Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55267
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute
* These authors contributed equally

Summary

Protokoller for å generere hPSC mutant linjer ved hjelp av iCRISPR plattform og å skille hPSCs til glukose-responsive e-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC rettet differensiering gir en kraftig plattform for systematisk analyse av rollen avstamning determinants i menneskelig utvikling og progresjon av sykdommen.

Abstract

Avhør gen-funksjon i selv fornye eller differensierende humane pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyr en verdifull plattform mot å forstå menneskelig utvikling og dissekere sykdomsmekanismer i en skål. For å utnytte dette potensialet applikasjonen krever effektive genom-redigeringsverktøy for å generere hPSC mutanter i sykdomsassosierte gener, samt in vitro hPSC differensiering protokoller for å produsere sykdomsrelevant celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. En effektiv genom-redigering plattform for hPSCs heter iCRISPR har blitt utviklet gjennom TALEN-mediert målretting av en Cas9 uttrykk kassett i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering av induserbare Cas9 hPSC linjer ved hjelp av celler dyrket i et kjemisk definert medium og en mater-fri tilstand er beskrevet. Detaljerte prosedyrer for bruk av iCRISPR system for genet knockout eller presise genetiske endringer i hPSCs, enten gjennom non-homolog ende bli (NHEJ) eller via presise nukleotid endringer ved hjelp av en homologi-rettet reparasjon (HDR) mal, henholdsvis, er inkludert. Disse tekniske prosedyrer inkluderer beskrivelser av design, produksjon og transfeksjon av CRISPR guide RNA (gRNAs); måling av CRISPR mutasjonsraten ved T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering av klonal mutant linjer. Til slutt, vi krønike prosedyrer for hPSC differensiering til glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler ved å etterligne in vivo bukspyttkjertelen embryonal utvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med rettet hPSC differensiering gjør at systematisk undersøkelse av gen-funksjon for å videreutvikle vår forståelse av bukspyttkjertelen utvikling og diabetes sykdomsmekanismer.

Introduction

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både å fornye seg selv og gi opphav til alle derivater av de tre embryonale bakterie linjene. De gir en verdifull ressurs for celle erstatning terapi og sykdom modellering ved å fungere som en unik plattform for å rekapitulere cellulære prosesser i en menneskelig utviklingssammenheng. De er også en kilde til eksperimentelle celler for skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremgang vært begrenset på grunn av to hovedutfordringer: mangel på effektive genetisk modifikasjon verktøy og vanskeligheten med å rekapitulere de komplekse embryonale utviklingstrinn i en kultur tallerken.

Genetisk modifikasjon er en uunnværlig verktøy for å studere genfunksjon i normal utvikling og sykdom. Imidlertid, mens klassiske gene targeting tilnærminger via homolog rekombinasjon har vist seg å være et kraftig verktøy for å dissekere genfunksjon i mus embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilnærmingenhar vært svært ineffektiv når den brukes til hPSCs to, tre. Den nylige rask tiltredelse av programmerbare, stedsspesifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebruk, blant annet sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjon aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) systemer 4, innebærer at genom teknikk har blitt en mye enklere oppgave i et bredt spekter av organismer og cellelinjer, blant annet i hPSCs. Disse genet redigeringsverktøy dra nytte av det faktum at kimære nukleaser som Cas9 endonuklease kan tillate en hel rekke genetiske endringer ved å fremkalle dobbel-strandet pauser (DSB sin) på presise steder, utløser den endogene DNA reparasjon av veier for å aktivere enten ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR). Begge mekanismene kan utnyttes for genetisk manipulasjon ved å fremkalle either tilfeldig innsetting og sletting mutasjoner (indels, via NHEJ), for å skape rammeskifte mutasjoner som opphever genet alleler, eller presise nukleotidsubstitusjoner (via HDR), for å rekapitulere pasient mutasjoner for menneskelig sykdom modellering eller for å rette en sykdomsfremkallende mutasjon for genterapi .

CRISPR / Cas-mediert genomet teknikk krever to komponenter: konstant RNA-guidet Cas9 endonuklease nødvendig for DNA cleavage og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering (tracrRNA) dupleks som angir DNA target anerkjennelse. Den crRNA / tracrRNA dupleks kan erstattes med en enkelt kimært guide RNA (gRNA), som er blitt funnet å fungere mer effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 systemet er tilpasset mest eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og uttrykk for Cas9 og gRNA varierer betydelig og må ytterligere optimalisert til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, inkludert hPSCs 8. En effektiv genom-redigering plattform, iCRISPR, har vært etablert i hPSCs 5. I dette system har en TALEN-mediert metode blitt benyttet til å målrette begge allelene av "transgene trygg havn locus" AAVS1 i trans, ett allel med en omvendt tetracyklin-kontrollert transaktivator (M2rtTA) og den andre med en tetracyklin-responselement (TRE ) kjører uttrykk for Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerte klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 sterkt uttrykt med doksycyklin behandling. I mellomtiden, på grunn av sin lille størrelse (100 nt), én eller flere gRNAs lett kan leveres inn iCas9 hPSCs med høy effektivitet og kan henvise Cas9 for stedsspesifikke cleavage, muliggjør effektiv NHEJ-mediert genet avbrudd, samt HDR-mediert presise nukleotid-endringer i nærvær av korte enkeltkjedet DNA (ssDNA) donor maler. Den iCRISPR systemet kan værebrukt for å kunne generere et panel av sykdomsligne hPSC linjer med biallelic (homozygot eller sammensatte heterozygot) eller heterozygote tap-av-funksjon mutasjoner i viktige utviklings gener 5, 9. Mens et antall grupper har rapportert effektiv gen redigering ved hjelp av CRISPR / Cas i hPSCs, forblir suksess begrenset til et lite antall teknologisk flinke laboratorier. Den iCRISPR plattformen tilbyr en effektiv men enkel løsning for rutine genet redigering av forskere på ulike ferdighetsnivåer, og det har allerede blitt brukt i en rekke publiserte studier av vår gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilnærmingen har også blitt ytterligere utvidet til induserbar stanse basert på uttrykk for dCas9-KRAB 13.

Sammen med fremdriften i genomet-redigering technologi, betydelige forbedringer har også blitt oppnådd i hPSC vedlikehold og rettet differensiering. Kultur vilkår for hPSCs har utviklet seg fra bestrålte mus embryonale fibroblast (iMEF) mater avhengig til mater-frie forhold på definerte ekstracellulære matrise komponenter, og fra komplekse medie formuleringer til kjemisk definerte mellom forhold 14. Slike forbedringer har redusert variabilitet i hPSCs grunn av batch-til-batch-forskjeller i iMEF forberedelse og knockout serumreservekomponenter, og dermed gi en mer reproduserbar miljø for hPSC differensiering. I mellomtiden, bedre kunnskap om signalveier som styrer menneskelig embryoutvikling, samt funn fra high-throughput narkotika screenings, har ført til bedre differensiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokollene nærmere etterligne i vivo utviklingstrinn og generere celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. For hPSC differensiering i bukspyttkjertelen avstamning, innledende protokoller lignet tidlig bukspyttkjertelen utvikling relativt godt, men til slutt generert polyhormonal betaceller som var av umodne foster fenotyper og respondert dårlig til glukose stimulering. Nylige fremskritt 16, 17, 19, 20 har tillatt for generering av glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler, noe som vil gjøre oss i stand til å undersøke senere hendelser, som for eksempel dannelse og den videre modning av monohormonal betaceller.

Her har vi detalj anvendelse av genom-modifisert linjer for studiet av pankreatisk utvikling ved å kombinere iCRISPR systemet med hPSC basert in vitro differensiering plattformen mot glukose-responsive pancreatic B-lignende celler. Denne koblingen av kraftige genome redigeringsverktøy med en forbedret hPSC differensiering protokollen tilbyr ikke bare hastigheten og omfanget er nødvendig for å møte den økende etterspørselen etter validering sykdom kausalitet, men gjør det også avanserte genetiske manipulasjoner for videre mekanistiske undersøkelser i transkripsjonen kontroll underliggende normal utvikling og sykdom 9 .

Protocol

Denne protokollen er basert på vårt arbeid med hPSC linjer H1, HUES8, og MEL-en i kjemisk definerte og mater-fri tilstand (Se Materiell og utstyr tabell). For andre hPSC linjer eller hPSCs opprettholdt i ulike dyrkningsforhold, er ytterligere optimalisering anbefales.

1. hPSC Kultur i kjemisk definerte og mater-fri tilstand

  1. Tilpass hPSC kultur på iMEF forer til materen-fri tilstand. I tilfeller der frosne cellene ikke overlever godt når direkte gjenfunnet i materen frie tilstand, gjenopprette celler i iMEF tilstand først og deretter tilpasse seg mater-fri tilstand.
    MERK: Vanligvis tar det 2 passasjer for hPSCs dyrket på iMEF brett tilpasses materen frie tilstand.
  2. Endre medium hver dag og passage de hPSCs når cellene har nådd ~ 80% confluency. Generelt passasje hPSCs på ~ 1: 6 - 1:15 ratio hver 4 - 6 dager. Legg 10 mm ROCK hemmer Y-27632 whno tining eller aging cellene.
  3. Før utsåing av hPSCs, pre-coat kulturskåler med 5 ug / ml (1 ml / 10 cm 2) avkortet, rekombinant human form av vitronektin (VTN) i minst 1 time ved romtemperatur (RT). Også forberede komplett kjemisk definert medium ved å legge supplement til basal medium.
  4. Fjerne dyrkningsmediet, vaskes cellene en gang med PBS uten Ca2 + og Mg2 +, og behandle cellene med 0,5 mM EDTA i ~ 2 - 5 min ved RT.
  5. Aspirer EDTA før koloniene har frittliggende. Med forsiktig pipettering, spre hPSC koloniene i små biter og resuspender cellene i fullstendig medium.
  6. Samle dissosierte hPSCs og spinn ned cellene ved 200 xg i 5 min. Resuspender de pelleterte hPSCs i fullstendig medium og frø cellene på VTN-belagte plater.

2. Generering av iCas9 hPSC Lines

  1. Orden og forsterke følgende plasmider: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA, og AAVS1-Puro-iCas9.
    MERK: For å unngå uventede rekombinasjon, bruke rekombinasjon-mangel Stbl3 kompetente celler for transformasjon og forsterkning av plasmider ved 30 ° C.
  2. Vanligvis forberede hPSCs i en 10-cm tallerken (~ 1 x 10 7 celler hvis ~ 80% sammenflytende) for en målgruppe eksperiment.
    MERK: Etter elektroporering vanligvis forårsaker betydelig celledød og TALEN-formidlet gen-targeting i AAVS1 locus krever antibiotisk seleksjon, et forholdsvis stort antall celler må være podet for å identifisere korrekt målrettede celler. Optimalisering for legemiddelkonsentrasjonene er anbefalt for hver cellelinje, og hver kultur tilstand.
  3. På dag 1, (dagen før electroporation), legge til 10 mm ROCK hemmer i løpet av media endring.
  4. På dag 0, (dagen for elektroporering), fremstille VTN-belagte plater på forhånd.
  5. Distansere de hPSCs i enkeltceller USIng 1x dissosiasjon reagens (se Materiell og utstyr tabell). I korthet fjernes dyrkningsmediet, vaskes cellene en gang med PBS uten Ca2 + og Mg2 +, og behandle cellene med 1 x dissosiasjon reagens ved 37 ° C i ~ 3 minutter. Aspirer dissosiasjon reagens før cellene har løsnet. Med forsiktig pipettering, dispergere hPSCs inn i en enkeltcellesuspensjon i 10,5 ml fullstendig medium.
  6. Ta 0,5 ml cellesuspensjon å telle celle nummer ved hjelp av en automatisert celleteller. Pellet hPSCs ved 200 xg i 5 minutter og resuspender cellene i kaldt (4 ° C) PBS ved 12,5 x 10 6 celler / ml.
  7. Tilsett plasmider (se tabell 1) i 800 mL hPSC suspensjon (12,5 x 10 6 celler / ml) og bland godt. Overfør blandingen til en 0,4 cm kyvette elektroporering og holde på is i ~ 5 min.
  8. Electroporate cellene ved hjelp av et system av elektroporering ved 250 V og 500 uF; tidskonstanten observed etter electroporation er vanligvis 9 - 13 ms.
  9. Etter elektroporering overføre cellene til en 15 ml konisk rør med 5 ml forvarmes komplett medium. Kritisk for vellykket satsing: Bruk sunn prolifererende hPSCs og håndtere cellene svært forsiktig når du overfører, resuspending, og platekledning cellene etter electroporation.
  10. Pellet cellene ved 200 xg i 5 minutter. Resuspender cellene i 10 ml komplett medium med 10 uM ROCK-inhibitor og platen 1, 2,5, og 5 x 10 celler 6 på hver av de tre VTN-belagt, 10-cm skåler; Dette sikrer at minst en av platene vil ha tilstrekkelige kolonier på enkelt-celle klonal tetthet for koloni plukking.
  11. På dag 1 (dagen etter elektroporering), endrer medium.
  12. På Days 2-5, start neomycin valg når cellene er ~ 60% sammenflytende. Endre medium daglig med 500 mg / ml G418 sulfat; betydelig celledød på grunn selection blir typisk observert 2 dager etter G418-seleksjon.
  13. På dag 6, endre medium uten antibiotika utvalg.
  14. På Days 7-9, starter puromycin utvalg. Endre medium daglig med 1 mg / ml puromycin dihydroklorid; signifikant celledød bør observeres den neste dag.
  15. På dag 10, begynne å endre mediet daglig uten antibiotika utvalg inntil hPSC enkeltcellekolonier nå 1 - 2 mm i diameter.
    MERK: Vanligvis blir 50 kolonier i en 10-cm tallerken observert med 2,5 x 10 6 hPSCs belagt på dag 0.
  16. Plukk 12 - 24 kolonier i henhold til et stereomikroskop. Mekanisk disaggregert de hPSC koloniene i små biter (~ 10 stykker per koloni) ved hjelp av en 23 G nål (en 200-ul pipettespiss er også greit) og overføre cellene direkte i VTN-belagte 24-brønners plater.
  17. Endre medium daglig til cellene blir sammenflytende. Passasje ble cellene i hver brønn i 24-brønners plater iduplikatbrønner i 6-brønns plater.
  18. Når cellene blir sammenflytende i 6-brønns plater ved å bruke en brønn for en frosset lager og den andre godt for genomisk DNA-ekstraksjon for ytterligere karakterisering.
  19. Karakterisere og validere de etablerte iCas9 linjer ved PCR genotyping, Southern blotting, RT-qPCR analyse, karyotypering, og pluripotency analysen. Henvis til Zhu et al. 21 for detaljerte eksperimentelle prosedyrer.

3. generasjon hPSC Mutant Lines Bruke iCRISPR System

  1. Generering av hPSC knockout linjer
    1. gRNA design og produksjon
      1. Velge målregioner i genet av interesse for å maksimalisere muligheten for å forstyrre vill-type protein funksjon. For godt kommenterte gener, velge et mål region oppstrøms en viktig funksjonell domene. Alternativt, design gRNAs å målrette en region nedstrøms for startkodonet. Velg minst 2 forskjelligeregioner for et gen av interesse.
      2. Design gRNAs bruker online CRISPR design verktøyet (http://crispr.mit.edu). For hvert mål region, design 3 gRNAs med lavt potensial off-mål og bruke den med høyest målretting effektivitet for generering av klonal mutant linje 22.
        NB: For å oppnå høy genomet redigering effektivitet, er det anbefalt å levere gRNA som RNA-oligonukleotider i stedet for plasmid-DNA som på grunn av den høyere transfeksjonseffektiviteten av små RNA sammenlignet med plasmider i tidligere erfaringer.
      3. Bestill 120 nucleotide (NT) DNA-oligonukleotider som inneholder T7 promoter sekvens, den variable 20-nt crRNA gjenkjennelsessekvens (N) 20 (inkluderer ikke PAM sekvens), og den konstante kimære guide sekvens. Fortynne oligos til 100-mikrometer stamløsning i DDH 2 O og forberede 250 nM som arbeidsløsning.
        MERK: TAATACGACTCACTATAGGG (N) 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplifisere oligonukleotidene ved hjelp av T7F og TracrR primere (se tabell 2) for å frembringe dobbelt-trådet DNA (dsDNA) templat for gRNA in vitro transkripsjon (IVT). Bruke 50 ul av PCR-reaksjonsblandingen (se tabell 3) og PCR-syklusbetingelser (se tabell 4).
      5. Bruk en høy avkastning T7 transkripsjon kit for in vitro gRNA transkripsjon med PCR-forsterket malen i 20 mL, in vitro gRNA transkripsjon mix (se tabell 5) i henhold til produsentens instruksjoner. Rense gRNA produkter ved hjelp av transkripsjon oppryddingen kit i henhold til produsentens anvisninger.
      6. Eluer gRNAs etter high-throughput rensing protokoll som i henhold til produsentens instruksjoner (vanligvis ~ 50-100 mikrogram) i 100 mL av elueringsbuffer. Juster konsentrasjonen til 320 ng / mL (10 mm) når det er mulig og oppbevares ved -80 &# 176; C inntil bruk.
    2. PCR og Sanger-sekvense grunning design
      1. Design og validere PCR primere forsterke målområdet, med produktstørrelser vanligvis fra ~ 500 - 1000 bp.
      2. Design Sanger-sekvensering av primere binding internt til PCR-produktene for å tillate direkte sekvensering av PCR-produktene uten rensing.
    3. gRNA transfeksjon i iCas9 hPSCs
      1. På dag -1, behandle iCas9 celler med to mikrogram / ml doksycyklin 24 timer før gRNA transfeksjon.
      2. På dag 0 av gRNA transfeksjon, forberede VTN-belagte plater på forhånd.
      3. Dissosiere iCas9 celler inn i enkeltceller ved hjelp av 1x dissosiasjon reagens, som beskrevet i trinn 2.5.
      4. Pellet hPSCs ved 200 xg i 5 minutter og resuspender cellene ved ~ 0,5 x 10 6 celler / ml i fullstendig medium supplementert med 2 mg / ml doksycyklin og 10 uM ROCK inhibitor. Plate 0,5 ml av de resuspenderte celler i individuelle brønner i 24-brønners plater. Fremstille ytterligere brønner for å tjene som ikke-transfekterte kontroller.
      5. For hver gRNA, gjør følgende transfeksjon blandinger: Bland A, 50 mL av redusert serum medium + 1 mL av gRNA (10 mm); Blanding B, 50 ul av redusert serummedium + 3 mL av transfeksjon reagens.
      6. Kombiner Mix A og B for å lage 100 mL blanding. Inkuber i 5 min ved RT. Tilsett 50 pl av blandingen til cellene i de to brønner i 24-brønners plater og bland godt.
      7. På dag 1, utføre en andre transfeksjon hvis det er nødvendig for å ytterligere øke målretting effektivitet. Ellers bytter mediet uten doksycyklin.
      8. På Days 2-3, endre medium daglig.
      9. På dag 4, ekstraher genomisk DNA fra en brønn av hver transfektert og ikke-transfektert kontroll celle ved å bruke en DNA-ekstraksjon kit. Juster konsentrasjon til 50 ng / μL.
      10. PCR-amplifisere mål-regioner som flankerer gRNA som målretter sekvensene og estimere redigering effektivitet ved bruk av T7-endonuklease I (T7EI) fordøyelse eller rflp (RFLP) -analyse, som beskrevet tidligere 5.
    4. T7EI assay
      1. PCR-amplifisere mål-region ved hjelp av primere utformet og validert i trinn 3.1.
      2. Fremstille blandinger (se tabell 6) og utføre DNA-denaturering og hybridisering av PCR-produkter ved bruk av betingelser som er skissert i tabell 7.
        MERK: Basert på våre erfaringer, er det vanligvis ikke nødvendig å rense PCR-produkter for T7EI analysen ved bruk av vår PCR tilstand. Imidlertid rensing kan være fordelaktig i andre forhold.
      3. Utføre en T7EI spaltning ved 37 ° C i 30 minutter under anvendelse av 10 ul av denaturert og hybridisert PCR-produkt og 0,2 ul (2 U) av T7E1 (10 U / ul).
      4. resolve de T7E1-fordøyd PCR prøvene ved gel elektroforese. Bruk ImageJ å bestemme de relative bandet intensiteter av klipp og uklippet DNA. Beregn Indel frekvens ved hjelp av formelen: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, hvor en er intensiteten av ufordøyd PCR-produktet og b og c er intensitetene for T7E1-spaltede produkter.
    5. RFLP-analyse
      MERK: I tilfeller der et restriksjonssete er i umiddelbar nærhet (<5 bp) til en Cas9 kuttesete (3 bp 5 'av PAM sekvens), kan en RFLP-analyse utføres for å kvantifisere Indel frekvens.
      1. Bruk de samme PCR-produkter som beskrevet i trinn 3.1.4.1.
      2. Fordøye PCR-produkt med et restriksjonsenzym som inneholder et restriksjonssete i umiddelbar nærhet til Cas9 spaltningssetet.
      3. Løse fordøyd PCR prøvene ved gel elektroforese. Bruk ImageJ å bestemme de relative bandet intensiteter av klipp og uklippet DNA. Beregn Indelfrekvens ved hjelp av formelen: a / (a + b + c) x 100, hvor en er intensiteten av ufordøyd PCR-produktet og b og c er intensitetene for fordøyd produkter.
    6. Etablering av klonal mutant linjer
      MERK: Genome redigering i hPSCs bruker iCRISPR system med gRNA transfeksjon er svært effektiv, og ingen antibiotika utvalg er nødvendig. For å etablere klonale linjer, er det nødvendig å pode cellene ved en forholdsvis lav tetthet for å sikre dannelsen av enkelt-celle-avledede kolonier.
      1. Identifiser gRNAs med høyest redigering effektivitet (med T7EI eller RFLP-analyse) og med god celle overlevelse. Bruk tilsvarende duplikat godt for klonal mutant linje etablering.
      2. Dissosiere hPSCs inn i en enkeltcellesuspensjon ved bruk av 1 x dissosiasjon reagens, som beskrevet i trinn 2.5. Replate 500, 1000, og 2000 celler på hver av de tre VTN-belagt, 10 cm retter.
      3. Endre medium daglig until den encellede kolonier nå ~ 2 mm i diameter.
      4. Pick 24 - 48 kolonier for hver gRNA, avhengig av beregningen av målretting effektivitet ved T7EI og / eller RFLP-analyse. Mekanisk disaggregert hver koloni i små stykker (~ 10 stykker per koloni) ved hjelp av en 23 G nål (en 200-ul pipettespiss er også greit) og replate cellene i duplikat VTN-belagt, 96-brønners plater. Bruk en plate for genomisk DNA-ekstraksjon og Sanger-sekvensering, og den andre plate for videre ekspansjon.
      5. Når cellene i 96-brønners plater er blitt konfluent, ekstrahere det genomiske DNA (uten fenol / kloroform-ekstraksjon) ved hjelp av en enkel protokoll, som beskrevet nedenfor.
      6. Fjern mediet og vask cellene en gang med PBS uten Ca2 + og Mg2 +. Tilsett 50 pl av lyseringsbuffer (5 pl proteinase K (10 mg / ml), 5 ul av PCR-buffer 10x, og 40 ul av DDH 2 O) til hver brønn i en 96-brønns plate. Tett plate ved hjelp av en selvklebende film og incubate over natten ved 55 ° C.
      7. Den neste dag, overføre cellelysatene til en 96-brønners PCR-plate og inkuberes i 10 min ved 99 ° C i en termosykler for å inaktivere proteinase K.
      8. PCR-amplifisere mål-region ved hjelp av de samme primerne som for T7EI eller RFLP-analyse, ved anvendelse av 1 ul cellelysat som en mal.
      9. Bruke 1 pl av PCR-produktet for Sanger-sekvensering med en primer binding internt til PCR-produktet.
      10. Forsterke kloner med rammeskifte Indel mutasjoner for frossen fisk. Også forsterke et par av vill-type-kloner fra den samme målrettingen eksperiment for å tjene som kontroll isogene linjer for ytterligere eksperimenter.
  2. Generering av mutant linjer med presise nucleotide endringer
    NB: Sammenlignet med knockout-mutanter som er generert av ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ), kan nøyaktig nukleotid forandring oppnås gjennom homologi-rettede reparasjon (HDR) i nærvær av DNA-repair maler. Slike nøyaktige nukleotid-endringer tillate for generering av pasient-spesifikke mutasjoner i vill-type hPSCs og for korreksjon av mutasjoner i pasient-avledet iPSCs.
    1. Design av ssDNA som et HDR-mal
      1. Design og produsere 2 - 3 gRNAs i umiddelbar nærhet til en pasient-spesifikke mutasjon, som beskrevet i trinn 3.1.1.
      2. Utforme et enkelt-trådet DNA (ssDNA) inneholdende pasientspesifikk mutasjon flankert av ~ 40 - 80 nt av homologi på hver side som et HDR-templat.
      3. For å redusere ytterligere skjæring etter å ha den riktige reparasjon, innføre en taus mutasjon til ssDNA malen i området innenfor den gRNA gjenkjennelsessekvens og i umiddelbar nærhet til PAM sekvens eller i PAM-sekvensen i seg selv, hvis det er mulig.
      4. Hvis det er mulig, å utforme den stille mutasjon for å innføre en ny restriksjonsspalting stedet, samt slik at den kan brukes til å beregne reparasjons effektivitet ved hjelp av RFLP-analyse.
      2. GRNA / ssDNA kotransfeksjonen og etablering av klonale linjer
      1. Utføre ko-transfeksjon av gRNA / ssDNA inn i iCas9-celler, som beskrevet i trinn 3.1.3, med transfeksjon blandinger A og B. For hver gRNA og ikke-transfektert kontroll, transfektere cellene i to brønner av 24-brønners plater. Bland A: 50 ul av redusert serum medium + 1 mL av gRNA (10 mm) + 2 mL av ssDNA (10 mm). Bland B: 50 ul av redusert serummedium + 3 mL av transfeksjon reagens.
      2. Etter transfeksjon, trekke genomisk DNA fra en brønn av hver transfektert og ikke-transfekterte kontrollcelle og beregne reparasjons effektivitet ved hjelp av T7EI og / eller RFLP-analyse.
      3. Identifiser gRNA / ssDNA blanding med høyest reparasjon effektivitet og god celleoverlevelse. Bruk tilsvarende duplikat godt for klonal mutant linje etablering.
      4. Pick 48 - 96 kolonier, avhengig av beregningen av det målsøkende effektivitet ved T7EI og / eller RFLP assay. Generelt er effektiviteten til HDR-mediert mutasjon er lavere enn knockout-mutasjonen og således flere kolonier må plukkes.
      5. Sequence, utvide og validere klonale linjer, som beskrevet i trinn 3.1.6.

4. In Vitro hPSC differensiering i Glukose-responsive bukspyttkjertelen beta celler

MERK: In vitro differensiering av hPSC mutanter i sykdoms relevant celletyper gir en plattform for sykdom modellering i en skål. Følgende protokoll fokuserer på in vitro differensiering av hPSCs til glukose-responsive pankreatiske p-celler i bukspyttkjertel og utviklingsstudier diabetiske 9, 16, 17.

  1. hPSC differensiering i definitive endoderm
    1. Opprettholde hPSC mutanter og vill-type styreledninger i kjemisk definerte og mater-fri tilstand, som beskriverd i trinn en.
    2. For å forberede hPSCs for differensiering, distansere de hPSCs bruker 1x dissosiasjon reagens og spre dem i enkeltcellesuspensjon i komplett medium.
    3. Pellet cellene ved 200 xg i 5 minutter og re-suspendere cellene i fullstendig medium med 10 pM ROCK inhibitor. Telle celle nummer og frø cellene på ~ 1,4 x 10 5 celler / cm2 på VTN-belagte plater.
    4. Endre medium 24 timer etter seeding.
    5. På dag 0, starter differensiering etter 48 timer, når cellene har nådd ~ 80% sammenflytning.
      MERK: For å oppnå høy bukspyttkjertelen differensiering effektivitet, optimalisere seeding tetthet og nivå av konfluens på 48 timer er anbefalt for hver enkelt linje.
    6. Aspirer hPSC medium og skyll cellene gang med PBS uten Ca 2+ og Mg 2+.
    7. Endre medium til differensiering dag 0 (d0) medium.
    8. På Days 1-2, endre differentiation medium daglig, i henhold til oppskriftene i tabell 8.
    9. På dag tre, undersøke definitive endoderm markører SOX17, FOXA2, og CXCR4 ved immunfluorescens farging og flowcytometri analyse.
  2. Definitive endoderm differensiering i bukspyttkjertelen stamfar
    1. På dagene 3 - 9, fortsette endelig endoderm differensiering mot bukspyttkjertel avstamning ved å endre mediet daglig, i henhold til oppskriftene i tabell 9.
    2. På dag 7, undersøke den tidlige pankreatisk progenitor (PP1) markør PDX1 ved immunfluorescens-fargingen og strømningscytometri-analyse.
    3. På dag 10, undersøke senere bukspyttkjertelen stamfar (PP2) markører PDX1 og NKX6.1. I mellomtiden, forberede seg til å overføre PP2 celler til luft-væske-grensesnittet for ytterligere differensiering i bukspyttkjertelen endokrine celler.
  3. Bukspyttkjertelen endokrine avvikeentiation i luft-væske-grensesnittet
    1. Behandle PP2 celler med 10 mm ROCK hemmer 4 t før dissosiasjon.
    2. Fjern medium og skyll cellene gang med PBS uten Ca 2+ og Mg 2+.
    3. Tilsett 2 ml 1x dissosiasjon reagens for å PP2-celler i en 10-cm plate og inkuberes ved 37 ° C i 2 - 3 min.
    4. Aspirer dissosiasjon reagens før cellene har løsnet. Tilsett 10 ml Blar medium og dispergere PP2 celler i enkle celler ved forsiktig pipettering opp og ned.
    5. Samle enkeltcellesuspensjon. Telle cellenummer og pellet ved 200 xg i 5 minutter.
    6. Cellepelleten suspenderes på ~ 0,5 x 10 5 celler / mL i S5 differensiering medium og spot 5-10 mL av celler per øye på en transwell innsats filter. Plasser 10 - 15 plasser i en seks-brønns innsats og ~ 100 plassene i en 10-cm innsats.
    7. Legg S5 medium til bunnen av hver transwell innsats, ~ 1,5 ml for 6-brønners innsatser og ~ 8 ml feller 10 cm innsatser.
    8. Endre medium daglig med oppskriftene i tabell 10.
    9. Undersøk bukspyttkjertelen endokrine markører PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insulin, og glukagon på dag 34 av immunfluorescens farging og flowcytometri analyse 17.
    10. Undersøke hPSC-avledet β-liknende cellefunksjon med en glukose-stimulerte insulin sekresjon (GSIS) assay 16, 17.

Representative Results

hPSC kjemisk definerte og mater-fri kultur Tilpasning og vedlikehold

hPSCs dyrket på iMEF brett kan være raskt tilpasses VTN-belagte plater i materen frie kultur tilstand. Den samme spalteforhold som normalt iMEF mater kulturen kan brukes under tilpasning. Figur 1A viser typiske morfologi av hPSCs på iMEF forer i KSR basert medium og på en VTN-belagt overflate i mater fritt medium. Figur 1B viser et typisk morfologisk forandring og vekst av hPSC kolonier i løpet av den første passasje av tilpasnings (4 dager). Cellene kan være ytterligere passaged eller frosset for senere eksperimenter. Gjennomføre 2 - 3 passeringer av tilpasning kultur før du starter differensierings eksperimenter. Karyotypering anbefales også etter tilpasning, selv om vi ikke har observert Karyotype forstyrrelser under tilpasningen fasen.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Generation of iCas9 hPSC Lines gjennom TALEN-mediert AAVS1 målretting

Som vist tidligere, ble hPSCs electroporated med et par AAVS1 Talen plasmider og Cas9 og M2rtTA plasmider 5. Figur 2A og B viser detaljert donor vektor rettet mot design og hele prosedyren for å generere iCas9 hPSC klonale linjer. Etter antibiotisk utvelgelse, enkelt-celle-avledede kloner som viser tilstrekkelig størrelse og typisk hPSC morfologi var klar til å bli plukket (10 - 12 dager etter elektroporering, figur 2C). Vanligvis ~ 50% av klonene er riktig rettet uten tilfeldige integreringer, som bekreftet ved Southern blotting (figur 2D) 5. Tilfeldig integrasjon kan forårsake utette ekspresjon av Cas9 i fravær av doksycyklin behandling.

Effektiv Genetisk Modification i hPSCs Bruke iCRISPR Platform

I etablert iCas9 hPSCs er Cas9 uttrykt med doksycyklin behandling og guidet til målet sitt locus av de transfekterte gRNAs, hvor den genererer DSB sin. I fravær av en reparasjon mal, DNA-reparasjon gjennom NHEJ genererer indels, som ofte resulterer i genet avbrudd eller knockout. I nærvær av en reparasjon mal (for eksempel en ssDNA donor), kan HDR anvendes for nøyaktig genetiske endringer, slik som generering av en pasient-spesifikke mutasjon i et hPSC bakgrunn villtype eller korrigere en sykdomsassosierte genetisk variant i pasient- avledet iPSCs (figur 3A). Det tar ~ en måned for å generere klonal mutant linjer ved hjelp av iCRISPR system. Etter iCas9 induksjon og gRNA transfeksjon, T7EI og / eller RFLP analyser ble brukt for å vurdere Cas9 effektiv kutting, og de transfekterte cellene ble sådd ut senere som enkle celler i 10-cm skåler ved lav tetthet (~ 500 - 2, 000celler / 10 cm parabol). 10 - 12 dager senere, ble enkelt-celle-avledede kloner plassert i brønnene til en 96-brønns plate for ekspansjon og ytterligere karakteristikk (dvs. genotyping og Western blotting) (figur 3B). Siden iCRISPR-mediert genet knockout er svært effektiv, er ingen utvelgelsesprosess involvert, og vanligvis 20 - 50% biallelic mutanter lett kan oppnås (figur 3C) 5. For effektive og presise genetiske endringer, gRNAs er co-transfektert med et ssDNA donor bærer bestemt rekkefølge endring (for en liten, men bestemt endring av genomsekvens). Ofte, for å hindre re-kutting i modifiserte alleler, er det anbefalt å inkludere en taus mutasjon i umiddelbar nærhet til eller i PAM-sekvensen (figur 3D). Med dette systemet, ~ 10% av kloner som bærer det ønskede HDR-mediert genomet modifikasjon uten ytterligere endringer i begge alleler er oppnådd (fig 3E). Den raske og precise endring av hPSC genomet bruker iCRISPR plattformen tillater oss å raskt og effektivt lage hPSC linjer som fungerer som modeller for å studere menneskelig utvikling og sykdom.

Effektiv Differensiering av hPSCs mot Glukose-responsive e-lignende celler

Framskritt i hPSC bukspyttkjertelen differensiering har tillatt utviklingen av protokoller som tett rekapitulere bukspyttkjertelen embryonal utvikling. Udifferensierte hPSCs første differensiert i den definitive endoderm, deretter inn PDX1 + tidlige bukspyttkjertelen stamfedre (PP1) og PDX1 + NKX6.1 + senere bukspyttkjertelen stamceller (PP2), og til slutt til glukose-responsive β-lignende celler 16, 17, 19, 20 , 23, 24. disse protocoler ble ytterligere optimalisert for pålitelig generere PDX1 + NKX6.1 + bukspyttkjertelen stamfedre og glukose-responsive e-lignende celler 9. Figur 4A viser detaljerte kjemiske kosttilskudd brukes på hvert stadium av differensiering. Vanligvis, ~ 80% sammenflytning 2 dager etter den initielle celle plating er ideell for å starte differensiering av HUES8 hPSCs (figur 4B). Testing flere forskjellige seeding tettheter er sterkt anbefalt å oppdage den optimaliserte tilstand for hver enkelt cellelinje. Vanligvis minst 75% FOXA2 + SOX17 + -celler ved DE trinnet og 40% PDX1 + NKX6.1 + celler ved PP2 trinnet kan oppnås (figur 4C). Ved S5 trinnet, nærværet av en aura lignende form rundt cellen aggregat er en indikator for god overlevelse av cellene, noe som er viktig for ytterligere differensiering til NKX6.1 + CPEP + glukose-responsive p-lignende celler (figur 4D ). Denne protokollen er nyttig for å studere menneskelig bukspyttkjertelen d evelopment og sykdom i en skål.

Figur 1
Figur 1. hPSC kjemisk definerte og mater-fri Vedlikehold og kultur Adaptation fra iMEF Feeders. (A) Representative bilder av hPSCs dyrket på iMEF materen eller på VTN på dag 4, klar til å bli delt. (B) Typisk morfologi hPSCs under den første passering av tilpasning til mater-fri kultur fra en iMEF mater. Dag 4 hPSCs dyrket på iMEF forer ble splittet og belagt på VTN-belagte plater i kjemisk definert medium med ROCK hemmer. Spalteforholdet var den samme som den vanlige spalteforholdet for dyrking i iMEF mateforhold. Mediet ble skiftet hver dag uten ROCK inhibitor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. Generering av iCas9 hPSC Lines. (A) Targeting strategi for generering av iCas9 hPSC linjer. Puro-Cas9 donor og Neo-M2rtTA donor ble rettet i den menneskelige AAVS1 locus av et par AAVS1 Talens. (B) Skjematisk av hele målretting prosessen, inkludert elektroporering, antibiotika utvalg, koloniplukking og ekspansjon, og cellelinje karakterisering. (C) Representant encellede klone klar til å bli plukket på rundt 10 - 12 dager etter electroporation. (D) Southern blot eksempler for å identifisere korrekt rettet kloner uten den ytterligere integrering av to donor plasmider. Riktige kloner er merket med rødt. (A) og (D) ble tilpasset fra referanse 5, med tillatelse.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Effektiv genmodifisering i hPSCs Bruke iCRISPR System. (A) Skjema for generering av genet knockout mutanter eller presise genmodifisering bruker iCRISPR system. (B) Targeting prosedyre og klonal linje etablering. (C) Gene knockout effektivitet gjennom NHEJ i hPSCs 9. (D) Design av en ssDNA som bærer et spesifikt nukleotid modifikasjon. P, i rødt: pasient-spesifikke mutasjonen; X, i grønt: stille mutasjon. (E) Effektivitet av HDR-mediert nøyaktig nukleotid modifikasjon. En presis R456C mutasjon (forårsaket av en spesifikk nukleotid C> T-mutasjon) i GATA6 locus ble innført ved hjelp av iCRISPR system.(Se Referanse 5 for mer detaljert informasjon). (C) og (E) ble tilpasset fra referanse 9 og referanse 5, henholdsvis, med tillatelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Directed hPSC Differensiering til glukose-responsive bukspyttkjertelen e-lignende celler. (A) Skjematisk av detaljert differensiering protokollen, med kjemikalier supplert på hvert stadium av differensiering. Signalveier som er aktivert eller hemmes i løpet av differensiering er uthevet i grønt eller rødt, henholdsvis. Tsjir: gsk3 inhibitor; GDF8: vekst differensiering faktor 8 eller myostatin, en TGF-beta protein familiemedlem; HH: Hedgehog; DE: Definitive endoderm; PP1:PDX1 + tidlig bukspyttkjertelen stamfar; PP2: PDX1 + NKX6.1 + senere bukspyttkjertelen stamfar. (B) Typisk konfluens (70 - 80%) av hPSCs 48 timer etter seeding når du er klar for differensiering innvielse. (C) Representative immunfluorescens farging bilder som viser vellykket differensiering på definitive endoderm (DE) stadium (FOXA2 og SOX17 co-farging), bukspyttkjertelen stamfar scenen (PP2: PDX1 og NKX6.1 co-farging), og glukose-responsive β- liknende celle trinn (NKX6.1 og c-peptid ko-farging). Generelt, for å oppnå mer enn 10% NKX6.1 + CPEP + -celler ved β-liknende cellestadiet, minst 75% FOXA2 + SOX17 + DE-celler og 40% PDX1 + NKX6.1 + PP2 celler kreves ved de tilsvarende faser. (D) Typisk morfologi av en celle-aggregatet ved S5 trinnet på en innsatsfiltermembranen i luft-væske-grensesnittet kultur. De overlevende celler har migrert til sentrum av den samlede (i mørke) og til venstre en aura-lignende struktur på kanten. (En (D) ble tilpasset fra Reference 9 med tillatelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

plasmid Beløp
AAVS1-TALEN-L 5 mikrogram
AAVS1-TALEN-R 5 mikrogram
AAVS1-Puro-iCas9 40 mikrogram
AAVS1-Neo-M2rtTA 40 mikrogram

Tabell 1

primer Sekvens
T7F TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR AAAAGCACCGACTCGGTGCC

Tabell 2

Tabell 3

Komponent Beløp
DDH 2 O 35,5 mL
5x PCR reaksjon buffer 10 mL
dNTP mix (25 mm) 0,5 mL
T7F (10 mm) 1,25 mL
TracrR (10 mm) 1,25 mL
T7-gRNA IVT mal (250 nM) 1 mL
DNA-polymerase 0,5 mL
Total PCR reaksjon mix 50 mL
PCR sykkelforholdene
Cycle nummer denaturering anneal Forlenge
1 94 ºC, 2 min
2-31 94 ºC, 20 s 60 ºC, 20 s 72 ºC, 1 min
32 72 ºC, 2 min

Tabell 4

Komponent
T7 ATP 2 mL
T7 CTP 2 mL
T7 GTP 2 mL
T7 UTP 2 mL
T7 10x buffer 2 mL
T7 enzym mix 2 mL
PCR forsterket mal 8 mL
Total in vitro gRNA transkripsjon mix 20 mL
Inkuber ved 37 ° C i 6 timer til over natten

Tabell 5

Komponent Beløp (pl)
Urenset PCR produkt 8 Buffer 2 10x 2
Destillert vann (dH 2 O) 10

Tabell 6

DNA denaturering og hybridisering sykkelforhold
Temperatur Varighet termo forhold
95 ° C 10 min
85 ° C 1 minutt Rampe til 85 ° C ved 2 ° C / S
75 ° C 1 minutt Gradient til 75 ° C ved 0,3 ° C / s
65 ° C 1 minutt Rampe til 65 ° C 0.3 ° C / S
55 ° C </ Td> 1 minutt Gradient til 55 ° C ved 0,3 ° C / s
45 ° C 1 minutt Gradient til 45 ° C ved 0,3 ° C / s
35 ° C 1 minutt Rampe til 35 ° C 0.3 ° C / S
25 ° C 1 minutt Gradient til 25 ° C ved 0,3 ° C / s
4 ° C Holde

Tabell 7

Scene Dag Media supplement
S1 d0 S1 GDF8
100 ng / mL 		Tsjir-99021
3 mikrometer
d1 S1 GDF8
100 ng / mL 		Tsjir-99021
0,3 mikrometer
d2 S1 GDF8
100 ng / mL
S1 media: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glukose

Tabell 8

S3
Scene Dag Media supplement
S2 d3-d4 S1 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		IWP-2
2,5 mikrometer
d5-d6 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		SANT-en
0,25 mikrometer 		RA
1 mikrometer 		LDN
100 nM 		TPB
200 nM 		ITS-X
1: 200
S4 d7-d9 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
2 ng / ml 		SANT-en
0,25 mikrometer 		RA
0,1 mikrometer 		LDN
200 nM 		TPB
100 nM 		ITS-X
1: 200 		IWP-2
2,5 mikrometer
S3 media: MCDB 131 + 1 x L-glutamin supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glukose

Tabell 9

Scene Dag Media supplement
S5 d10-d12 S5 T3 1fiM ALK5i II 10 mm Sant-en 0,25 mikrometer RA 0,05 mikrometer LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 mm Heparin 10 ug / mL
S6 D13-s d19 S5 T3 1fiM ALK5i II 10 mm GSiXX 100 nM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 mm Heparin 10 ug / mL
S7 d20- D33 S5 T3 1fiM ALK5i II 10 mm N-Cys 1mM Trolox 10 mm R428 2 mikrometer ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 mm Heparin 10 ug / mL
S5 media: Blar + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM glukose

Tabell 10

Discussion

Tid Hensyn for å generere Mutant Lines

Selv om de siste tilnærminger basert på CRISPR / Cas systemer for genom redigering har ført til en vellykket satsing, ville en mer effektiv og universell plattform være å foretrekke for større skala analyser av gen-funksjon. Den iCRISPR plattformen gir en rask og effektiv metode for å innføre mutasjoner til hvilket som helst gen av interesse 5, 9. For det første tillater PCR-baserte gRNA syntesemetode fremstilling av hundrevis av gRNAs i kledd format i en dag uten de tidkrevende kloningstrinn. For det andre, med doksycyklin-induserbar Cas9 uttrykk i iCas9 hPSCs, trinn involverer gRNA transfeksjon krever bare minimalt med arbeid, og dermed kan flere gRNA rettet mot forsøkene gjennomføres samtidig. Tredje, på grunn av den høye målretting effektivitet oppnåelig med vårt system, analyse av ~ 24 - 48 kolonier pr gRNA transfektert bør være sufficient for å etablere multiple monoallelic og biallelic mutant linjer for et enkelt gen, selv om effektiviteten varierer avhengig av mål-locus. Siden det er mulig for en trent person til mekanisk plukke 384 kolonier (4 x 96-brønners plater) i en sittende, som bør ta ~ 4 timer under et dissekere mikroskop, kan et trent individ forventes å generere mutant linjer som påvirker 12 gener innen 12 måneder. Den strømlinjeformede generasjon hPSC mutanter på kort tid gir mulighet for systematisk analyse av en rekke transkripsjonsfaktorer og / eller signalveien komponenter som samhandler med hverandre, regulere utviklingsprosess 9. I tillegg effektiv multiplekset genet targeting åpner også døren for å undersøke genetiske interaksjoner underliggende komplekse menneskelige trekk.

Generering av Nøyaktige genetiske modifikasjoner

Avledning av pasientspesifikke iPSCs fra lett tilgjengelige somatisk celletype s og differensiering i sykdoms relevant celletyper gir en flott mulighet for den funksjonelle validering av sykdomsassosierte mutasjoner. Men på grunn av den betydelige variasjon i genetisk bakgrunn mellom individer, direkte sammenligninger mellom iPSCs fra pasienter og fra friske donorer ikke tillater en å skille sykdom fenotyper fra bakgrunnseffekter. Derfor er det nødvendig å generere isogene kontroll iPSCs ved å korrigere sykdommen mutasjonen tilbake til villtype-sekvensen, eller for å innføre de pasientspesifikke mutasjoner inn i en hPSC bakgrunn vill-type, som foreslått av andre 25, 26. I tillegg til tap-av-funksjon (null) mutasjoner, kan en nå mer presist dissekere sykdomsmekanismene gjennom innføring av en pasient-spesifikke sekvensendringer inn i den endogene locus i hPSCs, inkludert hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, eller dominant-negativ pasient mutasjoner.

ntent "> Precise genetisk modifikasjon anvender HDR for DSB reparasjon, i nærvær av en reparasjon mal. Siden det er mye mindre effektiv enn NHEJ-mediert DNA-reparasjon, en donor plasmid inneholdende pasientspesifikk mutasjon, en medikamentseleksjon kassett, og homologi armene har tidligere blitt brukt som reparasjons templat 2. Etter medikamentseleksjon og verifisering av pasientspesifikk mutasjon, blir et andre trinn vanligvis nødvendig for å fjerne den medikamentseleksjon kassetten. Mens de mest brukte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer etterlate gjenværende sekvens i det endogene locus, har bruken av piggyBac transposon tillatt for sømløs fjerning av medikamentseleksjon kassetten 27. i den senere tid korte ssDNA maler har også blitt vist å understøtte effektiv HDR med konstruerte DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donor plasmid , ssDNA kan direkte syntetiseres og således omgår tidkrevende kloningstrinn. Her må det blino vist at, ved ko-transfeksjon av gRNA og en ssDNA mal for å indusere homologi rettet reparasjon, kan iCRISPR anvendes for å innføre bestemte nukleotid-endringer med høy virkningsgrad. Dette er kritisk for ikke bare å dissekere rollen av essensielle nukleotider innenfor protein funksjonelle domener, men også for modellering av humane sykdoms mutasjoner og eventuelt korrigere disse sykdomsassosierte mutasjoner for terapeutisk intervensjon. På grunn av det store antallet mottakelighet loci som hver er forbundet med flere sekvensvarianter, å modellere komplekse og multigenic sykdommer slik som diabetes har vært en utfordring for genetikere. Som iCRISPR plattformen er ettergivende for den raske dannelse av en allelisk serie eller for multiplexable gen målretting, kan det lette undersøkelsen av flere sykdomsassosierte loci, enten individuelt eller i kombinasjon med isogene bakgrunn.

Målrette Effektivitet og Off-målet Effects

Vi har funnet en god korrelasjon mellom T7E1 og RFLP-analyseresultatene, og antallet mutant linjer identifisert ved sekvensering. Dette understreker viktigheten av å utføre disse analyser parallelt med etableringen av klonale linjer. Mens de er målrettet mot effektiviteter oppnås kan variere avhengig av det genomiske loci i de fleste enkelt-gen-målsøkende eksperimenter, 20 - 60% av klonene ble funnet med begge alleler mutert (inklusive i-ramme og rammeskiftmutasjoner) 9. I tilfeller der multiplexed genet målretting ble utført, ble trippel biallelic mutante kloner med 5-10% effektivitet oppnås 5. ssDNA-mediert HDR av flere gener ble også utført for å oppnå presise genetiske endringer, med effektiviteten av å skaffe homozygot knock-in kloner fra 1 - 10% 5. Arbeide med CRISPR / Cas i hPSCs, eventuelle mutasjoner i potensielle off-target nettsteder som ikke deler samme gRNA målsekvensen er ennå ikke oppdagetlass = "xref"> 5, 9, 12. Hel-genomsekvensering utført i en fersk studie har også unnlatt å identifisere betydelige off-target mutasjoner i klonale hPSC linjer generert ved hjelp CRISPR / Cas 29. Likevel, for å minimalisere eventuelle effekten av konfunderende fenotyper introdusert av mutasjoner ved off-target effekt områder, er det foreslått å generere uavhengige mutant linjer ved hjelp av minst to uavhengige gRNAs rettet mot ulike sekvenser innenfor samme genet. Lignende fenotyper observert i flere linjer generert ved hjelp av ulike gRNAs kan prinsipielt utelukke muligheten for at fenotype kommer fra en off-target effekt.

Feeder-avhengige versus Uavhengig Kultur og målretting

Tradisjonelle metoder for hPSC kultur involvere deres vedlikehold og utvidelse på feeder-celler i medier som inneholder serum eller serum erstatning som inkluderer dyr proddukter, slik som bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum erstatning, og albumin alle inneholder komplekse, udefinerte komponenter og viser stor batch variasjon. Tilpasning til materen fritt og kjemisk definert tilstand reduserer innsatsen for hPSC vedlikehold og, enda viktigere, øker konsistensen av differensiering eksperimenter. I dag er det svært få studier som beskriver genom redigering prosedyrer på hPSCs dyrket i fullt definerte kultur forhold 30. Vi har funnet høyere CRISPR rettet mot effektivitet når gRNA transfeksjon og klonal deponering ble utført i mater frie forhold i forhold til mateavhengige dyrkningsforhold. Vi tror at dette skyldes økt celle overlevelse etter transfeksjon og encellede seeding for kolonidannelse. Dessuten har feeder-celler tidligere er blitt vist å beslaglegge transfeksjon reagenser, for derved å senke transfeksjonseffektiviteten.

kombinereGenome Redigerer med Regissert Differensiering

Tidligere differensiering protokoller har gitt bare en liten brøkdel av insulin-positive celler, de fleste som var polyhormonal og lignet fosterets endokrine celler 23. Nyere fremskritt har tillatt differensiering av hPSCs til mer modne glukose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemessig få minst 75% definitive endoderm celler, 40% PDX1 + NKX6.1 + pancreatic stamfedre, og rundt 20% NKX6.1 + CPEP + glukose-responsive beta-lignende celler ved hjelp HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med iCRISPR genomet redigeringssystem, har dette mer robust differensiering protokollen tilrettelagt analyse av transkripsjonsfaktorer som er avgjørende for bukspyttkjertelen progenitor og endokrine stadier av bukspyttkjertel differensiering. Dette vil gjøredet er mulig, i fremtidige studier for å undersøke et stort antall kandidat sykdomsgener for den funksjonelle validering og gransking av mekanismene som ligger til grunn diabetes 9.

Fremtidige applikasjoner eller Veibeskrivelse

Vår iCRISPR Systemet kan bidra til generering av mer komplekse genomiske modifikasjoner, for eksempel etableringen av reporter alleler gjennom HDR-mediert genet targeting bruker lang donor DNA maler koding protein tags eller fluoriserende journalister 12. Vi har vist at, på grunn av den høye CRISPR målretting effektivitet oppnådd i systemet, kan denne prosessen utføres i hPSCs, uten behov for ytterligere medikamentseleksjon 12. Videre kan multiplekset genet målretting bli brukt til å undersøke genetiske interaksjoner liggende kompleks sykdom hos mennesker, som vist i vår nylig studie, som vi mener er det første eksempel på et slikt arbeid 31. ICRISPR kan også brukes til å forstå gen regulatorisk kontroll ved å skape delesjoner enten i ikke-kodende RNA eller i-gen regulerende områder, slik som promotere og enhancere. Til effektivt å generere regulerings mutanter ved hjelp av iCRISPR kan gRNAs være utformet for å forstyrre bindingssetet av en DNA-bindende protein, inkludert, men ikke begrenset til basaltranskripsjonelle maskiner eller et vev-spesifikk transkripsjonsfaktor. ssDNA mal-mediert HDR kan også brukes for å mutere spesifikke proteinbindingsseter. Til slutt, ser vi for oss at ytterligere optimalisering vil muliggjøre bruken av iCRISPR plattformen i hPSCs for høyere gjennomstrømning genetiske analyser av pluripotency fenotyper eller sykdoms fenotyper når den kombineres med en in vitro differensiering protokollen. Disse iCRISPR-mediert studier kan gi rom for raskere identifisering av kandidatsykdomsassosierte gener og studier av deres funksjonelle relevans.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert delvis av NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ ble støttet av NYSTEM postdoktorstipend fra Center for Stem Cell Biology av Sloan Kettering Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemically defined medium (E8) Thermo Fisher Scientific A1517001 Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included
Truncated recombinant human form of vitronectin Thermo Fisher Scientific A14700
ROCK inhibitor Y-27632 Selleck Chemicals S1049
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563029 1x, animal origin free, recombinant enzyme
G418 Sulfate Thermo Fisher Scientific 10131035 Geneticin Selective Antibiotic
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P8833 Puromycin Selective Antibiotic
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) Agilent Technologies 600679 PCR kit
MEGAshortscript T7 Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1354
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
Opti-MEM medium Thermo Fisher Scientific 31985062 Reduced Serum Medium
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778150
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN 69504 Genomic DNA extraction kit
Proteinase K Roche 3115879001
MCDB 131 medium Thermo Fisher Scientific 10372-019
BLAR medium Thermo Fisher Scientific Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)
L-glutamine supplement (GlutaMAX) Thermo Fisher Scientific 35050061
NaHCO3 Thermo Fisher Scientific 144-55-8
Glucose Sigma-Aldrich G8769
BSA LAMPIRE Biological Laboratories 7500855 Fatty acid free
GDF8 PeproTech 120-00
CHIR-99021 Stemgent 04-0004 GSK-3 inhibitor
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Vitamin C
FGF7 R&D Systems 251-KG
SANT1 Tocris Bioscience 1974 Hedgehog inhibitor
RA Sigma-Aldrich R2625 Retinoic acid
LDN Stemgent 04-0019 BMP inhibitor
IWP-2 Tocris Bioscience 3533 Wnt antagonist 
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056
TPB EMD Millipore 565740-1MG PKC activator
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
ALK5i II Enzo Life Sciences ALX-270-445 ALK5 inhibitor II
ZnSO4 Sigma-Aldrich Z0251
Heparin Sigma-Aldrich H3149
GSiXX EMD Millipore 565789 Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma-Aldrich A9165
Trolox EMD Millipore 648471 Vitamin E analogue
R428 Selleck Chemicals S2841 AXL receptor tyrosine kinase inhibitor
24 mm Transwell with insert Corning Life Sciences 3414
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660
0.4 cm Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652081
AAVS1-TALEN-L Addgene 59025
AAVS1-TALEN-R Addgene 59026
AAVS1-Neo-M2rtTA Addgene 60843
AAVS1-Puro-iCas9 Addgene 58409
T7 Endonuclease I NEB M0302L
Buffer 2 NEB B7002S NEBuffer 2
Long oligonucleotide Eton Bioscience or IDT
SOX17 antibody R&D Systems AF1924 1:500
FOXA2 antibody Millipore 07-633 1:100
CXCR4-APC antibody R&D Systems FAB170A 1:25
PDX1 antibody R&D Systems AF2419 1:500
NKX6.1 antibody DSHB F55A12 1:500
NKX2.2 antibody DSHB 74.5A5 1:100
NEUROD1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-1084 1:100
Insulin antibody Dako A0564 1:2,000
C-peptide antibody DSHB GN-ID4-c 1:2,000
Glucagon antibody Sigma-Aldrich G2654 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  2. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  3. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).
  4. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  5. González, F., et al. An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  8. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).
  9. Zhu, Z., et al. Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes. Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).
  10. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  11. Carlson-Stevermer, J., et al. High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).
  12. Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).
  13. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Rezania, A., et al. Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).
  16. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  17. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  18. Chen, S., et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage. Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).
  19. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  20. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  21. Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).
  22. Soh, C. L., Huangfu, D. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium. Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).
  23. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  24. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).
  25. Musunuru, K. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).
  26. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  27. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  28. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  29. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  30. Huang, X., et al. Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  31. Shi, Z. D., et al. Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development. Cell Stem Cell. , in press (2017).

Tags

Genetikk CRISPR / Cas9 iCas9 genom redigering AAVS1 menneskelige pluripotente stamceller bukspyttkjertel differensiering glukose-responsive e-lignende celler diabetes
Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z.,… More

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z., Huangfu, D. Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development. J. Vis. Exp. (121), e55267, doi:10.3791/55267 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter