Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55267
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute
* These authors contributed equally

Summary

Protokoller til at generere hPSC mutante linjer ved hjælp af iCRISPR platformen og til at differentiere hPSCs til glucose-responsive p-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC-rettet differentiering giver en stærk platform for systematisk analyse af den rolle, slægt determinanter i menneskelig udvikling og sygdomsprogression.

Abstract

Afhøre genfunktion i selvfornyende eller differentiere menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyder en værdifuld platform til at forstå den menneskelige udvikling og dissekere sygdomsmekanismer i et fad. For at udnytte dette potentiale applikation kræver effektive genom-redigeringsværktøjer til at generere hPSC mutanter i sygdoms-associerede gener, samt in vitro hPSC differentiering protokoller til at producere sygdomsrelaterede relevant celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. Et effektivt genom-redigering platform for hPSCs opkaldt iCRISPR er udviklet gennem Talen-medieret målretning af en Cas9 ekspressionskassette i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering af inducerbare Cas9 hPSC linjer ved hjælp celler dyrket i et kemisk defineret medium, og en feeder-fri tilstand beskrevet. Detaljerede procedurer for brug af iCRISPR systemet til gen-knockout eller præcise genetiske ændringer i hPSCs, enten gennem non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller via præcise nukleotidændringer bruger homologi-dirigeret reparation (HDR) skabelon henholdsvis er inkluderet. Disse tekniske procedurer omfatter beskrivelser af design, produktion og transfektion af CRISPR guide RNA (gRNAs); målingen af ​​CRISPR mutation renten med T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering af klonede mutant linjer. Endelig har vi krønike procedurer for hPSC differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler ved at efterligne in vivo bugspytkirtlen fosterudvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med instrueret hPSC differentiering muliggør systematisk undersøgelse af gen-funktion til at fremme vores forståelse af pancreas udvikling og diabetes sygdomsmekanismer.

Introduction

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både selv-forny og giver anledning til alle derivater af de tre embryonale kim slægter. De giver en værdifuld ressource for celleerstatningsterapi og sygdom modellering ved at fungere som en unik platform til at rekapitulere cellulære processer i et menneske udviklingsmæssig sammenhæng. De er også en kilde til eksperimentelle celler til skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremskridtene været begrænset på grund af to hovedudfordringer: manglen på effektive genetisk modificering værktøjer og vanskeligheden ved den gentog de komplekse embryonale udviklingsmæssige trin i en kultur fad.

Gensplejsning er et uundværligt redskab til at studere genfunktion i normal udvikling og sygdom. Men mens klassisk gen målretningsmetoder via homolog rekombination har vist sig at være et effektivt redskab til at dissekere genfunktion i muse embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilganghar været yderst ineffektiv, når den anvendes til hPSCs 2, 3. Den nylige rask tiltrædelse af programmerbare, stedspecifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebrug, herunder zink finger nukleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), og de grupperede regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associerede (Cas) systemer 4, betyder, at genom engineering er blevet en meget lettere opgave i en bred vifte af organismer og cellelinjer, herunder hPSCs. Disse gen redigeringsværktøjer drage fordel af den kendsgerning, at kimære nucleaser såsom Cas9 endonuklease kan tillade en hel række genetiske modifikationer ved at inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) på præcise placeringer, udløser det endogene DNA-reparation maskiner til at aktivere enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-dirigeret reparation (HDR). Begge mekanismer kan udnyttes til genetisk manipulation ved at inducere eithis tilfældig isætning og deletionsmutationer (indels; via NHEJ), for at skabe rammeskift mutationer, ophæve gen alleler, eller præcise nukleotidsubstitutioner (via HDR), at rekapitulere patient mutationer til human sygdom modellering eller at korrigere en sygdomsfremkaldende mutation til genterapi .

CRISPR / Cas-medieret genom engineering kræver to komponenter: den konstante RNA-guidede Cas9 endonuklease nødvendig for DNA spaltning og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktiverende (tracrRNA) dupleks, der angiver DNA-mål anerkendelse. Den crRNA / tracrRNA duplex kan erstattes med et enkelt kimært guide RNA (gRNA), som har vist sig at arbejde mere effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 system er blevet tilpasset til de fleste eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og ekspressionen af ​​Cas9 og gRNA varierer betydeligt og skal yderligere optimeres til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, herunder hPSCs 8. Et effektivt genom-redigering platform, iCRISPR, er blevet etableret i hPSCs 5. I dette system har en Talen-medieret fremgangsmåde blevet anvendt til at målrette begge alleler af "transgen safe harbor locus" AAVS1 i trans, én allel med en omvendt tetracyclin-reguleret transaktivator (M2rtTA) og den anden med en tetracyclin-responselement (TRE ) driver ekspressionen af ​​Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerede klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 kraftigt udtrykt med doxycyclin behandling. I mellemtiden, på grund af sin lille størrelse (100 nt), enkelte eller multiple gRNAs let kan leveres ind iCas9 hPSCs med høj effektivitet og kan direkte Cas9 for site-specifik spaltning, hvilket muliggør effektiv NHEJ-medieret gen forstyrrelser, samt HDR-medieret præcise nucleotid modifikationer i nærværelse af korte enkeltstrenget DNA (ssDNA) donor skabeloner. Den iCRISPR system kan væreanvendes med succes generere et panel af sygdomsfremkaldende efterligne hPSC linjer med biallel (homozygot eller heterozygot forbindelse) eller heterozygote tab-af-funktion-mutationer i vigtige udviklingsmæssige gener 5, 9. Mens en række grupper har rapporteret effektiv gen redigering ved hjælp CRISPR / Cas i hPSCs, succesen fortsat begrænset til et lille antal af teknologisk dygtige laboratorier. Den iCRISPR platformen tilbyder en effektiv endnu enkel løsning til rutinemæssig gen redigering af forskere fra forskellige faglige niveauer, og det er allerede blevet anvendt i en række offentliggjorte undersøgelser af vores gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilgang er også blevet yderligere udvidet til inducerbare lyddæmpning baseret på ekspressionen af dCas9-KRAB 13.

Sammen med udviklingen i genom-redigering technoer også blevet opnået logy, betydelige forbedringer i hPSC vedligeholdelse og instrueret differentiering. Dyrkningsbetingelser for hPSCs har udviklet sig fra bestrålede mus embryonale fibroblast (iMEF) feeder-afhængige til feeder-fri betingelser på definerede ekstracellulære matrix komponenter, og fra komplekse medier formuleringer til kemisk definerede medium vilkår 14. Sådanne forbedringer har reduceret variabilitet i hPSCs grundet batch-til-batch forskelle i iMEF forberedelse og knockout serum udskiftning komponenter, og dermed give en mere reproducerbar miljø for hPSC differentiering. I mellemtiden, forbedret kendskab til signalveje for humane embryonale udvikling, samt fund fra high-throughput narkotika screeninger, har ført til forbedrede differentiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokoller mere nøje efterligner i vivo udviklingsmæssige trin og generere celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. For hPSC differentiering i bugspytkirtlen afstamning, indledende protokoller efterlignede tidlige pancreas udvikling relativt godt, men til sidst genererede polyhormonal p-celler, der var af umodne føtale fænotyper og responderet dårligt til glukose stimulation. Nylige fremskridt 16, 17, 19, 20 har tilladt til generering af glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler, der vil sætte os i stand til at undersøge senere begivenheder, såsom dannelsen og den videre modning af monohormonal p-celler.

Her har vi detaljeret anvendelsen af genom-modificerede linjer for studiet af pancreas udvikling ved at kombinere iCRISPR systemet med hPSC-baserede in vitro differentiering platform mod glucose-responsive pancreatic p-lignende celler. Denne kobling af kraftfulde genom redigeringsværktøjer med en forbedret hPSC differentiering protokol tilbyder ikke kun den hastighed og omfang er nødvendige for at imødekomme den stigende efterspørgsel efter validering sygdom kausalitet, men også muliggør avancerede genetiske manipulationer for yderligere mekanistiske undersøgelser transkriptionel kontrol underliggende normal udvikling og sygdom 9 .

Protocol

Denne protokol er baseret på vores arbejde med hPSC linjer H1, HUES8, og MEL-1 i kemisk definerede og feeder-fri tilstand (se venligst Materiel og udstyr tabel). For andre hPSC linjer eller hPSCs vedligeholdes i forskellige dyrkningsbetingelser, anbefales yderligere optimering.

1. hPSC Kultur i kemisk definerede og Feeder-fri Condition

  1. Tilpas hPSC kultur på iMEF foderautomater til feeder-fri tilstand. I tilfælde, hvor frosne celler ikke overlever godt, når direkte genfundet i feeder-fri tilstand, gendanne celler i iMEF tilstand først og derefter tilpasse til feeder-fri tilstand.
    BEMÆRK: Generelt er det tager 2 passager for hPSCs dyrket på iMEF foderautomater skal tilpasses til feeder-fri tilstand.
  2. Skift medium hver dag og passage de hPSCs når cellerne har nået ~ 80% sammenflydning. Generelt passage hPSCs på ~ 1: 6 - 1:15 nøgletal hver 4 - 6 dage. Tilsæt 10 uM ROCK inhibitor Y-27632 whOr optøning eller passage af cellerne.
  3. Før podning af hPSCs, pre-coat dyrkningsskåle med 5 ug / ml (1 ml / 10 cm2) trunkeret rekombinant human form for vitronectin (VTN) i mindst 1 time ved stuetemperatur (RT). Også forberede komplet kemisk defineret medium ved tilsætning supplement til det basale medium.
  4. Fjern kulturmediet, vaskes cellerne en gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +, og behandle cellerne med 0,5 mM EDTA for ~ 2 - 5, minutter ved stuetemperatur.
  5. Aspirer EDTA før kolonierne har fritstående. Med forsigtig pipettering, dispergere hPSC kolonier i små stykker og cellerne resuspenderes i komplet medium.
  6. Saml de dissocierede hPSCs og spin ned cellerne ved 200 xg i 5 min. Resuspendere pelleterede hPSCs i det komplette medium og frø cellerne på VTN-coatede plader.

2. generation af iCas9 hPSC Lines

  1. Orden og forstærke følgende plasmider: AAVS1-Talen-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA, og AAVS1-Puro-iCas9.
    BEMÆRK: For at undgå uventede rekombination begivenheder, bruge rekombination-mangelfulde Stbl3 kompetente celler til transformation og forstærkning af plasmider ved 30 ° C.
  2. Typisk forberede hPSCs i en 10-cm skål (~ 1 x 10 7 celler, hvis ~ 80% konfluente) i en målretning eksperiment.
    BEMÆRK: Da elektroporering normalt forårsager betydelig celledød og talen-medieret gen-targeting i AAVS1 locus kræver antibiotisk selektion, skal podes at identificere korrekt målrettede celler et relativt stort antal celler. Optimering for de medikamentkoncentrationer anbefales for hver cellelinie og hver kultur tilstand.
  3. På dag -1, (dagen før elektroporering), der tilsættes 10 uM ROCK inhibitor under skift af medium.
  4. På dag 0 (dagen for elektroporering), forberede VTN-overtrukne plader i forvejen.
  5. Dissociere hPSCs i enkeltceller using 1x dissociation reagens (se venligst Materiel og udstyr tabel). Kort beskrevet fjernes dyrkningsmediet, vaske cellerne en gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +, og behandle cellerne med 1x dissociation reagens ved 37 ° C i ~ 3 min. Aspirer dissociation reagens før cellerne er fritstående. Med forsigtig pipettering, dispergere hPSCs i et enkelt-cellesuspension i 10,5 ml komplet medium.
  6. Tag 0,5 ml cellesuspension til at tælle antallet af celler under anvendelse af en automatiseret celletæller. Pelletere hPSCs ved 200 xg i 5 minutter og cellerne resuspenderes i kold (4 ° C) PBS ved 12,5 x 10 6 celler / ml.
  7. Tilsæt plasmider (se tabel 1) i 800-pi hPSC suspension (12,5 x 10 6 celler / ml) og bland godt. Overfør blandingen til en 0,4-cm elektroporation cuvette og holde på is i ~ 5 min.
  8. Elektroporere cellerne under anvendelse af et elektroporation system på 250 V og 500 pF; tidskonstanten observed efter elektroporation er typisk 9 - 13 ms.
  9. Efter elektroporering, overføre cellerne til et 15 ml konisk rør med 5 ml forvarmet komplet medium. Kritisk for en vellykket målretning: Brug sund prolifererende hPSCs og håndtere cellerne meget forsigtigt, når der overføres, opblandes og plettering cellerne efter elektroporation.
  10. Pelletere cellerne ved 200 x g i 5 min. Resuspender cellerne i 10 ml komplet medium med 10 pM ROCK inhibitor og pladen 1, 2,5 og 5 x 10 6 celler på hvert af de tre VTN-belagt, 10-cm skåle; dette sikrer, at mindst en af ​​pladerne vil have tilstrækkelige kolonier på enkelt-celle klonal densitet for koloni plukning.
  11. På dag 1 (dagen efter elektroporation), ændre mediet.
  12. På dag 2 - 5, med starte neomycin selektion når cellerne er ~ 60% sammenflydende. Skift mediet dagligt med 500 mg / ml G418 sulfat; betydelig celledød på grund selection er typisk observeres 2 dage efter G418-selektion.
  13. På dag 6, ændre medium uden antibiotisk selektion.
  14. På dag 7-9, starte puromycinselektion. Skift mediet dagligt med 1 pg / ml puromycin dihydrochlorid; betydelig celledød bør observeres den næste dag.
  15. På dag 10, begynde at ændre mediet dagligt uden antibiotisk selektion, indtil hPSC single-cellekolonier nå 1 - 2 mm i diameter.
    BEMÆRK: Typisk 50 kolonier i 10 cm skål observeret med 2,5 x 10 6 hPSCs udpladet på dag 0.
  16. Pick 12 - 24 kolonier under et stereomikroskop. Mekanisk disaggregere de hPSC kolonier i små stykker (~ 10 enheder pr koloni) med en 23-G kanyle (en 200-pi pipettespids er også fint) og overføre cellerne direkte i VTN-overtrukne plader med 24 brønde.
  17. Skift mediet dagligt, indtil cellerne bliver sammenflydende. Passage cellerne i hver brønd i 24-brønds plader iduplikatbrønde af 6-brønds plader.
  18. Når cellerne bliver konfluente i 6-brønds plader ved at bruge en brønd til en frossen stamopløsning og den anden godt for genomisk DNA-ekstraktion til yderligere karakterisering.
  19. Karakterisere og validere de etablerede iCas9 linjer ved PCR genotypebestemmelse, Southern blotting, RT-qPCR-analyse, karyotypering, og pluripotens assay. Se Zhu et al. 21 for detaljerede eksperimentelle procedurer.

3. Generation af hPSC Mutant Lines Brug af iCRISPR System

  1. Frembringelse af hPSC knockout linier
    1. gRNA design og produktion
      1. Vælg målregioner i genet af interesse for at maksimere muligheden for at forstyrre vildtype proteinfunktion. For godt kommenterede gener, vælge et målområde opstrøms af et væsentligt funktionelt domæne. Alternativt til design gRNAs målrette en region nedstrøms for startkodonen. Vælg mindst 2 forskelligeregioner for et gen af ​​interesse.
      2. Design gRNAs bruger online CRISPR design værktøj (http://crispr.mit.edu). For hvert mål region, design 3 gRNAs med lavt potentiale off-mål og bruge den med det højeste målrettet effektivitet til at generere klonal mutant linje 22.
        BEMÆRK: For at opnå høj genom redigering effektivitet, anbefales det at levere gRNA som RNA oligoer stedet for som plasmid-DNA på grund af den højere transfektionseffektivitet af små RNA'er sammenlignet med plasmider i tidligere erfaringer.
      3. Bestille 120 nukleotid (nt) DNA-oligo'er indeholdende T7-promotorsekvensen, den variable 20-nt crRNA genkendelsessekvensen (N) 20 (omfatter ikke PAM sekvens), og den konstante kimære styresekvens. Fortynd oligoerne til 100-uM stamopløsning i Hedeselskabet 2 O og forberede 250 nM som brugsopløsning.
        BEMÆRK: TAATACGACTCACTATAGGG (N) 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplifikation oligoerne ved hjælp af T7F og TracrR primere (se tabel 2) til fremstilling af den dobbeltstrengede DNA (dsDNA) skabelon til gRNA in vitro transkription (IVT). Brug 50 pi PCR-reaktionsblanding (se tabel 3) og PCR-cyklus betingelser (se tabel 4).
      5. Brug et højt udbytte T7 transkription kit til in vitro gRNA transkription med PCR-amplificeret skabelon i 20 pi in vitro gRNA transkription mix (se tabel 5) i henhold til fabrikantens anvisninger. Rense gRNA produkter ved hjælp af transkription oprydning kit i henhold til fabrikantens anvisninger.
      6. Eluer gRNAs efter high-throughput oprensning protokol som ifølge producentens instruktioner (typisk -50 - 100 ug) i 100 pi elueringspuffer. Juster koncentrationen til 320 ng / uL (10 uM) når det er muligt og opbevares ved -80 &# 176; C indtil anvendelse.
    2. PCR og Sanger-sekventering primer design
      1. Design og validere PCR-primere amplificerer målregionen, med produktstørrelser typisk fra ~ 500 - 1.000 bp.
      2. Design Sanger sekventeringsprimere bindende internt til PCR-produkterne for at tillade direkte sekventering af PCR-produkterne uden oprensning.
    3. gRNA transfektion i iCas9 hPSCs
      1. På dag -1, behandle iCas9 celler med 2 mg / ml doxycyclin 24 timer før gRNA transfektion.
      2. På dag 0 af gRNA transfektion, forberede VTN-overtrukne plader i forvejen.
      3. Dissociere iCas9 celler i enkelte celler under anvendelse 1x dissociation reagens, som beskrevet i trin 2.5.
      4. Pelletere hPSCs ved 200 xg i 5 min og resuspender cellerne ved ~ 0,5 x 10 6 celler / ml i komplet medium suppleret med 2 ug / ml doxycyclin og 10 uM ROCK inhibitor. Plade 0,5 ml af de resuspenderede celler i individuelle brønde i 24-brønds plader. Fremstilling af yderligere brønde til at fungere som ikke-transficerede kontroller.
      5. For hver gRNA, foretage følgende transfektion blandinger: Bland A, 50 pi reduceret serum medium + 1 pi gRNA (10 uM); Mix B, 50 pi reduceret serummedium + 3 pi transfektionsreagens.
      6. Kombiner Mix A og B for at gøre blandingen 100 pi. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 50 pi af blandingen til celler i dobbelte brønde i 24-brønds plader og bland godt.
      7. På dag 1, udføre en anden transfektion hvis det er nødvendigt for yderligere at øge det målsøgende effektivitet. Ellers ændre medium uden doxycyclin.
      8. På dag 2 - 3 ændre mediet dagligt.
      9. På dag 4, ekstrahere genomisk DNA fra en brønd af hver transficerede og ikke-transficerede kontrolcelle anvendelse af et DNA-ekstraktion kit. Juster koncentrationen til 50 ng / μL.
      10. PCR-amplifikation af målregioner flankerer sekvenser gRNA målretning og anslå redigering effektivitet anvendelse af T7 endonuclease I (T7EI) fordøjelse eller restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP) analyse, som tidligere 5 beskrevet.
    4. T7EI assay
      1. PCR-amplificere målområdet under anvendelse af primere designet og valideret i trin 3.1.
      2. Forbered blandinger (se tabel 6) og udfører DNA denaturering og hybridisering af PCR-produkterne under anvendelse af betingelser, der er skitseret i tabel 7.
        BEMÆRK: Baseret på vores erfaringer, er det generelt ikke nødvendigt at rense PCR-produkter til T7EI analysen, når du bruger vores PCR tilstand. Imidlertid oprensning kunne være gavnlig i andre forhold.
      3. Udfør en T7EI fordøjelse ved 37 ° C i 30 minutter under anvendelse af 10 pi af denatureret og hybridiseret PCR-produkt og 0,2 pi (2 U) T7E1 (10 U / ul).
      4. resolve de T7E1-fordøjede PCR-prøver ved gelelektroforese. Brug ImageJ at bestemme de relative band intensiteter af klip og uklippet DNA. Beregn Indel frekvens ved hjælp af formlen: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, hvor a er intensiteten af ufordøjet PCR-produkt og b og c er intensiteterne af T7E1-spaltede produkter.
    5. RFLP-analysen
      BEMÆRK: I tilfælde, hvor en begrænsning websted er i umiddelbar nærhed (<5 bp) til et Cas9 kløvningssted (3 bp 5 'af PAM sekvens), kan en RFLP analyse udføres for at kvantificere Indel frekvens.
      1. Brug de samme PCR-produkter som beskrevet i trin 3.1.4.1.
      2. Fordøje PCR produkt med et restriktionsenzym, som indeholder et restriktionssted i umiddelbar nærhed af Cas9 spaltningsstedet.
      3. De nedbrudte PCR prøver ved gelelektroforese. Brug ImageJ at bestemme de relative band intensiteter af klip og uklippet DNA. Beregn Indelfrekvens ved hjælp af formlen: a / (a + b + c) x 100, hvor a er intensiteten af ufordøjet PCR-produkt og b og c er intensiteterne af de spaltede produkter.
    6. Etablering af klonale mutant linjer
      BEMÆRK: Genome redigering i hPSCs bruger iCRISPR systemet med gRNA transfektion er yderst effektiv, og der ikke er behov antibiotisk selektion. At etablere klonale linjer, er det nødvendigt at frø celler ved en relativ lav densitet for at sikre dannelsen af ​​enkelt-celle-afledte kolonier.
      1. Identificer gRNAs med den højeste redigering effektivitet (ved hjælp af T7EI eller RFLP assay) og med god celle overlevelse. Brug den tilsvarende to eksemplarer godt for klonal mutant linje etablering.
      2. Dissociere hPSCs i en enkelt-cellesuspension under anvendelse 1x dissociation reagens, som beskrevet i trin 2.5. Replate 500, 1000, og 2000 celler på hver af de tre VTN-belagt, 10-cm skåle.
      3. Skift medium daglige until enkelt-celle kolonier nå ~ 2 mm i diameter.
      4. Pick 24 - 48 kolonier for hver gRNA, afhængigt estimeringen af ​​målretning effektiviteten af ​​T7EI og / eller RFLP-assay. Mekanisk disaggregere hver koloni i små stykker (~ 10 enheder pr koloni) med en 23-G kanyle (en 200-pi pipettespids er også fint) og replate cellerne i dobbelte VTN-overtrukne, 96-brønds plader. Brug en plade til genomisk DNA-ekstraktion og Sanger sekventering og den anden plade for yderligere ekspansion.
      5. Når cellerne i plader med 96 brønde er blevet sammenflydende, ekstrahere det genomiske DNA (uden phenol / chloroform-ekstraktion) ved anvendelse af en simpel protokol, som beskrevet nedenfor.
      6. Fjern mediet og vask cellerne en gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +. Tilsæt 50 pi lyseringspuffer (5 pi proteinase K (10 mg / ml), 5 pi PCR-buffer 10x, og 40 pi Hedeselskabet 2 O) til hver brønd i en plade med 96 brønde. Forsegle skiltet ved anvendelse af en klæbende film og INCUBAte natten over ved 55 ° C.
      7. Den næste dag, overføre cellelysaterne i en 96-brønds PCR-plade og inkuberes i 10 minutter ved 99 ° C i en thermocycler at inaktivere proteinase K.
      8. PCR-amplificere målområdet under anvendelse af de samme primere som ved T7EI eller RFLP-assay under anvendelse af 1 pi cellelysat som skabelon.
      9. Brug 1 pi af PCR-produktet for Sanger-sekventering med en primer binding internt til PCR-produktet.
      10. Forstærk klonerne med rammeskift InDel mutationer for frosne bestande. Også amplificere et par vildtype-kloner fra den samme targeting eksperiment for at tjene som isogene styreledninger til yderligere eksperimenter.
  2. Frembringelse af mutante linjer med præcise nukleotidændringer
    BEMÆRK: I forhold til knockout-mutanter genereret af non-homolog ende sammenføjning (NHEJ), kan præcis nukleotid ændring opnås gennem homologi-dirigeret reparation (HDR) i nærvær af DNA repair skabeloner. Sådanne præcise nukleotidændringer muliggør generering af patient-specifikke mutationer i vildtype-hPSCs og for korrektion af mutationer i patient-afledt iPSCs.
    1. Design af ssDNA som et HDR skabelon
      1. Design og producere 2 - 3 gRNAs tæt på en patient-specifik mutation, som beskrevet i trin 3.1.1.
      2. Design en enkeltstrenget DNA (ssDNA) indeholdende patienten-specifik mutation flankeret af -40 - 80 nt af homologi på hver side som et HDR skabelon.
      3. For at reducere yderligere skæring efter den korrekte reparation, indføre en stum mutation til ssDNA template i området inden for gRNA genkendelsessekvensen og i tæt nærhed til PAM sekvens eller i PAM-sekvensen selv, hvis det er muligt.
      4. Hvis det er muligt, designe den tavse mutation til at indføre et hidtil ukendt restriktionsspaltning site samt så det kan anvendes til at estimere reparationen effektivitet ved anvendelse af RFLP-assayet.
      2. GRNA / ssDNA co-transfektion og etablering af klonede linier
      1. Udfør co-transfektion af gRNA / ssDNA ind iCas9 celler, som beskrevet i trin 3.1.3, med transfektions- blandingerne A og B. For hver gRNA og ikke-transficeret kontrol, transficere cellerne i dobbelte brønde i plader med 24 brønde. Bland A: 50 pi reduceret serum medium + 1 pi gRNA (10 uM) + 2 pi ssDNA (10 uM). Mix B: 50 pi reduceret serummedium + 3 pi transfektionsreagens.
      2. Efter transfektion ekstrahere genomisk DNA fra en brønd af hver transficerede og ikke-transficerede kontrolcelle og anslå reparation effektivitet ved hjælp af T7EI og / eller RFLP-assay.
      3. Identificer gRNA / ssDNA blanding med den højeste reparation effektivitet og god celle overlevelse. Brug den tilsvarende to eksemplarer godt for klonal mutant linje etablering.
      4. Pick 48 - 96 kolonier, afhængigt af estimeringen af ​​den målsøgende effektiviteten af ​​T7EI og / eller RFLP røvay. Generelt effektivitet HDR-medieret mutation er lavere end knockout mutation og dermed flere kolonier skal plukkes.
      5. Sequence, udvide, og validere klonale linjer, som beskrevet i trin 3.1.6.

4. In vitro hPSC Differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-celler

BEMÆRK: In vitro differentiering af hPSC mutanter i sygdoms-relevant celletyper giver en platform for sygdom modellering i et fad. Følgende protokol fokuserer på in vitro differentiering af hPSCs til glucose-responsive pankreatiske p-celler til pancreas udviklingsmæssige og diabetesforsøgene 9, 16, 17.

  1. hPSC differentiering til endelig endoderm
    1. Opretholde hPSC mutanter og vildtype-kontrol linjer i kemisk defineret og feeder-fri tilstand, som beskriverd i trin 1.
    2. For at forberede de hPSCs for differentiering, dissociere hPSCs bruger 1x dissociation reagens og sprede dem i single-celle suspension i komplet medium.
    3. Pelletere cellerne ved 200 xg i 5 minutter og genopslæmmes cellerne i komplet medium med 10 pM ROCK inhibitor. Tæl celleantal og frø cellerne ved ~ 1,4 x 10 5 celler / cm2 på VTN-coatede plader.
    4. Skift mediet 24 timer efter podning.
    5. På dag 0, starte differentieringen efter 48 timer, når cellerne har nået ~ 80% sammenflydning.
      BEMÆRK: For at opnå høj bugspytkirtlen differentiering effektivitet, optimere seeding tæthed og niveau af konfluens ved 48 h anbefales til hver enkelt linje.
    6. Aspirer hPSC medium og skyl cellerne én gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
    7. Skift mellemlang til differentiering dag 0 (d0) medium.
    8. På dag 1 - 2, ændre differentiation medium dagligt, ifølge opskrifterne i tabel 8.
    9. På dag 3, undersøge de endelige endoderm markører SOX17, FOXA2, og CXCR4 ved immunfluorescensfarvning og flowcytometri analyse.
  2. Definitive endoderm differentiering til pancreasstamfadercelle
    1. På dag 3 - 9 fortsætte definitiv endoderm differentiering mod pancreatisk afstamning ved at ændre mediet dagligt, ifølge opskrifterne i tabel 9.
    2. På dag 7, undersøger den tidlige pancreas progenitor (PP1) markering PDX1 ved immunfluorescensfarvning og flowcytometri-analyse.
    3. På dag 10, undersøger senere i bugspytkirtlen stamfader (PP2) markører PDX1 og NKX6.1. Mellemtiden forbereder at overføre PP2 celler til luft-væske-grænseflade til yderligere differentiering til pankreatiske endokrine celler.
  3. Pancreas endokrine afvigerentiering i luft-væske-grænsefladen
    1. Behandl de PP2 celler med 10 pM ROCK inhibitor 4 timer før dissociering.
    2. Fjern mediet og skyl cellerne gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
    3. Tilsæt 2 ml 1x dissociation reagens til PP2 celler i en 10 cm skål og inkuberes ved 37 ° C til 2 - 3 min.
    4. Aspirer dissociation reagens før cellerne er fritstående. Der tilsættes 10 ml Blar mellemstore og sprede PP2 celler i enkelte celler ved forsigtigt at pipettere op og ned.
    5. Opsaml enkelt-cellesuspension. Tæl celle nummer og pellet ved 200 xg i 5 min.
    6. Resuspender cellepelleten ved ~ 0,5 x 10 5 celler / pi i S5 differentiering medium og spot 5 - 10 pi celler pr plet på en transwell indsatsfilterholderen. Placer 10 - 15 pletter i en 6-brønds insert og ~ 100 spots i 10 cm sættes.
    7. Tilføj S5 medium til bunden af ​​hver transwell insert, ~ 1,5 ml i 6-brønds skær og ~ 8 ml feller 10-cm skær.
    8. Skift mediet dagligt med opskrifter i tabel 10.
    9. Undersøg pancreas endokrine markører PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insulin og glucagon på dag 34 ved immunfluorescensfarvning og flowcytometri analyse 17.
    10. Undersøg hPSC-afledte β-lignende cellefunktion med en glukose-stimuleret insulinsekretion (GSIS) assay 16 17.

Representative Results

hPSC kemisk definerede og Feeder-fri kultur Tilpasning og vedligeholdelse

hPSCs dyrket på iMEF foderautomater hurtigt kan tilpasses til VTN-coatede plader i feeder-fri kultur tilstand. Den samme opdeling forhold som normal iMEF feeder kultur kan anvendes under tilpasning. Figur 1A viser typiske morfologier af hPSCs på iMEF foderautomater i KSR-baserede medium og på en VTN-overflade i feeder-frit medium. Figur 1B viser en typisk morfologisk forandring og vækst af hPSC kolonier i løbet af første passage af tilpasningsstrategier (4 dage). Cellerne kan yderligere dyrket i flere passager eller fryses til fremtidige eksperimenter. Udføre 2 - 3 passager af tilpasning kultur, før du starter differentiering eksperimenter. Karyotyping anbefales også efter tilpasning, selv om vi ikke har observeret karyotype abnormiteter under tilpasning fase.

"Fo: holde-together.within-side =" 1 "> Generation of iCas9 hPSC Lines gennem Talen-medieret AAVS1 Målretning

Som tidligere vist, blev hPSCs elektroporeret med et par AAVS1 Talen plasmider og Cas9 og M2rtTA plasmider 5. Figur 2A og B viser detaljeret donorvektor målretning design og hele proceduren for at generere iCas9 hPSC klonale linjer. Efter antibiotisk udvælgelse, encellede-afledte kloner, der udviser tilstrækkelig størrelse og typiske hPSC morfologi var klar til at blive plukket (10 - 12 dage efter elektroporering, figur 2C). Normalt ~ 50% af klonerne er korrekt målrettet uden tilfældige integrationer, som verificeret ved Southern blotting (figur 2D) 5. Vilkårlig integration kan forårsage utætte ekspression af Cas9 i fravær af doxycyclin behandling.

Effektiv Genetisk MNDRING i hPSCs Brug af iCRISPR Platform

I etablerede iCas9 hPSCs er Cas9 udtrykkes med doxycyclin behandling og guidet til sit mål locus af de transfekterede gRNAs, hvor det genererer DSBs. I mangel af en reparation skabelon, DNA-reparation via NHEJ genererer indels, som ofte resulterer i gen afbrydelse eller knockout. I nærvær af en reparation skabelon (fx et ssDNA donor), kan HDR anvendes til præcise genetiske ændringer, såsom generering af en patient-specifik mutation i en vildtype hPSC baggrund eller korrigere en sygdom-associeret genetisk variant i patient- afledte iPSCs (figur 3A). Det tager ~ 1 måned til frembringelse klonale mutante linjer ved hjælp af iCRISPR systemet. Efter iCas9 induktion og gRNA transfektion, T7EI og / eller RFLP-assays blev anvendt til at vurdere Cas9 skæreeffektivitet, og de transficerede celler blev senere podet som enkelte celler i 10 cm skåle ved lav densitet (-500 - 2, 000celler / 10-cm skål). 10 - 12 dage senere blev enkelt-celle-afledte kloner anbragt i brøndene på en 96-brønds plade til ekspansion og yderligere karakterisering (dvs. genotypebestemmelse og Western blotting) (figur 3B). Da iCRISPR-medieret gen-knockout er højeffektive, er ingen udvælgelsesproces involveret, og normalt på 20 - 50% biallele mutanter kan let opnås (figur 3C) 5. For effektive og præcise genetiske ændringer, er gRNAs co-transficeret med et ssDNA donor bærer den specifikke sekvens ændring (for en lille, men bestemt ændring af genomsekvens). Ofte, at forhindre en ny skæring i modificerede alleler, anbefales det at indbefatte en tavs mutation i umiddelbar nærhed af eller i PAM-sekvensen (figur 3D). Med dette system ~ 10% af kloner, der bærer den ønskede HDR-medieret genom modificering uden yderligere ændringer i begge alleler opnås (figur 3E). Den hurtige og precise modifikation af hPSC genom ved hjælp af iCRISPR platform giver os mulighed for hurtigt og effektivt at gøre hPSC linjer, der tjener som modeller for forskning i menneskers udvikling og sygdom.

Effektiv Differentiering af hPSCs mod Glukose-responsive p-lignende celler

Nylige fremskridt i hPSC pancreas differentiering har muliggjort udviklingen af ​​protokoller, der nøje rekapitule- bugspytkirtlen fosterudvikling. Udifferentierede hPSCs første differentieret til den endelige endoderm, derefter ind PDX1 + tidlige pancreas progenitorer (PP1) og PDX1 + NKX6.1 + senere pancreasstamfaderceller (PP2), og endelig til glucose-responsive β-lignende celler 16, 17, 19, 20 , 23, 24. Disse protocoler blev yderligere optimeret til pålideligt generere PDX1 + NKX6.1 + pancreas progenitorer og glucose-responsive p-lignende celler 9. Figur 4A viser de detaljerede kemiske kosttilskud anvendes på hvert trin af differentiering. Normalt ~ 80% sammenflydning 2 dage efter den indledende celleudpladning er ideelle til at starte differentieringen af HUES8 hPSCs (figur 4B). Test flere forskellige seeding tætheder anbefales stærkt at opdage den optimerede betingelse for hver specifik cellelinje. Sædvanligvis mindst 75% FOXA2 + SOX17 kan opnås + -celler på de Stage og 40% PDX1 + NKX6.1 + celler på PP2 stadium (figur 4C). På S5 stadium, tilstedeværelsen af en aura-lignende form omkring celleaggregatet er en indikator for den gode cellernes overlevelse, hvilket er vigtigt for yderligere differentiering til NKX6.1 + CPEP + glucose-responsive p-lignende celler (figur 4D ). Denne protokol er nyttig til at studere menneskets bugspytkirtel d dvikling og sygdom i en skål.

figur 1
Figur 1. hPSC kemisk definerede og Feeder-fri vedligeholdelse og Kultur Tilpasning fra iMEF Feeders. (A) Repræsentative billeder af hPSCs dyrket på iMEF arkføder eller på VTN på dag 4, klar til at blive delt. (B) Typisk morfologi hPSCs under den første passage af tilpasning i feeder-fri kultur fra en iMEF arkføder. Dag 4 hPSCs dyrket på iMEF foderautomater blev splittet og udsået på VTN-overtrukne plader i kemisk defineret medium med ROCK-hæmmer. Opdelingen forholdet var den samme som den sædvanlige opdeling ratio for dyrkning i iMEF feeder betingelser. Mediet blev skiftet hver dag uden ROCK inhibitor. Klik her for at se en større version af dette tal.

ve_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2. generation af iCas9 hPSC Lines. (A) Målretning strategi til generering af iCas9 hPSC linjer. Puro-Cas9 donor og Neo-M2rtTA donor var rettet i den menneskelige AAVS1 locus af et par AAVS1 Talens. (B) Skematisk af hele targeting processen, herunder elektroporation, antibiotisk udvælgelse, koloni plukning og ekspansion, og cellelinie karakterisering. (C) repræsentant single-celleklon klar til at blive plukket på omkring 10 - 12 dage efter elektroporering. (D) Southern blot eksempler til identifikation korrekt målrettede kloner uden yderligere integration af to donorplasmider. Korrekte kloner er markeret med rødt. (A) og (D) blev tilpasset fra reference 5, med tilladelse.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Effektiv genetiske modifikation i hPSCs Brug af iCRISPR System. (A) Skematisk til generering af gen-knockout mutanter eller præcise genetiske modifikation under anvendelse af iCRISPR systemet. (B) målretning procedure og klonal linje etablering. (C) Gene knockout effektivitet gennem NHEJ i hPSCs 9. (D) Design af et ssDNA bærer en specifik nukleotid modifikation. P, i rødt: patient-specifik mutation; X, i grøn: tavs mutation. (E) Effektivitet af HDR-medierede præcis nukleotid modifikation. En præcis R456C mutation (forårsaget af en bestemt nukleotid C> T mutation) i GATA6 locus blev indført ved hjælp af iCRISPR systemet.(Se Referencer 5 for mere detaljerede oplysninger). (C) og (E) blev tilpasset fra reference 9 og reference 5, henholdsvis med tilladelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Directed hPSC Differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler. (A) Skematisk af den detaljerede differentiering protokol, med kemikalier suppleres på hvert trin af differentiering. Signalveje, der aktiveres eller hæmmede under differentiering er markeret med grønt eller rødt, hhv. CHIR: GSK3 inhibitor; GDF8: vækst differentiering faktor 8 eller myostatin, en TGF-beta protein familiemedlem; HH: Pindsvin; DE: Definitive endoderm; PP1:PDX1 + tidlig pancreasstamfadercelle; PP2: PDX1 + NKX6.1 + senere pancreasstamfadercelle. (B) Typisk sammenflydning (70 - med 80%) af hPSCs 48 timer efter såning når de er klar til differentiering indvielse. (C) Repræsentative immunfluorescensfarvning billeder, der viser den vellykkede differentiering i den endelige endoderm (DE) fase (FOXA2 og SOX17 co-farvning), pancreas progenitor etape (PP2: PDX1 og NKX6.1 co-farvning), og glucose-responsive β- lignende celle stadiet (NKX6.1 og C-peptid co-farvning). Generelt, for at opnå mere end 10% NKX6.1 + CPEP + -celler ved β-lignende celle stadiet, mindst 75% FOXA2 + SOX17 + de celler og 40% PDX1 + NKX6.1 + PP2 celler afkræves ved de tilsvarende faser. (D) Typisk morfologi af en celle samlet efter S5 fase på en insert filtermembran i air-væske-grænsefladen kultur. De overlevende celler har migreret til midten af ​​aggregatet (i mørke) og efterladt en aura-lignende struktur på kanten. (A (D) blev tilpasset fra reference 9 med tilladelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Plasmid Beløb
AAVS1-Talen-L 5 ug
AAVS1-Talen-R 5 ug
AAVS1-Puro-iCas9 40 ug
AAVS1-Neo-M2rtTA 40 ug

tabel 1

Primer sekvens
T7F TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR AAAAGCACCGACTCGGTGCC

tabel 2

tabel 3

Komponent Beløb
Hedeselskabet 2 O 35,5 uL
5x PCR reaktion buffer 10 pi
dNTP-blanding (25 mM) 0,5 uL
T7F (10 uM) 1,25 uL
TracrR (10 uM) 1,25 uL
T7-gRNA IVT skabelon (250 nM) 1 pi
DNA-polymerase 0,5 uL
Total PCR-reaktionsblandingen 50 pi
PCR cykelforhold
cyklusnummer denaturere anneal Forlænge
1 94 ºC, 2 min
2-31 94 ºC, 20 s 60 ºC, 20 s 72 ºC, 1 min
32 72 ºC, 2 min

tabel 4

Komponent
T7 ATP 2 uL
T7 CTP 2 uL
T7 GTP 2 uL
T7 UTP 2 uL
T7 10x buffer 2 uL
T7 enzymblanding 2 uL
PCR amplificeret skabelon 8 pi
Total in vitro gRNA transkription mix 20 pi
Der inkuberes ved 37 ºC i 6 timer til natten over

tabel 5

Komponent Mængde (pi)
Uoprenset PCR-produkt 8 Buffer 2 10x 2
Destilleret vand (dH 2 O) 10

tabel 6

DNA denaturering og hybridisering cykelforhold
Temperatur Varighed thermocycler betingelser
95 ° C 10 min
85 ° C 1 min Rampe til 85 ° C ved 2 ° C / s
75 ° C 1 min Rampe til 75 ° C ved 0,3 ° C / s
65 ° C 1 min Rampe til 65 ° C ved 0,3 ° C / s
55 ° C </ Td> 1 min Rampe til 55 ° C ved 0,3 ° C / s
45 ° C 1 min Rampe til 45 ° C ved 0,3 ° C / s
35 ° C 1 min Rampe til 35 ° C ved 0,3 ° C / s
25 ° C 1 min Rampe til 25 ° C ved 0,3 ° C / s
4 ° C Holde

tabel 7

Scene Dag Medier Supplement
S1 d0 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99.021
3 uM
d1 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99.021
0,3 uM
d2 S1 GDF8
100 ng / ml
S1 medier: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glucose

tabel 8

S3
Scene Dag Medier Supplement
S2 d3-d4 S1 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		IWP-2
2,5 uM
d5-d6 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		SANT-1
0,25 uM 		RA
1 uM 		LDN
100 nM 		TPB
200 nM 		ITS-X
1: 200
S4 d7-d9 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
2 ng / ml 		SANT-1
0,25 uM 		RA
0,1 pm 		LDN
200 nM 		TPB
100 nM 		ITS-X
1: 200 		IWP-2
2,5 uM
S3 medier: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glucose

tabel 9

Scene Dag Medier Supplement
S5 d10-d12 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM SANT-1 0,25 uM RA 0,05 pm LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S6 D13-st D19 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM GSiXX 100 nM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S7 d20- D33 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM N-Cys 1 mM Trolox 10 uM R428 2 uM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S5 medier: Blar + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM glucose

tabel 10

Discussion

Tid Overvejelser til generering Mutant Lines

Selv om de seneste metoder baseret på CRISPR / Cas-systemer til genom-redigering har ført til vellykket målretning, vil en mere effektiv og universel platform være at foretrække for større skala analyser af gen-funktion. Den iCRISPR platformen tilbyder en hurtig og effektiv metode til at introducere mutationer ethvert gen af interesse 5, 9. For det første PCR-baserede gRNA syntese metode tillader produktionen af ​​hundredvis af gRNAs i klædt format på én dag uden tidskrævende kloningstrin. Sekund, med doxycyclin-inducerbar Cas9 ekspression i iCas9 hPSCs, det trin, der involverer gRNA transfektion kræver kun en minimal mængde arbejde og således kan udføres flere gRNA eksperimenter rettet mod samtidigt. Tredje, på grund af den høje målretning effektiviteter opnåelige med vores system, analysen af ​​~ 24 - 48 kolonier pr gRNA transficeret bør være sufficient at etablere flere monoallelisk og biallele mutante linjer for et enkelt gen, selvom effektivitet varierer afhængigt af mållocuset. Da det er muligt for en uddannet person til mekanisk at gå 384 kolonier (4 x 96-brønds plader) i et møde, som bør tage ~ 4 timer under et dissektionsmikroskop, kan en uddannet person forventes at generere mutante linjer påvirkede 12 gener i 12 måneder. Den strømlinede generation af hPSC mutanter på kort tid giver mulighed for systematisk analyse af et array af transkriptionsfaktorer og / eller signalvejen komponenter, der interagerer med hinanden, regulering udviklingsprocessen 9. Derudover effektiv multiplex gen targeting åbner også døren for at undersøge genetiske interaktioner underliggende komplekse menneskelige træk.

Generation af præcise genetiske modifikationer

Udledningen af ​​patient-specifikke iPSCs fra let tilgængelige somatiske celletype s og differentiering i sygdoms-relevant celletyper giver en stor mulighed for den funktionelle validering af sygdom-associerede mutationer. Men på grund af den betydelige variation i genetisk baggrund mellem individer, direkte sammenligninger mellem iPSCs fra patienter og fra raske donorer kan ikke tillader en at skelne sygdomsfænotyper fra baggrundseffekter. Derfor er det nødvendigt at generere isogene kontrol iPSCs ved at korrigere sygdomsmutationen tilbage til vildtypesekvensen eller at indføre de patientspecifikke mutationer i en vildtype hPSC baggrund, som foreslået af andre 25, 26. Ud over tab af funktion (null) mutationer, kan man nu mere præcist dissekere sygdomsmekanismer ved indførelse af en patient-specifikke sekvensændringer i det endogene locus i hPSCs, herunder hypermorphic, hypomorphic, neomorphic eller dominant-negative patient mutationer.

ntent "> Præcis genetisk modifikation anvender HDR for DSB-reparation i nærværelse af en reparation skabelon. Da det er meget mindre effektiv end NHEJ-medieret DNA-reparation, en donor plasmid indeholdende patient-specifik mutation, et udvalg medikamentkassetten, og homologiarme tidligere har været anvendt som reparationen template to. Efter udvælgelse narkotika og kontrol af patienten-specifik mutation, er et andet trin generelt nødvendig for at fjerne markeringen narkotika kassette. Mens de mest udbredte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer efterlade resterende sekvens i det endogene locus har anvendelsen af piggyBac transposon tilladt for den sømløse fjernelse af lægemiddel-selektion kassetten 27. for nylig korte ssDNA-skabeloner har også vist sig at understøtte effektiv HDR med konstruerede DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donorplasmid , ssDNA direkte kan syntetiseres og omgår således tidskrævende kloningstrin. Her har det væreOr vist, at ved co-transfektion af gRNA og en ssDNA template til at inducere homologi-dirigeret reparation, kan iCRISPR anvendes til at indføre specifikke nucleotid modifikationer med høj effektivitet. Dette er kritisk for ikke kun dissecting rolle essentielle nukleotider inden protein- funktionelle domæner, men også til modellering humane sygdomstilstande mutationer og potentielt korrigere disse sygdomsassocierede mutationer for terapeutisk intervention. På grund af det store antal modtagelighed loci, der hver er forbundet med flere sekvensvarianter, modellering komplekse og multigenic sygdomme som diabetes har været en udfordring for genetikere. Da iCRISPR platformen er eftergivende for en hurtig generering af en allel serie eller for multiplexable gen targeting, kan det lette efterforskningen af ​​multiple sygdom-associeret loci, enten individuelt eller i kombination med isogene baggrunde.

Målretning effektivitet og Off-target effekter

Vi har fundet en god sammenhæng mellem T7E1 og RFLP analyseresultater og antallet af mutant linjer identificeret ved sekventering. Dette understreger vigtigheden af ​​at udføre disse assays parallelt med etableringen af ​​klonale linjer. Mens målretning effektiviteter opnås, kan variere afhængigt af den genomiske loci, i de fleste single-gen-targeting eksperimenter, 20 - blev 60% af klonerne fundet med begge alleler muteret (herunder i ramme og læserammeforskydningsmutationer) 9. I tilfælde, hvor multiplex gen targeting blev udført, blev tredobbelt biallele mutant kloner med 5-10% effektivitet opnået fem. ssDNA-medieret HDR af flere gener blev også udført for at opnå præcise genetiske ændringer, med effektivitetsgevinster for at opnå homozygot knock-i kloner fra 1 - 10% 5. Arbejde med CRISPR / Cas i hPSCs eventuelle mutationer i potentielle off-target sites, der ikke deler den samme gRNA target sekvens endnu ikke opdagetlass = "xref"> 5, 9, 12. Whole-genom sekventering udført i en nylig undersøgelse har også undladt at identificere væsentlige off-target-mutationer i klonede hPSC linier genereres ved hjælp af CRISPR / Cas 29. Ikke desto mindre, at minimere enhver potentiel effekt af confounding fænotyper indført ved mutationer ved off-target effekt sites, foreslås det at generere uafhængige mutant linjer ved hjælp af mindst to uafhængige gRNAs målrettet forskellige sekvenser inden for samme gen. Lignende fænotyper observeret i flere linjer frembragt ved anvendelse af forskellige gRNAs kunne hovedsagelig udelukke muligheden for, at fænotypen kommer fra en off-target effekt.

Feeder-afhængige versus Uafhængig Kultur og målretning

Traditionelle metoder til hPSC kultur involverer deres vedligeholdelse og ekspansion på feeder-celler i medier, der indeholder serum eller serum udskiftning, der omfatter dyr proddukter, såsom bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum udskiftning, og albumin alle indeholder komplekse, udefinerede komponenter og viser betydelig batch variation. Tilpasning til feeder-fri og kemisk definerede tilstand reducerer indsatsen for hPSC vedligeholdelse og, endnu vigtigere, øger konsistensen af ​​differentiering eksperimenter. På nuværende tidspunkt er der meget få undersøgelser, der beskriver genom redigering procedurer på hPSCs dyrket i fuldt definerede dyrkningsbetingelser 30. Vi har fundet højere CRISPR målretning effektiviteter når gRNA transfektion og klonal aflejring blev udført i fødefri betingelser sammenlignet med feeder-afhængig dyrkningsbetingelser. Vi mener, at dette skyldes øget overlevelse celle efter transfektion og enkeltstrenget cellepodning for kolonidannelse. Desuden har fødeceller tidligere vist sig at sekvestrere transfektionsreagenser, derved sænke transfektionseffektiviteten.

KombinationGenome Redigering med Directed Differentiering

Tidligere differentiering protokoller har givet kun en lille brøkdel af insulin-positive celler, hvoraf størstedelen var polyhormonal og lignede føtale endokrine celler 23. Nylige fremskridt har muliggjort differentiering af hPSCs til mere modne glucose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemæssigt opnå mindst 75% endelige endoderm celler, 40% Pdx1 + NKX6.1 + pancreas stamceller og omkring 20% NKX6.1 + CPEP + glucose-responsive beta-lignende celler under anvendelse HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med den iCRISPR genom redigering system, har det mere robust differentiering protokol lettet analysen af ​​transkriptionsfaktorer, der er afgørende for de pancreasstamfaderceller og endokrine stadier af bugspytkirtlen differentiering. Dette vil gøredet muligt, i fremtidige studier, for at undersøge et stort antal kandidat sygdomsgener for funktionelle validering og undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for diabetes 9.

Fremtidige Programmer eller vejvisning

Vores iCRISPR systemet kan lette dannelsen af mere komplekse genomiske modifikationer, såsom skabelse af reporter alleler gennem HDR-medieret gen-targeting under anvendelse lange donor-DNA skabeloner indkoder protein tags eller fluorescerende reportere 12. Vi har vist, at på grund af den høje CRISPR målretning virkningsgrader opnået i systemet, kan denne proces udføres i hPSCs, uden behov for yderligere lægemiddelselektion 12. Endvidere kan multipleksede gen-targeting anvendes til at undersøge genetisk samspil underliggende kompleks menneskelig sygdom som vist i vores nyere undersøgelse, som vi mener er det første eksempel på et sådant arbejde 31. ICRISPR kan også anvendes til at forstå genregulatorisk Ved at oprette deletioner enten i ikke-kodende RNA'er eller i gen-regulatoriske regioner, såsom promotorer og enhancere. Til effektivt at generere regulatoriske mutanter under anvendelse iCRISPR, kan gRNAs designes til at forstyrre bindingsstedet af et DNA-bindende protein, herunder, men ikke begrænset til det basale transkriptionelle maskineri eller en vævsspecifik transskriptionsfaktor. ssDNA template-medieret HDR kan også anvendes til at mutere specifikke proteinbindingssteder. Endelig har vi forestiller at yderligere optimering ville muliggøre brugen af iCRISPR platform i hPSCs for højere gennemløb genetiske analyser af pluripotens fænotyper eller sygdomstilstande fænotyper, når de kombineres med en in vitro differentiering protokol. Disse iCRISPR-medierede undersøgelser kan give mulighed for en hurtigere identifikation af kandidat sygdom-associerede gener og undersøgelser af deres funktionelle relevans.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ blev støttet af NYSTEM postdoc stipendium fra Center for Stamcelleforskning Biology af Sloan Kettering Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemically defined medium (E8) Thermo Fisher Scientific A1517001 Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included
Truncated recombinant human form of vitronectin Thermo Fisher Scientific A14700
ROCK inhibitor Y-27632 Selleck Chemicals S1049
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563029 1x, animal origin free, recombinant enzyme
G418 Sulfate Thermo Fisher Scientific 10131035 Geneticin Selective Antibiotic
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P8833 Puromycin Selective Antibiotic
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) Agilent Technologies 600679 PCR kit
MEGAshortscript T7 Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1354
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
Opti-MEM medium Thermo Fisher Scientific 31985062 Reduced Serum Medium
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778150
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN 69504 Genomic DNA extraction kit
Proteinase K Roche 3115879001
MCDB 131 medium Thermo Fisher Scientific 10372-019
BLAR medium Thermo Fisher Scientific Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)
L-glutamine supplement (GlutaMAX) Thermo Fisher Scientific 35050061
NaHCO3 Thermo Fisher Scientific 144-55-8
Glucose Sigma-Aldrich G8769
BSA LAMPIRE Biological Laboratories 7500855 Fatty acid free
GDF8 PeproTech 120-00
CHIR-99021 Stemgent 04-0004 GSK-3 inhibitor
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Vitamin C
FGF7 R&D Systems 251-KG
SANT1 Tocris Bioscience 1974 Hedgehog inhibitor
RA Sigma-Aldrich R2625 Retinoic acid
LDN Stemgent 04-0019 BMP inhibitor
IWP-2 Tocris Bioscience 3533 Wnt antagonist 
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056
TPB EMD Millipore 565740-1MG PKC activator
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
ALK5i II Enzo Life Sciences ALX-270-445 ALK5 inhibitor II
ZnSO4 Sigma-Aldrich Z0251
Heparin Sigma-Aldrich H3149
GSiXX EMD Millipore 565789 Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma-Aldrich A9165
Trolox EMD Millipore 648471 Vitamin E analogue
R428 Selleck Chemicals S2841 AXL receptor tyrosine kinase inhibitor
24 mm Transwell with insert Corning Life Sciences 3414
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660
0.4 cm Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652081
AAVS1-TALEN-L Addgene 59025
AAVS1-TALEN-R Addgene 59026
AAVS1-Neo-M2rtTA Addgene 60843
AAVS1-Puro-iCas9 Addgene 58409
T7 Endonuclease I NEB M0302L
Buffer 2 NEB B7002S NEBuffer 2
Long oligonucleotide Eton Bioscience or IDT
SOX17 antibody R&D Systems AF1924 1:500
FOXA2 antibody Millipore 07-633 1:100
CXCR4-APC antibody R&D Systems FAB170A 1:25
PDX1 antibody R&D Systems AF2419 1:500
NKX6.1 antibody DSHB F55A12 1:500
NKX2.2 antibody DSHB 74.5A5 1:100
NEUROD1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-1084 1:100
Insulin antibody Dako A0564 1:2,000
C-peptide antibody DSHB GN-ID4-c 1:2,000
Glucagon antibody Sigma-Aldrich G2654 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  2. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  3. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).
  4. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  5. González, F., et al. An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  8. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).
  9. Zhu, Z., et al. Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes. Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).
  10. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  11. Carlson-Stevermer, J., et al. High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).
  12. Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).
  13. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Rezania, A., et al. Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).
  16. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  17. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  18. Chen, S., et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage. Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).
  19. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  20. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  21. Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).
  22. Soh, C. L., Huangfu, D. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium. Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).
  23. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  24. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).
  25. Musunuru, K. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).
  26. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  27. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  28. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  29. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  30. Huang, X., et al. Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  31. Shi, Z. D., et al. Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development. Cell Stem Cell. , in press (2017).

Tags

Genetik CRISPR / Cas9 iCas9 genom redigering AAVS1 humane pluripotente stamceller pancreascancer differentiering glucose-responsive p-lignende celler diabetes
Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z.,… More

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z., Huangfu, D. Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development. J. Vis. Exp. (121), e55267, doi:10.3791/55267 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter