Сублимация DAN Матрицы для обнаружения и визуализации ганглиозидов в Rat ткани головного мозга для MALDI масс-спектрометрии изображений

Abstract

Подготовка проб является ключом для оптимального обнаружения и визуализации аналитов в матрично-активированная лазерная десорбция / ионизация (MALDI) визуализации Масс-спектрометрия (IMS) экспериментов. Определение соответствующего протокола, чтобы следовать в течение всего процесса подготовки образца может быть затруднено, поскольку каждый шаг должен быть оптимизирован, чтобы соответствовать уникальным характеристикам аналитов. Этот процесс включает в себя не только найти совместимую матрицу, которая может десорбировать и эффективно ионизировать молекулы, представляющие интерес, но и выбора соответствующего метода осаждения матрицы. Например, мокрый метод осаждения матрицы, которая влечет за собой растворение матрицы в растворителе, превосходит десорбции большинства белков и пептидов, в то время как сухие методы осаждения матрицы являются особенно эффективными для ионизации липидов. Сублимационные сообщалось в качестве высокоэффективного метода сухого осаждения матрицы для обнаружения липидов в ткани путем MALDI IMS в связи с homogeneiти матрицы осаждени кристаллов и минимальным аналита делокализации по сравнению со многими мокрыми способами осаждения ^{1, 2.} В широком смысле, она включает в себя размещение образца и порошкообразный матрицы в камере вакуумной запечатанных с образцами, прижатых холодной поверхности. Затем устройство опускают в нагретую ванну (песок или масло), что приводит к сублимации порошкообразной матрицы на охлажденной поверхности образца ткани. Здесь мы опишем протокол сублимации с использованием матрицы 1,5-диаминонафталин (DAN) для обнаружения и визуализации ганглиозидов в головном мозге крыс с использованием MALDI IMS.

Introduction

Матричный с лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) обработки изображений Масс-спектрометрия (IMS), становится большим спросом техники для визуализации пространственного распределения липидов, белков и пептидов через интактные поверхности образцов. MALDI IMS ранее был известен как аналитический метод для предочищенного аналитов, но в последние годы, было привлечение внимания во многих других дисциплинах, из-за способности сочетать точность масс-спектрометрии с высокой разрешающей способностью визуальных / анатомических ориентиров без потребность в любой внешней маркировки. Как научный пул исследователей, использующих эту технику продолжает расти, наблюдается повышенная потребность в стандартизированных, простых в последующих протоколов для содействия в разработке и оптимизации экспериментов IMS. Ганглиозиды, группа мембранных липидов высоко обильными в центральной нервной системе, идеально подходят для экспериментов MALDI IMS, в качестве местоположения, внедренного внутри мембраны, делает определенную специфичнуюэс невозможно обнаружить с помощью обычного иммуно-маркировки. Кроме того, мы показали, с помощью MALDI IMS, что эти липиды, которые функционируют в качестве модуляторов клеточной сигнализации, помимо всего прочего, имеют уникальные шаблоны анатомического распределения в здоровом мозге грызунов, которые измененном после травмы головного мозга ^{3, 4, 5.} Ганглиозиды расположены на более высоком диапазоне масс по сравнению с большинством видов липидных, и, таким образом, наиболее подходит для платформы MALDI визуализации.

Рисунок 1: Технологическая схема MALDI IMS эксперимента. Схема общего рабочего процесса из эксперимента MALDI IMS с помощью сублимации. Ткань замораживают при температуре -80 ° C подразделен в криостат и 10 мкм секции оттепели смонтированы на токопроводящих ITO слайдами. Ползун не затем помещают в эксикатор до сублимации. Sliдез вставляются в сублимационного аппарата и даже слой матрицы наносят на поверхности образца ткани. Образцы замораживают в течение ночи в морозильной камере C -20 ° затем помещают в эксикатор на 10 мин. После того, как стандарты были применены образцы вставляются в MALDI инструмент, где лазер направлен поперек ткани, вызывая десорбирующихся молекул в матрице ионизировать. Эти ионы движутся вниз полета трубки и отдельной основе их массы (время пролета / TOF), пока они не достигают детектора. Информация о ионном обилие аналитов в пределах заданной массы к заряду (m / z) Диапазон отображается и как молекулярного изображения и масс-спектра. Эти данные могут быть использованы для обоих визуализации и количественного определения ионной обилие интерес аналита в пределах изображаемого ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Базовые приготовлениядля MALDI IMS сильно варьирует, как каждый шаг процесса должен быть настроен на интерес аналитов. Отличительная особенность экспериментов MALDI основе является использование матричного покрытия, нанесенного на поверхность образца до анализа. В дополнение к роли поглощения и передачи энергии излучения от лазера во время процесса абляции, матрица также служит для изоляции различных аналитов из пробы, таким образом , облегчая анализ соединений , представляющих интерес ^{6, 7.} Однородная применение матрицы к поверхности образца является наиболее важным шагом в процессе подготовки образца. Неправильное нанесение матрицы может привести к большим гетерогенными матрица кристаллических образований и развития артефактов, низкий уровень ионного сигнала, и плохой воспроизводимости ^7.

Из-за сродства некоторых матриц для выделения конкретных аналитов, тип матрицы выбран для эксперимента можетсущественно изменить результат. Матрицы, используемые для визуализации белков и пептидов, часто отличаются от тех, которые используются для работы с изображениями и липидов процесс осложняется еще и необходимостью дополнительных процедур, таких как стиральные и регидратации шаги для того, чтобы успешно обнаруживать сигналы от ткани. Несмотря на то, стадии промывания существуют для повышения липидных сигналов ^8, они не являются предпосылкой для обнаружения большинства видов липидов. При выборе матрицы для эксперимента липидный визуализации, важно учитывать полярность липидного интереса, так как это будет сузить диапазон подходящих матриц. Например, ганглиозиды содержат остатки сиаловой кислоты, которые дают им общую отрицательную полярность. Есть целый ряд матриц, которые могут эффективно десорбируют и ионизируют ганглиозидов из ткани; Тем не менее, такие факторы, как матрица полученных пиков в спектре и стабильность матрицы в вакууме должны быть приняты при рассмотрении. 1,5-diaminonapthalene (DМатрица АН) является достаточно стабильным в приборных условиях вакуума для большинства приложений для обработки изображений и продемонстрировал высокую степень чувствительности к липидной десорбцией и могут быть использованы для анализа липидов в положительных и отрицательных мод ионных ^2. матрица DAN, по сравнению с другими матрицами отрицательным сродством липид, такой как дигидроксибензойной кислоты (DHB), 9-аминоакридин (9-АА), и 5-хлор-2-меркаптобензотиазола (CMBT), был в состоянии наиболее эффективно десорбируют ганглиозидов из мозга крысы ткани в режиме отрицательных ионов (рукопись в стадии подготовки).

Выбор соответствующего метода осаждения матрицы имеет равное значение выбору самой матрицы. Мокрые способы осаждения матрицы, в котором твердую матрицу, растворяют в органическом растворителе, и осажденные пневматическим или автоматизированные опрыскиватели или корректировщиков, являются особенно эффективными для десорбции белков и пептидов, как жидкость пропитывает образец, чтобы учесть дополнительныйфикция соединений и совместной кристаллизации с матрицей. Хотя эти методы могут быть также использованы для липидных приложений, аналит делокализации и неравномерным матричных кристаллических образований являются обычным явлением из - за высокой численности и растворимости липидов в растворителях, в частности в ткани ^{2, 9.} Поскольку липиды легко ионизируется из ткани, сухие методы осаждения матрицы, такие как сублимация, предлагают простой и экономически эффективной альтернативой опрыскивателей в обход многих Недостаток этих методов. Успех сублимации в экспериментах MALDI IMS объясняется такими функциями, как морфология микрокристаллическая матрицы , что увеличивает площадь поверхности для матрицы-аналита связывания, повышенной чистоты матрицы и однородного осаждения матрицы приводит к увеличению воспроизводимости по сравнению с мокрыми методами матричных ^{1, 10.}

Сублимация INVOLVES нагрева порошкообразного матрицу под вакуумом непосредственно ниже охлаждаемой поверхности образца, что приводит к твердый газофазовому перехода порошкового матрицы с последующим осаждением на поверхность образца ткани. В процессе возгонки, осаждение матрицы можно регулировать путем изменения факторов, таких как время, температура и давление, чтобы обеспечить высокую воспроизводимость результатов. Один эксперимент сублимации может занять от 5 до 20 мин в зависимости от типа матрицы, выбранной, которые могут быть повторно использованы несколько раз перед утилизацией. Устройство может быть закуплен на долю от стоимости автоматических распылителей и легко демонтирована для очистки и обслуживания. Низкая стоимость и относительная простота этого метода осаждения матрицы делают его идеальным для исследователей начала или расширяющихся на липидный приложений визуализации в MALDI IMS. Хотя информация подробно протоколы для возгонки тканей для IMS было зарегистрировано ^11, несколько стандартизированные протоколы существуют шHICH сосредоточиться на основной рабочий процесс связан с проведением эксперимента сублимации для визуализации больших масс липидов в режиме отрицательных ионов, что делает его трудно установить технику без обширных проб и ошибок. Ниже приведен экспериментальный протокол с целью восполнить этот пробел для сублимации матрицы DAN на участках мозга крыс для изображения с высоким разрешением и обнаружения ганглиозидов.

Рисунок 2: Устройство сублимации. Фотография (А) и схематическое изображение (В) сублимационного аппарата. Вакуумный насос соединен с помощью резиновой трубки к холодной ловушке, заполненной 300 мл этанола. Охлаждаемая ловушка затем соединяется с помощью резиновой трубки к сублимации аппарата. Устройство состоит из двух отдельных частей изделий из стекла, которые герметично соединены вместе с помощью металлического U-соединения. Верхняя половина сублиматорсодержит конденсатор, который заполняется ледяной каше. Образец пластина приклеенный на дно конденсатора, внутри герметизированного стекла аппарата. Нижняя половина сублимации аппарата содержит матрицу DAN, раскинувшийся равномерно сталкивается образец пластины. Во время сублимации, при этом устройство из стекла помещают на песчаную баню, нагретую до 140 ° С с помощью нагревательной плиты непосредственно под ним. Датчик температуры помогает поддерживать стабильную температуру в течение всего эксперимента сублимации через обратную связь температуры песчаной бани по сравнению с заданной температурой для эксперимента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

Все процедуры обработки животных описаны ниже прилипают к университету комитета по уходу за животными Западного Онтарио (2016-014).

1. Подготовка ткани и секционирования

1. Экстракт ткани мозга от крыс посредством процесса, известного как "свежезамороженной Extraction" (FFE).
   1. Эвтаназии крыса с передозировкой пентобарбитала натрия и контролировать рефлексы в конечностях. После того, как все рефлексы перестали, отсечь голову крысы с помощью гильотины.
   2. Тщательно отделить мышцы и другие ткани из черепа с помощью скальпеля. Используйте костные-кусачки, чтобы сломать череп подвергать мозг, начиная от основания черепа (затылочного отверстия) к передней части.
   3. После того, как мозг подвергается, осторожно выкопать это с хирургической шпателем и сразу же место на дробленый сухой лед для флэш-замораживания.
      Примечание: Мозг будет очень пластичным. Поэтому, возьмите крайнюю осторожность при размещении на мозгсухой лед. Если мозг дробят или прижимают к поверхности, она изменит свою форму и заморозить в этом положении.
2. Удалите свежезамороженной ткани (не озарен формальдегида или встроенный в ОСТ) от - 80 ° C морозильника и место на сухом льду.
3. Поместите несколько капель воды на держателе криостата и место на любом сухим льдом или криостата сублимационной бар. Нажмите ткань слегка на держатель криостата, как она начинает замерзать и удерживать, пока вода замерзает вокруг основания ткани и якоря его на месте. Добавьте дополнительную воду для обеспечения дополнительной защиты ткани на держателе, при необходимости.
   Примечание: Вода используется вместо ОКТ сред для крепления ткани, с тем, чтобы избежать загрязнения ткани с соединениями, которые могут повлиять на обнаружение полезного сигнала.
4. Позиция ткани в криостат. Раздел ткани до желаемого анатомического расположения. Убедитесь, что толщина резки составляет от 8 - 12 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При секционирования ткани в коммунальной криостатаустройства, крайне важно, чтобы отдельные материалы, такие как ножи, щетки, стабилизаторы поперечной устойчивости, а также держатели можно использовать для того, чтобы избежать загрязнения с вложением соединений. Внутри криостата также должны быть тщательно очищены этанолом перед использованием.
5. С помощью криостата стабилизирующая штанга, медленно секции сплющенные срезы ткани. Отверстия или маркировка на ткани может произойти, если размещение штанга неправильно или лезвие скучно. Перемещение ткани к центру нарезка платформы с использованием чистой кисточки.
6. монтаж
   1. Замораживание проводящие слайды или металлические пластины, помещая их в криостат в то время как нарезка. Когда слайд полностью заморожена, аккуратно подвигать секционного ткани на проводящую поверхность скольжения с использованием чистых кисточки. После того, как все срезы ткани расположены правильно на слайде, поместите палец под горкой, напротив ткани, и нажмите, пока секция не оттаивает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секции могут сложить или скручиваться во время процесса размораживания когда этос помощью этого метода крепления. Это может быть уменьшено путем поддержания слайд в криостат при оттаивании ткани. Если эти вопросы становятся проблематичными, альтернатива, прогрев крепление метод приведен ниже.
   2. В качестве альтернативы, взять при комнатной температуре оксид индия и олова (ITO), слайд (или металлическая пластина) и слегка надавите на секции замороженной ткани на поверхности нарезания платформы, проводящую стороной вниз. Это приведет к срез ткани оттаивании равномерно на поверхность предметного стекла с небольшим количеством скручены или сложены ткани.
      Примечание: Конденсат может появиться ниже секции при монтаже с использованием этого метода, который может привести к потере некоторых белков и липидов.
7. Поместите слайды с тканью в эксикаторе в течение 5 - 10 мин.

2. Устройство сублиматор Настройка

Примечание: Выполните следующие действия в вытяжном шкафу.

1. Поместите песок ванну в контейнере алюминия на горячей плите, с горячей пластины на металлической ножничный подъемниксоответствующей площади поверхности (т.е. больше , чем горячей плите). Включите горячую плиту и установить температуру до 140 ° C.
   Примечание: Точка плавления для матрицы DAN составляет от 187 - 190 ° C. Не превышать эту температуру на конфорке.
   1. Если нагревательная пластина снабжена датчиком обратной связи по температуре, использовать его для контроля температуры песка в течение всего эксперимента и обеспечить согласованность температуры. Эта функция может помочь с экспериментом воспроизводимости в различных экспериментах сублимации.
      Примечание: Песок ванны должна содержаться в алюминиевом контейнере, в котором стеклянный контейнер может лопнуть при высоких температурах.
2. Поместите 300 мг матрицы DAN на нижнюю поверхность сублимационного аппарата. Поместите матрицу в центре аппарата и разложить ровным слоем в приблизительном ширине и длине ползуна будучи сублимированный.
   ВНИМАНИЕ: матрица DAN является токсичным. Поэтому, важно носить перчатки, маски, и безопасностьочки в любое время при обращении порошкообразный матрицу. DAN следует хранить в темноте, как он чувствителен к свету.
3. Лента металлическую пластину на внутренней поверхности аппарата с пластиной прямого контакта с нижней части конденсатора, с тем, чтобы обеспечить равномерное распределение температуры охлаждения по всей поверхности ползуна в процессе сублимации. В качестве альтернативы, песок в нижней части конденсатора, чтобы обеспечить плоскую поверхность.
   1. Поместите ленту вдоль внешних краев пластины и прилипать к стенкам внутренней стеклянной посуды. Если лента расположена под пластиной и прилипает к нижней части внутренней поверхности стекла, распределение температуры не может быть даже и может привести к неравномерному распределению матрицы по поверхности ползуна.
   2. Лента пустой (тест) скользить по диагонали через поверхность металлической пластины с лентой снова помещены на внешние края слайда.
4. Соединить верхнюю и нижнюю части аппарата, WIth резиновым уплотнительным кольцом круглого сечения в середине, чтобы обеспечить полную герметизацию.
5. Поместите металлический U-образный шов вокруг центра аппарата и затянуть пороками, пока верхняя и нижняя половина аппарата не герметизированы плотно вместе. Место в металлическом уплотнительным кольцом над песчаной бани.
6. Возьмите горсть колотого льда и поместите его в конденсаторе. Заполните конденсатор ¼ до ½ полный холодной водой, чтобы создать ледяную шугу. Лед шуга будет охлаждать металлическую пластину на внутренней стороне аппарата и впоследствии слайде пристали к нему. Подождите, по крайней мере, 5 мин для температуры, чтобы достичь устойчивого состояния.
7. Налейте 300 мл этанола в контейнере охлаждаемой ловушкой и поместить стеклянную посуду в контейнер. Падение с высоты 2 - 3 небольшие кусочки сухого льда в этаноле в нижней части контейнера, охлаждаемой ловушкой. Входной охлаждаемая ловушка имеет стеклянную трубку работает в нижней части цилиндра, в то время как выход этого не делает.
8. Подсоедините вакуумный насос к выходу холодной ловушки с помощью резиновой трубки. Используйте другой кусок резинытрубки для подключения вход холодной ловушки для сублимации аппарата. Убедитесь, что трубка плотно крепится с помощью металлических хомутов если таковые имеются.
9. С помощью вакуумного насоса, чтобы поставить вакуум 30 - 50 мТл. Дайте насосу поработать в течение не менее 5 мин для уравновешивания давления. Тиски на U-кольцо сублимации аппарата, возможно, придется затянуть снова, как только вакуумный насос включается из-за пониженного давления в устройстве.
   Примечание: настоятельно рекомендуется, чтобы вакуумметр быть присоединен к насосу, чтобы контролировать давление вакуума в ходе эксперимента, и, чтобы проверить на наличие утечек в давлении, чтобы достичь максимально возможной воспроизводимости между экспериментами. Тем не менее, большинство насосов предназначены для поддержания постоянного давления, поэтому датчик не может иметь важное значение для опытных пользователей. Кроме того, вакуумное уплотнение смазки могут быть использованы, чтобы помочь поддержать давление вакуума.

3. Сублимация

1. Убедитесь, что температура песка ванны имеет STABILдартизованных при 140 ° C, и что аппарат закреплен в металлическом уплотнительным кольцом над песчаной бани со всей трубкой подключен и вакуум включен.
2. Установите таймер в течение 7 минут, но не начинать таймер. Медленно поднимите ножничный подъемник и песчаную баню до сублимации аппарата, пока U-сустав сублиматор не намного выше металлического уплотнительного кольца. Это дополнительное пространство позволяет регулировать устройства на песке.
   1. Быстро нажмите сублиматора осторожно на поверхности песка, чтобы убедиться, что аппарат сидит равномерно на песке, а затем сразу же запустить таймер.
3. Когда звучит таймер, выключите вакуумный насос и осторожно опустите ножничный подъемник до тех пор, пока сублиматор больше не касаясь песка ванны и надежно сидит в металлическом уплотнительным кольцом круглого сечения.
   1. Медленно ослабьте микро-вентиляционный клапан для сброса давления в аппарате. Ослабьте зажим металла вокруг резиновой трубки сублимации аппарата и начинают медленно ослабить трубу. После того, как руBBER трубка была слегка ослаблен, согнуть трубу в одну сторону, чтобы остаточное давление, чтобы избежать.
   2. Когда возвращается давление окружающей среды, осторожно снимите резиновую трубку от сублимации аппарата.
4. Ослабить пороками на U-соединении устройства и удаления. Аккуратно отделить две половинки сублимации аппарата и снять слайд из верхней части внутренней стеклянной посуды. Проверьте слайд, чтобы подтвердить равномерное распределение матрицы.
   Примечание: Если матрица неравномерна, то порошкообразный матрица в нижней части сублиматор может быть приложена или аппарат сублиматором может быть приложена в песке на следующий слайд. Процесс сублимации может быть повторен несколько раз, используя ту же матрицу, тем не менее, матрица будет в конечном итоге становится темнее от многократного воздействия тепла и количества порошка будет уменьшаться, что время сублимации придется корректировать немного компенсировать. По этой причине важно контролировать количество матрицы Beiнг сублимированный после каждого эксперимента, чтобы обеспечить согласованность матрицы осаждения между слайдами
5. Если распределение и количество матрицы сублимируется достаточно, лента новый слайд с тканью на внутренней стороне сублиматора и повторите Раздел 3.
   Примечание: Для контроля качества (КК) целей, количество матрицы сублимированного может быть измерена после каждого эксперимента путем взвешивания слайд до и после сублимации и деления массы сублимированного матрицы с площадью поверхности ползуна ^2, следует отметить , что из - за недостаточной точности большинства масштабироваться до 4 знаков после запятой и изменчивости между чешуйками, эти измерения должны использоваться только руководство для оптимального осаждения матрицы в отличие от полностью поддающихся количественной оценке средств контроля качества , если не используется высокая точность баланса (см рис 3).

4. Ткань Хранение / Регидратация

1. После того, как сублимация, хранить слайды в герметичном контейнере или небольшой КассEtte в герметичном полиэтиленовом пакете.
2. Инкубируйте слайды в -20 ° C морозильнике в течение 2 часов или на ночь.
   Примечание: Целью процесса замораживания должна действовать в качестве стадии регидратации для десорбцией тканевых материалов в матрицу. Процесс замораживания также было показано , чтобы предотвратить деградацию липидных сигналов до 1 недели при хранении при температуре -80 ° C ^12. По этой причине количество времени пробы сохраняются в морозильной камере может изменяться до некоторой степени, чтобы удовлетворить потребности экспериментатора без существенного изменения обнаружении сигнала (как это наблюдалось в нашей лаборатории). Тем не менее, мы обнаружили, что некоторые изменения цвета матрицы, когда образцы замораживают в течение более 24 ч при температуре от -20 & deg; С. Таким образом, мы рекомендуем получения изображения сублимированной ткани до этого времени или при хранении ткани при температуре -80 ° С в течение более длительных периодов инкубации.
3. Удалить слайды из морозильной камеры (и емкости) и поместите в эксикаторе в течение 5 - 10 мин.

5. формирования изображений инализ

1. Удалить слайды из эксикаторе и применять стандарты инструментом для обеспечения массовой точности MALDI инструмента во время съемки. Тип стандартов будет варьировать в зависимости от измерительных приборов. Стандарты , как правило , наносится равномерно по всей слайде, окружающие ткани , чтобы образ (рис 3D).
2. Вставьте слайд в MALDI инструмента и следовать инструкциям производителя для экспериментов с изображениями (методы прибора должны быть оптимизированы для 1000 - диапазон масс 2000). Представитель результат (рисунок 4) был приобретен в рефлектрон отрицательном режиме с растровыми 70 мкм и 20 кадров / спектра (приобретение время ~ 2 ч).

Representative Results

По окончании эксперимента сублимации, две половинки стеклянного аппарата разделены в вытяжном шкафу и ползуна, приклеенный к конденсатору, может быть удалена (фиг.3А). В этот момент, ползун следует проверить на неравномерного распределения матрицы и времени, температуры или размещения аппарата в песчаную баню, возможно, придется быть отрегулированы для следующего слайда. Успешный DAN сублимации эксперимент приведет к равномерным слоем серого / коричневого матрицы вдоль поверхности скольжения, где анатомические особенности ткани могут быть четко визуализируется, и количество матрицы на предметном стекле аналогична сумме на ткани (фигура 3В). Например, если слишком много матрица была сублимированный на ткани, толщина матрицы будет охватывать особенности ткани и только в общей форме будет различимы. Тем не менее, если слишком мало матрица сублимируется, ткань будет гаве более темный внешний вид , чем остальная часть ползуна (рис 3C). И слишком много и слишком мало матрица может привести к ухудшению сигнала в MALDI инструмента. Для целей контроля качества, Томас и др. взвесили количество матрицы, нанесенной на предметное стекло и разделить массу на площадь поверхности слайда. Они сообщили , оптимальное количество осаждения матрицы для нескольких матриц , включая DAN (110 мкг / см²) ^2. Несмотря на то, что большинство остатков не хватает точности, необходимой для репликации таких результатов, мы попытались этот метод контроля качества; Тем не менее, из-за высокой степени изменчивости, мы можем только посоветовать подходящий диапазон осаждения матрицы установлено, что связано успешным в сравнении неудачных экспериментов сублимации с матрицей DAN, как определено посредством детектирования сигнала в приборе. Измерение матрица ниже 100 мкг / см² было связано с «слишком мало» матричных условиях в то время как измерение выше 140 мкг / см² былоассоциируется с "слишком много". была найдена матрица осаждения от 100 до 140 мкг / см² быть оптимальное количество для получения изображений с матрицей DAN. Калибровочные стандарты должны применяться на предметном стекле вокруг образцов ткани , чтобы обеспечить массовую точность обнаруженных сигналов IMS (рис 3D)

В эксперименте MALDI IMS, молекулярное изображение позволяет для визуализации пространственного распределения интерес аналита вместе с любым неизвестных видов, которые могут присутствовать в данном диапазоне масс. Молекулярные образы ганглиозидов в этом эксперименте были наложены с помощью программного обеспечения ImageJ , чтобы показать анатомическую распределение нескольких видов ганглиозидов поперек корковых и подкорковых областях головного мозга крысы (рис 4 , а ). Наиболее обильные ганглиозидов в мозге являются виды A-серии GD1a и GM1, но и содержат ганглиозиды GM2 и GM3, которые могут быть найдены между1000-2000 м / г диапазон масс, более высокий диапазон масс , чем большинство общих липидов мозга, что делает эти ганглиозиды легко определить по спектру (рис 4В). Ионный обилие каждого вида ганглиозидов могут быть использованы для полу-количественного определения различий или изменений вида ганглиозидов в пределах того же самого изображения. Поскольку определенное количество изменчивости в образце преп нельзя избежать в IMS, между сравнения сканирования считаются полуколичественный.

Рисунок 3. DAN сублимации. Типичные результаты сублимации матрицы DAN на ткани мозга крыс. (А) После завершения сублимации, две половинки аппарата разделены и ползун удаляется из конденсатора. Матрица (В) DAN равномерно распределяется по нескольким срезах ткани головного мозга крысы на поверхности слайда , чтобы обеспечить весьма магнезииoducible результаты (от 100 - 150 мкг / см²). (C) Примеры неудачных экспериментов сублимации , где слишком мало матрица (левая - <90 мкг / см²) (справа или слишком много матрица -> была депонированных 150 мкг / см²). Слишком малое количество матрицы приведет к недостаточной десорбцией аналитов, в то время как слишком много матрица не позволит лазеру проникать в ткани во время захвата, что приводит к низкой регистрации ионов. (D) Slide , содержащие срезы ткани головного мозга крысы сублимированные с матричными и калибровочных стандартов даН готова для введения в MALDI инструмента для работы с изображениями. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. MALDI IMS ганглиозидов в головном мозге крысы. Representativе MALDI IMS молекулярного изображения и масс-спектр ганглиозидов в головном мозге крыс после сублимации с матрицей DAN. Молекулярный изображение представляет собой совокупность нескольких видов ганглиозидных в спектре, обложенных и псевдоцветной с помощью изображения J программного обеспечения, чтобы показать уникальное анатомическое распределение видов ганглиозидных по всему мозгу. Виды GM1d18: 1 (красный, масса ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (зеленый, масса ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (синий, масса ~ 1178 Da) и GM3d20: 1 (зеленовато-голубой, масса ~ 1207 Da) являются представлял. Показывает массовый спектр ионную обилие аналитов в пределах 1000 - 2000 диапазоне масс. Основные A-серии ганглиозидов помечены вдоль спектра. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Эта работа подробно стандартизированный протокол матрицы сублимации на ткани для выявления отрицательно заряженных липидов, таких как ганглиозидов, в опытах MALDI IMS. Подготовка проб для MALDI IMS является очень переменным и должны быть настроены в соответствии с уникальными свойствами анализируемого вещества, представляющего интерес. Применение матрицы на поверхности образца ткани является важным аспектом процесса подготовки образца в отношении качества результатов в IMS. Особое внимание следует уделить при выборе матрицы, гарантируя, что матрица совместима с интерес аналита и свободен от матричных полученных артефактов в спектре. Сублимация представляет собой сухой матрица метод осаждения, которая обеспечивает высокую степень однородности кристаллической матрицы с небольшим количеством делокализации липидов на ткани. матрица DAN, в частности, показывает высокую степень чувствительности к десорбцией группы отрицательно заряженных липидов мембран, называемых ганглиозидов, как показано в мозге крысысекции и стабильна в вакууме в течение длительных периодов времени, что позволяет для обеспечения совместимости с большинством приложений для обработки изображений. Матрица имеет DAN дополнительное преимущество также имеющих высокое сродство к положительно заряженных частиц в липидах, тем самым увеличивая универсальностью этой матрицы для MALDI IMS приложений ^2. Следует также отметить, что несколько липидных видов, в том числе фосфолипиды, могут быть обнаружены одновременно при использовании этого протокола IMS.

Тщательное изучение свойств матрицы DAN по сравнению с 9 другими широко используемыми матрицами ранее опубликованной ^2. В этой статье авторы подчеркивают повышенную чувствительность матрицы DAN в режиме отрицательных ионов по сравнению с другими матрицами исследованных, а также возможности для изображений высокого разрешения с использованием DAN. была найдена матрица DAN иметь самую высокую общую производительность для ионов отрицательной полярности. Интересно, что она выполнена EQUALLY хорошо для положительных ионов полярности. Другие общие матрицы, которые продемонстрировали высокое сродство к ионам отрицательной полярности включают DHA, DHB и 9-AA. Эффективность DHA в качестве матрицы ограничена его низкой стабильностью в вакууме , что делает его непрактичным для большинства применений обработки изображений ^2. 9-AA имеет преимущество производить низкий фоновый шум и продемонстрировал обогащение сульфатида сигналов в 750 - 950 диапазоне массы в отрицательном режиме по сравнению с DHB матрицей ^13. Хотя DHB было показано, что очень эффективно в положительном режиме, она дает более низкую отрицательную полярность ионного сигнала по сравнению с матрицей DAN ^2. Матрица DAN также продемонстрировал повышенную чувствительность в режиме отрицательных ионов в нижнем диапазоне масс (650 - 950) по сравнению с DHB ^2. Кроме того, сообщалось , что DHB могут образовывать значительные скопления матрицы , в отрицательном режиме ионов до 750 Da ^2.

соавт. , В которой матрица заземления пропускают через мелкое сито и осаждается на поверхности образца. Авторы сравнили этот метод сухого осаждения матрицы к влажной матрицы ручной метод распыления и обнаружили , что они дали сопоставимый сигнал для фосфолипидов в 450 - 1200 диапазоне ¹⁴ масс. В одном исследовании использовали как сублимацию и сухого покрытия с помощью сита для изучения фосфолипидов выражение, однако, авторы не стали комментировать , как эти две методики по сравнению с точки зрения разрешения изображения или с выходом ¹⁵ сигналов ионов.

Для того, чтобы обеспечить как можно более широкий диапазон применимости, протокол был представлен базовый технологический процесс, который позволит как новые, так и более специализированные пользователи MALDI IMS для достижения высокой воспроизводимости результатов для широкого спектра применений липидный изображений. Тем не менее, протоколы сублимации может быть изменен, чтобы соответствовать uniquе обстоятельства эксперимента. Например, тонкая матрица осаждение кристаллов при условии, путем сублимации позволяет возможностью изменить порядок подготовки образцов по слайдам предварительного покрытия / пластин с матрицей перед монтажом ткани. Матрица может быть сублимируется на проводящую поверхность заранее и хранить в темном помещении для последующего использования , таким образом , уменьшая время образца препарата после секционирования, сохраняя при этом высокую чувствительность для обнаружения липидов ^{16, 17.} Другая модификация , которая может быть сделано к этому протоколу для усиления сигнала для обнаружения липидов представляет собой 2 мин стирки с формиата аммония ^8.

Хотя сублимация может обойти многие из недостатков большинства мокрых методов осаждения, таких как меньшие, более гомогенную матрицу осаждение кристаллов ^1, снижение делокализации аналитов, а также низкую стоимость по сравнению с автоматизированными опрыскивателей, такмне изменчивость в процессе подготовки образца является неизбежным. В случае сублимации, есть несколько факторов, которые могут вызвать мелкие отличия от одного эксперимента к другому и может включать в себя следующее, которые наблюдались в нашей лаборатории. Там могут быть различия в положении сублимации аппарата на песке. При выполнении нескольких экспериментов сублимации спина к спине, песок в песчаную баню может начать сдвиг своей позиции, которая может повлиять на дисперсию тепла по всей песчаной бане. Сведение песок перед каждым туром сублимации может также изменить дисперсию тепла, как песок, который был смещенным может занять некоторое время, чтобы вернуться к однородной температуры. время сублимации, возможно, придется слегка отрегулировать между каждым раундом, чтобы компенсировать смещение песка в песчаную баню. В качестве альтернативы, использование масляной ванны может привести к более однородной дисперсии тепла.

Во-вторых, количество матрицы в нижней части сублиматора может варьироваться. DAN Матрих имеет глыбовыми серый внешний вид и имеет тенденцию к образованию больших кластеров. Эти кластеры могут быть вручную раздроблен и расположены в нижней части сублиматор, но не может быть полностью устранена. Большие кластеры матрицы потребуется больше времени, чтобы нагреть и сублимировать, чем более мелкие куски, которые могут повлиять на конечный продукт сублимации.

Выход вакуума на сублимации устройства является еще одним важным фактором. Большинство sublimators сделаны с одним выходом вакуумной трубки, на которую крепится, чтобы подключить его к вакуумному насосу в процессе сублимации. Поскольку давление регулируется на той стороне аппарата, может быть небольшая неравномерность осаждения матрицы, с более осаждается на стороне с выходом вакуумного. Это может быть до некоторой степени компенсировать путем сдвига либо положение аппарата в песке, положение матрицы в нижней части сублиматор, или путем изменения положения скользящего / пластины на конденсаторе. Это фактПРС являются основными недостатками метода сублимации и по этой причине крайне важно, чтобы запустить тест слайд через процесс сублимации перед запуском экспериментального образца таким образом, чтобы время можно отрегулировать для компенсации этих переменных.

Другой сообщил недостатком сублимации является то, что обнаружение более высоких массовых аналитов ограничивается недостаточной экстракции анализируемого вещества и / или смешивания с матрицей. Шаг регидратации после сублимации может помочь вытащить эти более высокие массовые аналитов, чтобы обойти эту проблему. Обычно это достигается с помощью влажной камере ^18. Тем не менее, в данном протоколе, стадию замораживания добавляют после возгонки, который достигает той же цели. Замораживание и последующее оттаивание (в эксикаторе) образцов перед введением в MALDI инструмента вызывает образование конденсата на поверхности образца, который временно повторной гидратации образец, чтобы обеспечить добычу более высокой массой липидов при сохранении ЦИСГУП для анализа ^{12, 17.}

В целом, сублимация является очень чувствительным и экономически эффективным методом матричного применения для обнаружения липидов в экспериментах MALDI IMS. Действительно, наша группа отметила значительные улучшения результатов IMS , когда мы перешли от использования метода воздушного распыления ³ к способу сублимационной ⁴ для осаждения матрицы. Настоящий протокол подходит для ряда применений липидный визуализации, но могут быть изменены, чтобы удовлетворить потребности экспериментатора.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sublimator	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix	Sigma-Aldrich	D21200	100 G
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback	Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Stainless Steel Jack	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
Cold Trap			Custom built on site
Vacuum Pump	Franklin Electric	1102180403	Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides	Hudson Surface Technology	PSI 1111000	type II, 1.1 mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument	AB Sciex
Desiccator	Sigma-Aldrich	D2797	tabletop desiccator