines Luft-Sprühverfahren 3 zu einem Sublimationsverfahren 4 für Matrixabscheidung verschoben. Dieses Protokoll ist für eine Reihe von Lipidbildgebungsanwendungen geeignete, aber kann modifiziert werden, um die Bedürfnisse des Experimentators zu entsprechen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
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