Abstract
Örnek hazırlama uygun algılama ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) deneylerde analitlerin görüntülenmesi için bir anahtardır. Her adım, ilgi analitlerin kendine özgü özellikleri olan uygun optimize edilmelidir olarak örnek hazırlama süreci boyunca takip uygun protokolü belirlemek zordur. Bu işlem sadece desorbe ve verimli bir şekilde ilgi konusu moleküllere iyonize bir uyumlu matris bulmak değil, aynı zamanda, uygun hücreler arasında madde birikmesi tekniği seçerek değil içermektedir. Kuru hücreler arasında madde birikmesi teknikleri lipidlerin iyonlaşma için özellikle etkili olan, oysa Örneğin, bir çözücü içinde bir matris eritme gerektirir ıslak matris birikim tekniği, en protein ve peptid desorpsiyonu için üstündür. Süblimasyon bağlı homogenei MALDI IMS ile doku lipidlerin saptanması için, kuru madde birikmesi son derece etkili bir yöntem olarak bildirilmiştirmatris kristal birikimi ve minimal analit yerel olmaktan ty birçok yaş çökelme yöntemleri 1, 2 ile karşılaştırıldığında. Genel olarak, bu soğuk bir yüzey bastırılır örnekleri ile bir vakum sızdırmaz bölme bir örnek ve toz haline getirilmiş bir matris yerleştirilmesini sağlar. Cihaz daha sonra soğutuldu doku örneği yüzeyi üzerine toz halinde matrisin süblimasyon ile sonuçlanan, bir ısıtılmış banyo (kum ya da yağ) içerisine indirilir. Burada MALDI IMS kullanarak sıçan beyninde gangliosidler tespiti ve görselleştirme için 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matris kullanarak bir yüceltme protokol açıklar.
Introduction
Matriks destekli lazer desorpsiyon / İyonizasyon (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) giderek çok aranan bozulmamış numune yüzeyleri boyunca lipidler, peptidler ve proteinlerin mekansal dağılımı görüntülenmesi için tekniği sonra. MALDI IMS önceden önceden saflaştırılmış analitler için analitik tekniği olarak bilinen, ancak son yıllarda, bunun nedeni olmadan yüksek çözünürlüklü görsel / anatomik referans noktaları ile kütle spektrometresi doğruluğunu birleştirmek için yeteneği birçok diğer disiplinlerde dikkat çekmeye başlamıştır herhangi bir harici etiketlenmesi için gereklidir. Bu tekniği kullanan araştırmacıların bilimsel havuz büyümeye devam ettikçe, IMS deneyleri geliştirilmesi ve optimizasyonu yardımcı olmak için standartlaştırılmış, kolay takip protokolleri için ihtiyaç vardır artar. Gangliosidler, merkezi sinir sistemi içinde yüksek miktardaki membran lipidlerinin bir grup, membran içinde gömülü bulundukları yere gibi MALDI IMS deneyleri için idealdir, belirli bir speci yapargeleneksel immüno-etiketlemesi kullanılarak tespit etmek mümkün es. Buna ek olarak, hücre sinyalinin modülatörleri olarak işlev, bu yağlar, başka şeylerin yanı sıra, beyin hasarı 3, 4, 5, değişmiş sağlıklı kemirgen beyin benzersiz bir anatomik dağılımla desenlere sahip olduğunu, MALDI IMS kullanan göstermiştir. Gangliositler en lipit türlere kıyasla daha yüksek bir kütle aralığında bulunan ve böylece MALDI görüntüleme platformu en uygun çözümdür.
Şekil 1: MALDI IMS Deney iş akışı. süblimasyon kullanarak MALDI IMS deney genel iş akışı diyagramı. -80 ° C'de dondurulmuş doku, bir kriyostat bölümlere ve 10 um bölümler çözülme iletken İTO slaytlar üzerine monte edilir. Lam daha sonra süblimasyon kadar desikatör içine yerleştirilir. slides süblimasyon aparatına yerleştirilir ve matris düz bir katman doku örneği yüzeyine uygulanır. Numuneler daha sonra 10 dakika boyunca bir kurutucu içine yerleştirilmiş bir -20 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca dondurulmuştur. standartlar uygulandıktan sonra, numuneler bir lazer iyonize matris içinde desorbe moleküllerin neden doku boyunca yönlendirilir MALDI cihazına yerleştirilir. iyonları onlar dedektöre ulaşana kadar kendi kütlesi (time-of-flight / TOF) dayalı bir uçuş tüp ve ayrı aşağı seyahat. önceden tespit edilmiş bir kütle-yük (m / z) aralığında analit iyonik miktarı hakkında bilgi molekül görüntü ve kütle spektrumu hem de gösterilir. Bu veriler, görselleştirmek ve görüntülü doku içinde ilgili analit iyonik bolluk ölçmek hem de kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
örnek hazırlamasürecinin her adımı ilgi analitlerin özelleştirilebilir gerektiği gibi MALDI IMS çok değişkendir. MALDI-esaslı deneyler tanımlayıcı özelliği, analiz öncesi örnek yüzeyi üzerine biriktirilmiş bir matris kaplamanın kullanılmasıdır. Emici ve ablasyon esnasında lazer radyasyon enerji aktarmak rolüne ek olarak, bir matris ve böylece ilgi 6, 7 bileşiklerinin çözümlenmesini kolaylaştıran, örnek çeşitli analitlerin izole etmek için hizmet eder. Numune yüzeyine matris homojen bir uygulama örnek hazırlama sürecinde en önemli adımdır. Yanlış matris birikimi büyük heterojen matris kristal oluşumları ve eserler geliştirilmesi, düşük iyon sinyal ve kötü tekrarlanabilirlik 7 yol açabilir.
Belirli matrislerin afinite özel analitleri izole etmek için, matris tipi bir deney için seçilen nedeniyle canönemli ölçüde sonucu değiştirmez. protein ve peptid görüntüleme için kullanılan matris genellikle görüntüleme lipidler için kullanılanlardan farklı ve işlem bundan başka, başarılı bir dokudan sinyalleri tespit etmek için yıkama ve rehidrasyon adımları gibi ek işlemler için ihtiyaç tarafından karmaşıktır. Yıkama aşamaları lipit sinyalleri 8 arttırılması için mevcut olmasına rağmen, en çok lipit türlerinin tespiti için bir ön koşul değildir. bir lipid görüntüleme deney için bir matris seçerken, uygun matrislerin aralığını daraltmak bu kadar ilgi lipid kutuplarını dikkate almak önemlidir. Örneğin, gangliositler onlara genel bir olumsuz kutuplarını vermek sialik asit kalıntılarını içerir. etkin bir şekilde desorbe ve doku gangliosidler iyonize olabilir matrislerin vardır; Bununla birlikte, bu spektrum ve vakum altında matrisi matris türetilmiş tepe gibi faktörler dikkate alınarak alınmalıdır. 1,5-diaminonapthalene (DBİR) matris görüntüleme uygulamalarının çoğu için cihaz vakum koşulları altında yeterince sabit ve lipid desorpsiyonu için yüksek bir hassasiyet derecesi gösterdi ve pozitif ve negatif iyon modlarında 2 hem de lipid analizi için kullanılabilir. Bu dihidroksibenzoik asit (DHB), 9-aminoakridin'in (9-AA) ve 5-kloro-2-merkaptobenzotiazol (SPK) gibi diğer olumsuz lipit benzer matrislere karşılaştırıldığında DAN matrisi, en etkin bir şekilde fare beyninden gangliosidler desorbe mümkün negatif iyon modunda (hazırlama yazısı) doku.
matriks birikimi uygun yöntemi seçerek matrisi kendisi seçerek eşit öneme sahiptir. Sıvı ilave izin vermek için örnek nüfuz olarak katı matris bir organik çözücü içinde çözülmüş, ve pnömatik bertaraf veya püskürtme ya gözcü otomatik olup, burada ıslak hücreler arasında madde birikmesi yöntemleri, protein ve peptid desorpsiyonu için özellikle etkilidirmatrisle bileşikler ve ko-kristalizasyon ction. Bu teknikler ayrıca lipit uygulamaları, analit yerel olmaktan ve eşit olmayan bir matris kristal oluşumları için kullanılabilir, ancak özellikle ipek 2, 9 nedeniyle çözücü maddeler içinde yüksek lipid bolluk ve çözünürlüğüne ortak oluşumları vardır. lipidler kolayca dokudan iyonize olduğundan bu tekniklerin dezavantajı çok engellemeyi ederken, böyle yüceltme gibi kuru matriks birikimi teknikleri, püskürtme için basit, uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. MALDI IMS deneylerde süblimasyon başarısı ıslak matris teknikleri 1, 10 ile karşılaştırıldığında artmış tekrar üretilebilirliğine yol açmaktadır, bağlayıcı matris analit için yüzey alanını arttırır mikrokristalin matrisi morfolojisi, artan matriks saflık ve homojen matris birikimi gibi özellikler ilişkilendirilir.
Sublime invoHemen doku numunesi yüzeyi üzerine biriktirme ardından toz haline getirilmiş matrisin gaz faz geçişi bir katı olarak elde soğutulmuş bir Örnek yüzeyinin altında, vakum altında, bir toz halinde matris ısıtma lves. süblimasyon sırasında hücreler arasında madde birikmesi, zaman, sıcaklık ve yüksek oranda çoğaltılabilir sonuçları sağlamak için basınç değişen faktörlere ile kontrol edilebilir. Tek bir yüceltme deney atmadan önce birkaç kez tekrar kullanılabilir, seçilen matris tipine bağlı 5 ila 20 dk sürebilir. Cihaz otomatik spreyler fiyatının bir kısmını piyasadan satın alınabilir ve kolayca temizlik ve bakım için ayrı alınır. düşük maliyetli ve bu matris birikim tekniği göreceli basitliği başlayan veya MALDI IMS lipid görüntüleme uygulamaları üzerine genişleyen araştırmacılar için ideal hale getirmektedir. IMS dokuların yüceltme için protokoller ayrıntılı bilgi 11 rapor edilmesine rağmen, birkaç standart protokoller w varhich zor geniş deneme ve yanılma olmadan tekniği kurmak için yapım, negatif iyon modunda yüksek kütle lipitleri görüntülenmesinde bir yüceltme deneyi yürüten ile ilgili temel iş akışı üzerinde durulacak. Aşağıdaki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve gangliosidler tespiti için sıçan beyin kesitleri üzerine DAN matrisi yüceltme için bu boşluğu doldurmak amacıyla deneysel bir protokoldür.
Şekil 2: Süblimasyon cihaz. Fotoğraf (A) ve süblimasyon cihazının şematik bir diyagramı (B). Vakum pompası 300 ml etanol ile dolu bir soğuk kapan kauçuk boru ile bağlanır. Soğuk tuzak sonra yüceltme aparatına lastik boru ile bağlanır. Cihaz, bir metal U bağlantı ile birlikte kapatılır cam iki ayrı parçadan oluşmaktadır. inceltici üst yarısıbuz slush ile doldurulur kondenser içermektedir. Numune levhası, kapalı cam bir aparat içinde, bir kondansatör alt üzerine bantlanır. yüceltme aparatının alt yarısı eşit örnek plaka bakacak yaymak DAN matrisi içerir. süblimasyon sırasında cam Cihaz doğrudan altındaki sıcak levha ile 140 ° C'ye kadar ısıtıldı, bir kum banyosuna yerleştirilir. sıcaklık probu deney için önceden ayarlanmış sıcaklığa göre kum banyosu sıcaklığı geri bildirimler ile yüceltme deney boyunca istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvan taşıma prosedürleri Batı Ontario hayvan bakım komitesi (2016-014) Üniversitesine ya bağlı aşağıda tarif.
1. Doku Hazırlama ve Kesit
- "Taze Donmuş Ekstraksiyon" (FFE) olarak bilinen bir süreçte sıçan beyin dokusunu ayıklayın.
- pentobarbital sodyum aşırı dozda ile sıçan Euthanize ve bacaklarda refleksleri izlemek. Tüm refleksler durdurmuş sonra, bir giyotin kullanarak sıçan başını sever.
- Dikkatlice neşter kullanılarak kafatası kasları ve diğer dokuları ayrı. ön kısmına kafatası (foramen magnum) tabanından başlayarak, beyin maruz kafatası kırmak için kemik kesme forseps kullanabilir.
- Beyin ortaya çıktığında, dikkatli bir cerrahi spatula ile kepçe ve hemen flaş dondurmak için ezilmiş kuru buz koyun.
NOT: beyin çok uysal olacaktır. üzerinde beyin yerleştirirken nedenle aşırı dikkatkuru buz. Beyin ezilmiş veya bir yüzeye karşı basılırsa, onun şeklini değiştirmek ve o konumda donacak.
- kuru buz üzerinde 80 ° C derin dondurucu ve yerden - taze dondurulmuş doku (değil formaldehit ile perfüze veya OCT gömülü) çıkarın.
- kuru buz veya Kriyostat dondurma çubuğunda ya da üzerinde bir kriyostat tutucu ve yerin su birkaç damla koyun. Basın doku hafifçe kriyostat tutucu üzerine bu doku tabanı etrafında su donuyor kadar dondurmak ve tutun başlar ve yere çapa. Gerekirse daha fazla tutucu doku sabitlemek için ek su ekleyin.
NOT: Su istenen sinyalin tespiti etkileyebilir bileşikler ile doku kirlenmesini önlemek amacıyla doku montaj yerine Ekim medya kullanılmaktadır. - kriyostat pozisyonu doku. istenen anatomik yere kadar bölüm doku. 12 mikron - kesim kalınlığı 8 arasında olduğundan emin olun.
NOT: toplumsal kriyostat doku kesitcihazlar, tür bıçaklar, fırça, anti-roll barlar ve sahipleri olarak ayrı malzemeler bileşikleri gömme ile kirlenmesini önlemek amacıyla kullanılması zorunludur. kriyostat içinde de kullanılmadan önce iyice etanol ile temizlenmesi gerekir. - Kriyostaz viraj denge çubuğunu kullanarak, yavaşça bölüm doku bölümleri düzleştirilmiş. denge çubuğu yerleşimi yanlış veya bıçak donuk ise dokuda delik veya işaretler oluşabilir. temiz paintbrushes kullanarak platformu dilimleme merkezine doku taşıyın.
- Montaj
- dilimleme sırasında kriyostat yerleştirerek iletken slayt veya metal plakalar dondurun. slayt tamamen donmuş zaman, dikkatli bir şekilde temiz paintbrushes kullanarak slayt iletken yüzeyine kesitli doku taşıyın. tüm doku bölümleri slayt doğru konumlandırılmış bir kez bölüm thaws kadar, slayt altında bir parmak yerleştirmek dokusu karşısında ve tuşuna basın.
NOT: Bölümler kat veya çözdürme işlemi sırasında sırasında kıvrılabilirBu montaj yöntemi kullanarak. Bu doku çözdürme sırasında kriyostat slayt tutarak azaltılabilir. bu konular sorunlu hale gelirse, alternatif, sıcak-montaj yöntemi aşağıda listelenmiştir. - Alternatif olarak, bir oda sıcaklığı İndiyum-kalay oksit (İTO) slayt (ya da metal plaka) almak ve hafifçe aşağı, dilimleme platformu yüzeyinde donmuş doku bölümünde iletken tarafı aşağı doğru bastırın. Bu eşit küçük kıvrılmasını veya doku katlama sürgünün yüzeyi üzerine doku kesiti eritme yol açacaktır.
NOT: Montaj bazı proteinlerin ve yağların kaybına yol açabilir, bu yöntemi kullanırken Yoğunlaşma bölümünün altında görünebilir.
- dilimleme sırasında kriyostat yerleştirerek iletken slayt veya metal plakalar dondurun. slayt tamamen donmuş zaman, dikkatli bir şekilde temiz paintbrushes kullanarak slayt iletken yüzeyine kesitli doku taşıyın. tüm doku bölümleri slayt doğru konumlandırılmış bir kez bölüm thaws kadar, slayt altında bir parmak yerleştirmek dokusu karşısında ve tuşuna basın.
- 10 dakika - 5 için bir desikatöre doku ile slaytlar yerleştirin.
2. süblimleştirici Aparatı Set-up
NOT: Davlumbaz bu adımları uygulayın.
- metal makas lift sıcak plaka, bir sıcak plaka üzerine bir alüminyum kap içinde bir kum banyosu yerleştirinUygun yüzey alanı (sıcak plaka yani daha büyük). sıcak plaka açın ve 140 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır.
NOT: DAN matrisi için erime noktası 187 arasında - ° 190 ° C. ocak üzerinde bu sıcaklığı aşmayın.- sıcak levha bir sıcaklık geri besleme sondası ile donatılmış ise, deney boyunca kum sıcaklığını izlemek ve sıcaklık tutarlılığı sağlamak için kullanabilirsiniz. Bu özellik, çeşitli süblimasyon deneyler arasında deney tekrarlanabilirlik ile yardımcı olabilir.
NOT: kum banyosu yüksek sıcaklıklarda parçalanabilir bir cam kap gibi bir alüminyum kap içinde yer almalıdır.
- sıcak levha bir sıcaklık geri besleme sondası ile donatılmış ise, deney boyunca kum sıcaklığını izlemek ve sıcaklık tutarlılığı sağlamak için kullanabilirsiniz. Bu özellik, çeşitli süblimasyon deneyler arasında deney tekrarlanabilirlik ile yardımcı olabilir.
- Süblimleştirme cihazının dibinde yüzeyi üzerine DAN matrisinin 300 mg yerleştirin. düzeneğin merkezinde matris yerleştirin ve süblime olan yaklaşık genişlik ve sürgünün uzunluğu eşit bir tabaka olarak yayılır.
DİKKAT: DAN matris toksiktir. Bu nedenle, önemli aşınma eldiven, maske ve güvenliğidirher zaman gözlük toz matris tutarken. o ışığa duyarlı olduğundan DAN karanlıkta saklanmalıdır. - Plaka, ayrılma sırasında sürgünün tüm yüzeyi boyunca soğutma sıcaklığının eşit dağılımını sağlamak için kondansatör alt doğrudan temas ile düzeneğin iç yüzeyi üzerine bir metal plaka kaydet. Alternatif olarak, kum kondenser alt düz bir yüzey sağlamak için.
- plakanın dış kenarları boyunca bant yerleştirilir ve iç cam kenarlarına uygun. Bant plakasının altına yerleştirildi ve iç cam yüzeyinin altına yapışır ise, sıcaklık dağılımı daha olmayabilir ve sürgünün yüzeyi boyunca düzgün olmayan bir matris dağılımı neden olabilir.
- Boş (testi) Bant tekrar slayt dış kenarlarında yerleştirilen bant ile metal plakanın yüzeyi boyunca çapraz kaydırın.
- W, düzeneğin üst ve alt kısımları iletişimeortasında bir kauçuk O halkası i tam bir sızdırmazlık sağlamak için.
- düzeneğin merkezi etrafında bir metal U ortak yerleştirin ve aygıtının üst ve alt yarısı sıkıca kapatılmış kadar mengeneler sıkıştırın. kum banyosu üzerinde metal O-ring yerleştirin.
- ezilmiş buz bir avuç al ve yoğunlaştırıcı içine yerleştirin. buz rüşvet oluşturmak için soğuk suyla dolu ½ ¼ kondenser doldurun. Buz hızlı geri dökme kendisine yapışık düzeneğin içinde ve daha sonra slayt üzerinde metal plakayı soğuyacaktır. kararlı bir duruma ulaşması için sıcaklık en az 5 dakika bekleyin.
- Soğuk tuzak kap içinde 300 ml etanol dökün ve kaba cam yerleştirin. Soğuk tuzak kabın alt etanol içinde kuru buz 3 küçük parçalar 2 - bırakın. Çıktı yok iken soğuk tuzak girişi, silindir dibine çalışan bir cam tüp vardır.
- kauçuk tüp kullanılarak soğuk tuzak çıkışına vakum pompası bağlayın. kauçuk bir parça kullanınboru yüceltme aparatına soğuk tuzak girişini bağlamak için. boru sıkıca varsa metal kelepçeler kullanarak güvenli olduğundan emin olun.
- 50 mT - 30 bir vakum sağlamak için vakum pompası kullanın. Pompa basınç dengeleme için en az 5 dakika boyunca çalışmasına izin verin. Vakum pompası, çünkü cihaz azalmış basınç açıldığında kez Süblimleştirme cihazının U halkası üzerindeki mengene bir sıkıştırma gerekebilir.
NOT: Bu yüksek bir vakum göstergesi deney sırasında vakum basıncı izlemek ve deneyler arasında mümkün olan en yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için basınç sızıntı testi için pompaya bağlı olması önerilmektedir. Bununla birlikte, çoğu pompa nedenle ölçüm deneyimli kullanıcılar için gerekli olmayabilir, sabit bir basıncı korumak için tasarlanmıştır. Ayrıca, vakum mühür gres vakum basıncını korumaya yardımcı olmak için kullanılabilir.
3. Sublime
- kum banyosu sıcaklığı stabil olduğundan emin olun140 ° C'de ve düzenek bağlı tüm boru ile bir kum banyosu üzerinde metal O-ring güvence altına alınır ve vakum altında açık olduğu ize.
- 7 dakika zamanlayıcı ayarlamak ama sayacını başlatmak yok. inceltici U-eklem iyi metal O-ring üzerinde olana kadar yavaş yavaş süblime aparatına makaslı ve kum banyosu yukarı kaldırın. Bu ekstra alan kum aparatın ayarlanmasını sağlar.
- Hızla aparat kumun üzerinde eşit oturuyor emin olmak için kum yüzeyinde hafifçe inceltici basın ve sonra hemen Sayacı başlatmak.
- Zamanlayıcı çaldığında, vakum pompasını kapatmak ve dikkatle inceltici artık kum banyosu dokunuyor ve metal O-ring emniyetli şekilde oturduğunu kadar makas lift indirin.
- Yavaş yavaş aparat basıncı serbest bırakmak için mikro-havalandırma vanası gevşetin. yüceltme aparatının kauçuk tüp etrafında metal kelepçeyi gevşetin ve yavaş yavaş tüp gevşetin başlar. ru kezgrafik çubuklarıyla bBER tüp hafifçe gevşetti olmuştur, kalan basıncı kaçmasına izin bir tarafa tüp bükün.
- ortam basıncı döner dikkatlice süblime cihazdan kauçuk tüp kaldırdığınızda.
- aparatın U-eklem üzerindeki kötü alışkanlıklardan gevşetin ve çıkarın. Dikkatle yüceltme cihazının iki yarısını ayırmak ve iç cam üstünden slayt çekin. matris dağılımını bile onaylamak için slayt inceleyin.
NOT: Matris düzensiz ise, inceltici altındaki toz matris yeniden konumlandırılmış olabilir veya inceltme aygıtı sonraki slayt için kum yeniden konumlandırılmış olabilir. süblimasyon işlemi, aynı matris kullanılarak birkaç kez tekrar edilebilir, bununla birlikte, matris sonunda süblime süresini ayarlamak için biraz ayarlanması gerekir ki bu azalacaktır tekrar ısıya maruz kalma ve tozun miktarından daha koyu hale gelecektir. Bu nedenle, matris bei miktarını izlemek için önemlidirng slaytlar arasındaki matriks birikimi tutarlılığı sağlamak için her deneyden sonra yüceltilmiş - yüceltilmiş matris dağılımı ve miktarı yeterli değilse, inceltici ve tekrar Bölüm 3 iç üzerine doku ile yeni bir slayt bantlayın.
Not: kalite kontrol (QC) amaçları için, süblime matris miktarı gibi süblimleşme sonra slayt ağırlığında ve slayt 2 yüzey alanına sahip süblime matrisin ağırlığına bölünmesi ile her bir deney sonra ölçülebilir, bu unutulmamalıdır yüksek hassasiyetli terazi kullanılmadığı sürece QC tamamen ölçülebilir aracı aksine nedeniyle 4 ondalık noktaları ve ölçekler arasında değişkenlik ötesinde en ölçekler hassasiyet eksikliği, bu ölçümler sadece optimum matriks birikimi için bir rehber kullanılmalıdır olmalıdır (bakınız Şekil 3).
4. Doku Depolama / rehidrasyon
- süblimasyon sonra, mağaza kapalı bir kap ya da küçük cass slaytlarmühürlü plastik torbaya ette.
- 2 saat veya gece boyunca -20 ° C derin dondurucuda slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
Not: donma sürecinin amacı matris içine doku malzemeleri desorpsiyonu için bir rehidrasyon adım olarak hareket etmektir. Dondurma işlemi, aynı zamanda C 12 ° -80 ° C'de muhafaza zaman 1 hafta kadar lipid sinyallerinin bozulmasını önlemek için gösterilmiştir. Bu nedenle örneklerin, dondurucuda saklanan zaman miktarı önemli ölçüde (laboratuarımızda görüldüğü gibi) sinyal algılama değiştirmeden deneyi ihtiyaçlarına göre belli bir dereceye kadar değişebilmektedir. Numuneler -20 ° C'de daha uzun bir süre, 24 saat boyunca dondurulmuş, ancak matriks bazı renk fark ettik. Böylece, o zaman önce yüceltilmiş dokuyu görüntüleme veya daha uzun kuluçka dönemleri için -80 ° C'de doku saklanması önerilir. - 10 dakika - 5 için bir desikatörde dondurucu (ve kap) ve yerden slaytları çıkarın.
5. Görüntüleme ve Analysis
- desikatöre slaytları çıkarın ve görüntüleme sırasında MALDI enstrümanın kütle doğruluğunu sağlamak için enstrüman standartlarını uygulamak. standartları türü enstrümantasyon bağlı olarak değişecektir. Standartlar genellikle (Şekil 3D) yansıması dokuyu çevreleyen tüm slayt arasında eşit olarak uygulanır.
- MALDI aracı haline slayt takın ve görüntüleme deneyleri için üreticinin talimatlarına (enstrüman yöntemleri 1000 için optimize edilmelidir - 2000 kütle aralığı) izleyin. Temsilcisi sonucu (Şekil 4) 70 mikron raster ve 20 çekim / spektrum (kazanım süresi ~ 2 saat) ile reflektron negatif modda satın alındı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Süblime Deneyin tamamlanması üzerine, cam düzeneğinin iki yarısı, kondansatör bantlanmış, davlumbaz ve slayt ayrılır (Şekil 3A) çıkarılabilir. Bu noktada, kayıcı aşağıdaki slayt için ayarlanması gerekebilir kum banyosu düzeneğin düzensiz matris dağılımı ve süresi, sıcaklık veya yerleşim için muayene edilmelidir. Başarılı bir DAN yüceltme deneyi dokusunun anatomik özellikleri açıkça görülebilmesi slayt ve cam slayt matris miktarı yüzeyi boyunca gri / kahverengi matris eşit bir kaplama ile sonuçlanacaktır dokusunda miktarına benzer (Şekil 3B). Çok fazla matris dokusunun üzerine süblime edilmiştir, örneğin, matris kalınlığı ayırt edilebilir olacak doku sadece genel şekline özelliklerini kapsamaktadır. çok az matriks süblimleşebilir, ancak doku ha olacakslayt (Şekil 3C) geri kalan kısmından daha koyu bir görünüme ve. Hem çok fazla ve çok az matris MALDI enstrüman zayıf sinyal neden olur. Kalite kontrolü amacıyla, Thomas ve ark. slayt üzerinde biriken matris miktarı tartılmış ve sürgünün yüzey alanı ile ağırlık ayrılır. Bunlar dan (110 ug / cm²) 2 dahil olmak üzere çeşitli matrisler için matriks birikimi optimal miktarı bildirilmiştir. En dengeler tür sonuçlar çoğaltmak için gereken kesinlikten yoksun olsa da, biz QC bu yöntemi girişiminde; Ancak, bağlı değişkenlik yüksek derecede, sadece enstrüman sinyal tespiti ile tespit olarak bulunmuştur matriks birikimi uygun bir dizi DAN matris ile başarısız süblimasyon deneyleri karşı başarılı ilişkili olduğu tavsiyelerde bulunabilir. 140 Yukarıdaki ug / cm² ölçüm iken altında 100 ug / cm² bir matris ölçümü "çok az" matris koşulları ile ilişkili"Çok fazla" ile ilişkili. 100 ve 140 ug / cm² arasındaki hücreler arasında madde birikmesi, DAN matris ile görüntüleme için optimal bir miktar olduğu bulunmuştur. Kalibre standartları tespit IMS sinyallerinin kitle doğruluğunu sağlamak için doku örnekleri etrafında cam slayt uygulanmalıdır (Şekil 3B)
Bir MALDI IMS deneyde, molekül görüntüsü belirli bir kütle aralığı içinde mevcut olabilecek herhangi bir bilinmeyen türleri ile ilgili analit 'uzaysal dağılımının olarak gösterebilir. Bu deneyde gangliosidler moleküler görüntüleri sıçan beyninde (Şekil 4A) kortikal ve subkortikal bölgelerde birkaç gangliosid türlerinin anatomik dağılımını göstermek için ImageJ yazılımı kullanılarak kaplanmıştır. beyinde en bol gangliosidler A serisi türleri GD1a ve GM1, aynı zamanda gangliosidler GM2 ve GM3 ikisi arasında bulunabilir içerirlerSpektrumu (Şekil 4B) boyunca tespit etmek kolaydır, bu gangliosidler hale 1,000-2,000 m / z kütle aralığı, en sık rastlanan beyin lipidler daha yüksek bir kütle aralığı. Her gangliosid türlerin iyonik bolluğu için kullanılabilir, aynı görüntü içinde gangliosid türlerinde farklılık ya da değişiklik yarı ölçmek. Tarama karşılaştırmalar yarı-nicel olarak kabul edilir arasındaki Numune Hazırlama değişkenlik belli bir miktar, IMS önlenemez için.
3. DAN Sublimasyon Şekil. Sıçan beyin dokusu üzerinde DAN matrisi yüceltme Temsilcisi sonuçları. Süblimasyon işlemi tamamlandıktan sonra (A), düzeneğin iki yarısı ayrılır ve slayt yoğunlaştırıcısı kaldırılır. (B) DAN matrisi yüksek Repr sağlamak için sürgünün yüzeyi üzerinde birden fazla sıçan beyin doku kesitlerinin eşit bir şekilde yayılıroducible sonuçlar (100 arası 150 - ug / cm²). (C) (sol - <90 ug / cm²) ya da çok fazla matris (sağ -> çok az matris başarısız yüceltme deneylerin örnekleri 150 ug / cm²) yatırılır. Çok fazla matris lazer düşük iyon tespiti ile sonuçlanan, satın alma sırasında dokuya nüfuz etmesine izin ise çok az matris analitlerin yeterli desorpsiyonu ile sonuçlanacaktır. (D) esas DAN matrisi ve kalibrasyon standartları ile süblime sıçan beyin dokusu bölümleri içeren slayt görüntüleme için MALDI alet içine sokulmak için hazır olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Rat Beynindeki gangliositler 4. MALDI IMS. representative MALDI IMS moleküler görüntü ve DAN matrisi ile süblimasyon sonra sıçan beyninde gangliosidler kütle spektrumu. Moleküler görüntü üst üste spektrumunda birden gangliosid türlerinin kompozit ve beyin boyunca gangliosid türlerinin eşsiz anatomik dağılımını göstermek için Resim J yazılımı kullanılarak yalancı. Türlere GM1d18: 1 (kırmızı, kütlesi yaklaşık 1.547 Da), GM1d20: 1 (yeşil, kütlesi yaklaşık 1.573 Da), GM3d18: 1 (mavi, kütlesi yaklaşık 1.178 Da) ve GM3d20: 1 (deniz mavisi kütlesi yaklaşık 1.207 Da), sırasıyla temsil etmektedir. 2.000 kütle aralığında - 1000 içinde analitlerin kütle spektrumu görüntüler iyonik bolluğu. büyük A serisi gangliositler spektrum boyunca etiketlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, MALDI IMS deneylerde örneğin gangliosidler gibi negatif yüklü lipidler, tespiti için doku üzerinde matris süblimasyon standart bir protokolü göstermektedir. MALDI IMS numune hazırlama oldukça değişkendir ve ilgi analit eşsiz özelliklerini uyacak şekilde özelleştirilebilir olması gerekir. Doku örneği yüzeyi üzerine matrisin uygulanmasına IMS'de sonuçlar kalitesi açısından örnek hazırlama işleminin çok önemli bir yönüdür. Matris ilgi analit ile uyumludur ve spektrumunda matris türetilmiş eserler serbest olmasını sağlamak, matrisler seçerken özellikle dikkatli olunmalıdır. Süblimasyon dokusunda lipid küçük yerel olmaktan matris kristal homojenliği yüksek derecede sağlar kuru hücreler arasında madde birikmesi tekniğidir. Özellikle DAN matris sıçan beyninde gösterildiği gibi gangliosidler adlandırılan negatif yüklü membran lipidlerinin bir grup desorpsiyonu için bir hassasiyet derecesi göstermektedirBölümler ve görüntüleme uygulamaları çoğunluğu ile uyumluluk sağlayan, uzun bir süre boyunca vakum altında stabildir. DAN matris, pozitif yüklü lipid türleri için yüksek bir afiniteye sahip olan, bu şekilde, MALDI IMS uygulamaları 2 bu matrisin çok yönlülüğü arttırmak için ek bir yararı vardır. Ayrıca, bu IMS protokolü kullanarak fosfolipitler dahil olmak üzere birden fazla lipid türleri, eş zamanlı olarak tespit edilebilir olduğu not edilmelidir.
9 diğer sık kullanılan matrisler karşılaştırıldığında DAN matris özelliklerinin ayrıntılı bir inceleme daha önce 2 yayımlanmıştır. DAN kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüleme için yeteneği gibi incelenen diğer matrisler ile karşılaştırıldığında, bu makalede, yazarlar negatif iyon modunda DAN matrisinin artmış duyarlılık vurgulamaktadır. DAN matris negatif polarite iyonları için en yüksek genel performansı sahip olduğu bulunmuştur. İlginç bir şekilde, bu equa gerçekleştirilenLly iyi pozitif kutup iyonları için. negatif polarite iyon için yüksek bir afiniteye göstermiştir Diğer yaygın matrisler DHA, DHB 'yi, ve 9-AA içerir. Bir matris olarak DHA etkinliği çok görüntüleme uygulamaları 2 için pratik hale getirir, vakum altında düşük stabilitesi ile sınırlıdır. DHB matrisine 13 oranla negatif modda 950 kütle aralığında - 9-AA düşük arka plan gürültü ve 750 sulfatid sinyallerinin ortaya zenginleştirme üretme yararı vardır. DHB pozitif modda çok etkili olduğu gösterilmiştir, ancak, bu DAN matris 2 ile karşılaştırıldığında daha düşük negatif polarite iyon sinyali verir. DHB 2 ile karşılaştırıldığında - DAN matrisi daha düşük kütle aralığı (950 650) 'de negatif iyon modunda, artan duyarlılık göstermiştir. Buna ek olarak, DHB 750 negatif iyon modunu Da 2 önemli matris kümeleri oluşabilir bildirilmiştir.
ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. , Burada toprak matrisi ince bir elekten geçirilir ve örnek yüzeyi üzerine yatırılır. Yazarlar ıslak matris manuel püskürtme tekniği matriks birikimi bu kuru yöntemi karşılaştırıldı ve 450 fosfolipid karşılaştırılabilir sinyal verdi bulundu - 1200 kütle aralığında 14. Bir çalışmada, ancak yazarlar iki teknik görüntü çözünürlüğü veya iyon sinyal verimi 15 açısından karşılaştırıldığında nasıl bir yorum yapmamıştır, fosfolipid ifade incelemek için bir elek ile yüceltme ve kuru kaplama ikisi de kullanılır.
uygulanabilirlik mümkün olan en geniş sağlamak amacıyla, sunulan protokol MALDI IMS hem yeni hem de daha özel kullanıcıların lipit görüntüleme uygulamaları geniş bir yelpazede için yüksek tekrarlanabilir sonuçlar elde sağlayacak bir temel iş akışı oldu. Bununla birlikte, süblimasyon protokolleri UNIQU karşılamak için değiştirilebilirDeney e koşullar. Örneğin, yüceltme tarafından sağlanan ince matris kristal birikimi ön kaplama slaytlar tarafından numune hazırlama sırasını tersine çevirmek için bir seçenek / matris ile plakalar önce dokuyu montaj sağlar. Matris önceden iletken yüzeye yüceltilmiş ve böylece hala lipit tespiti 16, 17 için yüksek hassasiyete korurken örnek hazırlama süresi sonrası kesit azaltarak daha sonra kullanmak için karanlık bir ortamda saklanabilir. Lipidlerin saptanması için sinyali geliştirmek için bu protokole yapılan bir başka değişiklik, amonyum format 8 ile 2 dakika yıkamadır.
Süblimasyon gibi küçük gibi en ıslak yerleştirme teknikleri, sakıncaları sınırlanmasını de, daha homojen bir matriks kristali birikimli 1, bu yüzden, otomatik püskürtme ile karşılaştırıldığında analitlerin delokalizasyonu ve düşük maliyet azalmışörnek hazırlama sürecinde bana değişkenlik kaçınılmazdır. yüceltme durumunda, başka bir deneyde dakikalık farklılıkları neden olabilir ve laboratuarımızda gözlenmiştir şunlar çeşitli faktörler vardır. kum Süblimleştirme cihazının pozisyonda farklılıkları olabilir. back-to-back birkaç süblimasyon deneyleri çalıştırırken, kum banyosu içinde kum kum banyosu boyunca ısı dağılımını etkileyebilir konumunu kaydırmaya başlayabilir. yüceltme, her turdan önce kum düzleşme da üniform bir sıcaklığa geri dönmek için zaman alabilir yerinden edilmiş kum gibi ısı dağılımını değiştirebilir. Sublime zaman kum banyosu içinde kum kayması telafi etmek için her tur arasında biraz ayarlanması gerekebilir. Seçenek olarak ise, bir yağ banyosu kullanılır daha homojen ısı dağılımına yol açabilir.
İkinci olarak, inceltici altındaki matris miktarı değişebilir. DAN matriX, bir clumpy gri bir görünüme sahiptir ve büyük kümeler oluşturulması için bir eğilim vardır. Bu kümeler elle kırılmış ve inceltici alt düzenlenmiş ama tamamen yok edilemez olabilir. matris Büyük kümeleri ısı ve yüceltme son ürünü etkileyebilir küçük parçalara göre daha yüceltmek için daha uzun sürer.
yüceltme aparatı vakum çıkışı başka önemli faktördür. En incelticide boru, ayrılma sırasında vakum pompasına bağlamak için bağlı olduğu, üzerine, tek bir elektrik çıkışı yapılır. Basınç cihazının o tarafında düzenlenir olduğu için, daha fazla vakum çıkışı tarafında tevdi edilmesiyle, matris birikimi hafif bir hareketlilik söz konusu olabilir. Bu biraz kum düzeneğin konumu ya kaydırılarak, inceltici alt matris pozisyonu veya bir kondansatör ile ilgili kayar / plakanın pozisyonunu değiştirerek telafi edilebilir. bu gerçeğiORS süblime tekniğin başlıca dezavantajı vardır ve bu nedenle, kez bu değişkenler için telafi etmek için ayarlanabilir, böylece deneysel örnek çalıştırmadan önce süblime sürecinde bir test slayt çalıştırmak için çok önemlidir.
süblimasyon başka rapor dezavantajı yüksek kütle analitlerin saptanması yeterli analit ekstre etme ve / veya matris ile karıştırılması ile sınırlı olmasıdır. yüceltme sonra bir rehidrasyon adım, bu sorunu aşmak için bu yüksek kitle analitleri çekin yardımcı olabilir. Bu, tipik olarak bir rutubet gözünün 18 kullanılarak elde edilir. Ancak, bu protokolde, bir dondurma adımı aynı amaca ulaşır süblimasyon sonra eklenir. MALDI enstrüman sokulmadan önce numunelerin dondurma ve (bir kurutucuda), daha sonra çözülme ti koruyarak geçici yüksek kütle lipid ekstraksiyonu sağlamak için örnek nemlendirir numunenin yüzeyi üzerinde oluşturulması için yoğunlaşma neden oluranalizi 12, 17 için ssue.
Genel olarak, süblimasyon MALDI IMS deneylerinde lipid saptanması için matris uygulamanın son derece hassas ve maliyet etkin bir yöntemdir. Biz matriks birikimi için bir yüceltme yöntemiyle 4 bir hava püskürtme yöntemi 3 kullanırken kaymıştır Nitekim, bizim grup IMS sonuçlarına önemli gelişmeler fark etti. Mevcut protokol lipid görüntüleme uygulamaları bir dizi için uygundur ama deneyci ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
