Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55267
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute
* These authors contributed equally

Summary

Protokoll för att generera hPSC muterade linjer med hjälp av iCRISPR plattformen och att differentiera hPSCs till glukos-responsiv p-liknande celler beskrivs. Kombinera genomet redigering teknik med hPSC riktad differentiering ger en kraftfull plattform för systematisk analys av den roll som linjebestämnings i mänsklig utveckling och sjukdomsprogression.

Abstract

Fråge geners funktion i självförnyande eller differentiera humana pluripotenta stamceller (hPSCs) erbjuder en värdefull plattform mot att förstå människans utveckling och dissekera sjukdomsmekanismer i en skål. Att kapitalisera på denna potential ansökan kräver effektiva genomet redigeringsverktyg för att skapa hPSC mutanter i sjukdomsassocierade gener, liksom in vitro hPSC differentieringsprotokoll för att producera sjukdoms relevanta celltyper som är nära rekapitulera sina in vivo motsvarigheter. En effektiv genomet redigering plattform för hPSCs namnges iCRISPR har utvecklats genom talen-medierad inriktning av en Cas9 expressionskassett i AAVS1 locus. Här, är protokollen för generering av inducerbara Cas9 hPSC linjer med celler som odlats i ett kemiskt definierat medium och en matare fritt tillstånd beskrivas. Detaljerade förfaranden för användning av iCRISPR system för gen knockout eller exakta genetiska förändringar i hPSCs, antingen genom non-homologa ände sammanfogning (NHEJ) eller via exakta nukleotidförändringar med användning av en homologi-riktad reparations (HDR) mall, respektive, är inkluderade. Dessa tekniska procedurer omfattar beskrivningar av konstruktion, produktion och transfektion av crispr styr RNA (gRNAs); mätningen av crispr mutationshastighet av T7E1 eller RFLP-analyser; och upprättande och validering av klonade muterade linjer. Slutligen, vi krönika förfaranden för hPSC differentiering till glukos-responsiv pankreatiska p-liknande celler genom att härma in vivo pankreas embryonal utveckling. Kombinera iCRISPR teknik med riktad hPSC differentiering möjliggör systematisk undersökning av geners funktion för att främja vår förståelse av bukspottkörteln utveckling och diabetes sjukdomsmekanismer.

Introduction

Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har förmågan att både själv förnya och ge upphov till alla derivat av de tre embryonala köns linjerna. De ger en värdefull resurs för cellersättningsterapi och sjukdom modellering genom att fungera som en unik plattform för att rekapitulera cellulära processer i ett mänskligt utvecklingssammanhang. De är också en källa av experimentella celler för skalbara, hög kapacitet analyser. Framstegen har dock varit begränsad på grund av två huvudsakliga utmaningar: bristen på effektiva genetisk modifiering verktyg och svårigheten att rekapitulera de komplexa embryonala utvecklingssteg i en odlingsskål.

Genmodifiering är ett oumbärligt verktyg för att studera geners funktion i normal utveckling och sjukdomar. Men medan klassisk gen med inriktning på metoder via homolog rekombination har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att analysera geners funktion i mus embryonala stamceller (mESCs) 1, detta tillvägagångssätthar varit mycket ineffektiv när det appliceras på hPSCs 2, 3. Den senaste tidens rask anslutning programmerbara, platsspecifika nukleaser från naturen till laboratorieanvändning, inklusive zinkfinger nukleaser (ZFNs), transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens), och de klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / crispr-associerade (Cas) system 4, innebär att genomet engineering har blivit en mycket enklare uppgift i ett brett spektrum av organismer och cellinjer, inklusive i hPSCs. Dessa gen redigeringsverktyg dra fördel av det faktum att chimära nukleaser såsom Cas9 endonukleas kan tillåta en hel rad genetiska modifieringar genom att inducera dubbelsträngade avbrott (DSB) vid exakta platser, utlöser den endogena DNA-reparation maskiner för att aktivera antingen icke-homolog sluta att gå (NHEJ) eller homologi riktad reparation (HDR). Båda mekanismerna kan utnyttjas för genetisk manipulation genom att inducera either slumpmässig insättning och deletionsmutationer (InDels, via NHEJ), för att skapa ramskiftningsmutationer som upphäver gen alleler, eller exakta nukleotidsubstitutioner (via HDR), för att rekapitulera patientens mutationer för humant modellering sjukdom eller för att korrigera en sjukdomsorsakande mutation för genterapi .

Crispr / Cas-medierad genom teknik kräver två komponenter: den ständiga RNA-styrda Cas9 endonukleas som krävs för DNA-klyvning och en rörlig crispr RNA (crRNA) och trans-aktiverande (tracrRNA) duplex som anger DNA måligenkännande. Den crRNA / tracrRNA duplex kan ersättas med en enda chimär styr RNA (gRNA), som har visat sig fungera mer effektivt 5, 6, 7. Medan crispr / Cas9-systemet har anpassats till de experimentella organismer och cellinjer, leverans och uttryck av Cas9 och gRNA varierar avsevärt och behöver optimeras ytterligare för att Achieve effektiv genomet redigering i många system, inklusive hPSCs 8. En effektiv genom-redigering plattform, iCRISPR, har etablerats i hPSCs 5. I detta system har en Talen-medierad tillvägagångssätt använts för att rikta in de båda allelerna av "transgen säker hamn locus" AAVS1 i träns, ett allel med en omvänd tetracyklin-kontrollerad transaktivator (M2rtTA) och den andra med en tetracyklin responselement (TRE ) som driver uttrycket av Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerade klonala linjer (iCas9 hPSCs) är Cas9 starkt uttrycks med doxycyklin behandling. Samtidigt, på grund av sin ringa storlek (100 nt), enstaka eller flera gRNAs kan lätt levereras till iCas9 hPSCs med hög verkningsgrad och kan rikta Cas9 för platsspecifik klyvning, möjliggör en effektiv NHEJ-medierad gen störningar, liksom HDR-medierad precisa nukleotid modifieringar i närvaro av korta enkelsträngat DNA (ssDNA) donator mallar. Den iCRISPR systemet kan varaanvänds för att framgångsrikt generera en panel av sjukdomsliknande hPSC rader med bialleliska (homozygot eller förening heterozygot) eller heterozygota förlust av funktionsmutationer i viktiga utvecklings gener 5, 9. Medan ett antal grupper har rapporterat effektiv gen redigering med hjälp av crispr / Cas i hPSCs förblir framgång begränsad till ett litet antal tekniskt skickliga laboratorier. Den iCRISPR plattformen erbjuder en effektiv men ändå enkel lösning för rutin gen redigering av forskare på olika nivåer, och det har redan använts i ett antal publicerade studier av vår grupp och andra 9, 10, 11, 12. Detta tillvägagångssätt har också utvidgas till inducerbar tysta baserat på uttrycket av dCas9-KRAB 13.

Tillsammans med framsteg inom genomet redigering technonik, betydande förbättringar har också gjorts i hPSC underhåll och riktade differentiering. Odlingsbetingelser för hPSCs har utvecklats från bestrålad mus embryonala fibroblaster (Imef) matar beroende på matarfria förhållanden på definierade extracellulära matrixkomponenter och från komplexa medier formuleringar för att kemiskt definierade mediumförhållanden 14. Sådana förbättringar har minskat variationen i hPSCs på grund av sats till sats skillnader i Imef förberedelse och knockout serumersättningskomponenter, och därmed ge en mer reproducerbar miljö för hPSC differentiering. Samtidigt ökad kunskap om signalvägar som styr mänsklig embryonal utveckling, samt upptäckter från hög genomströmning drog filmvisningar, har lett till förbättrade differentieringsprotokoll 15, 16, 17, 18. Dessa protokoll närmare efterlikna i vivo utvecklingssteg och generera celltyper som är nära rekapitulera sina in vivo motsvarigheter. För hPSC differentiering i bukspottkörtelns härstamning, första protokoll härmade tidig pancreatic utveckling relativt väl men så småningom genererade polyhormonal p-celler som var omogna foster fenotyper och svarade dåligt på glukosstimulering. Senaste framstegen 16, 17, 19, 20 har gjort det möjligt för genereringen av glukoskänslig pankreatiska p-liknande celler, som gör det möjligt för oss att undersöka senare händelser, såsom bildningen och den ytterligare mognaden av monohormonal p-celler.

Här, vi detalj tillämpningen av genomet modifierade linjer för studien av pankreatisk utveckling genom att kombinera iCRISPR systemet med hPSC-baserade in vitro differentiering plattformen mot glukos-responsiv pancreatic p-liknande celler. Denna koppling av kraftfulla genomet redigeringsverktyg med ett förbättrat hPSC differentiering protokollet ger inte bara snabbare och krävs för att möta den växande efterfrågan för att validera sjukdom kausalitet, utan möjliggör även avancerade genetiska manipulationer för ytterligare mekanistiska undersökningar transkriptionskontroll underliggande normal utveckling och sjukdomar 9 .

Protocol

Detta protokoll är baserad på vårt arbete med hPSC linjer H1, HUES8 och Mel-1 i det kemiskt definierade och feeder-fria tillstånd (Se Material och utrustning tabell). För andra hPSC linjer eller hPSCs hålls i olika odlingsbetingelser, är ytterligare optimering rekommenderas.

1. hPSC kultur i kemiskt definierade och Feeder fritt skick

  1. Anpassa hPSC kultur på Imef matare till mataren fritt tillstånd. I de fall där frusna celler inte överleva bra när direkt återvinns i mataren fritt tillstånd, återställa celler i Imef tillstånd först och anpassar sedan till matarfritt tillstånd.
    OBS: I allmänhet tar det 2 passager för hPSCs odlade på Imef matare som ska anpassas till mataren fritt tillstånd.
  2. Ändra mediet varje dag och passage de hPSCs när cellerna har nått ~ 80% konfluens. I allmänhet, passage hPSCs på ~ 1: 6 - 1:15 nyckeltal var 4 - 6 dagar. Tillsätt 10 ^ M ROCK inhibitor Y-27632 whsv upptining eller passage av cellerna.
  3. Före ympning av hPSCs, pre-coat odlingsskålar med 5 mikrogram / ml (1 ml / 10 cm 2) trunkerad rekombinant human form av vitronektin (VTN) under minst 1 h vid rumstemperatur (RT). Också förbereda komplett kemiskt definierat medium genom att tillsätta tillägg till det basala mediet.
  4. Avlägsna odlingsmediet, tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca2 + och Mg2 +, och behandla cellerna med 0,5 mM EDTA under ~ 2-5 min vid rumstemperatur.
  5. Aspirera EDTA innan kolonierna har lossnat. Med försiktig pipettering, skingra hPSC kolonier i små bitar och suspendera cellerna i komplett medium.
  6. Samla in de dissocierade hPSCs och spinn ner cellerna vid 200 xg under 5 min. Resuspendera pelletiserade hPSCs i det kompletta mediet och utsäde cellerna på VTN-belagda plattor.

2. Framställning av iCas9 hPSC Lines

  1. Order och förstärka följande plasmider: AAVS1-talen-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA, och AAVS1-Puro-iCas9.
    OBS: För att undvika oväntade rekombinationshändelser använder rekombination fattiga Stbl3 kompetenta celler för omvandling och förstärkning av plasmider vid 30 ° C.
  2. Vanligtvis förbereda hPSCs i en 10-cm skål (~ 1 x 10 7 celler om ~ 80% konfluenta) för en inriktning experiment.
    OBS: Eftersom elektroporering orsakar oftast betydande celldöd och Talen-förmedlad genmålsökning i AAVS1 lokuset kräver antibiotisk selektion, ett relativt stort antal celler måste ympas för att identifiera korrekt målsökta celler. Optimering för de läkemedelskoncentrationer rekommenderas för varje cellinje och varje odlingsbetingelse.
  3. På dag -1, (dagen före elektroporering), tillsätt 10 ^ M ROCK-hämmare under medieförändringen.
  4. På dag 0, (dagen för elektroporering), förbereda VTN-belagda plattor i förväg.
  5. Dissociera hPSCs i enskilda celler USIng 1x dissociation reagens (se Material och utrustning tabell). Kortfattat, ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca2 + och Mg2 +, och behandla cellerna med 1x dissociation reagens vid 37 ° C under ~ 3 min. Aspirera dissociation reagens innan cellerna har lossnat. Med försiktig pipettering, skingra hPSCs till en encelliga suspension i 10,5 ml komplett medium.
  6. Ta 0,5 ml cellsuspension för att räkna antalet celler med hjälp av en automatiserad cellräknare. Pelletera hPSCs vid 200 xg under 5 min och resuspendera cellerna i kall (4 ° C) PBS vid 12,5 x 10 6 celler / ml.
  7. Tillsätt plasmider (se tabell 1) in i 800-mikroliter hPSC suspension (12,5 x 10 6 celler / ml) och blanda väl. Överför blandningen till en 0,4-cm elektroporationskyvett och hålla på is under ~ 5 min.
  8. Electroporate cellerna med hjälp av ett elektrosystem vid 250 V och 500 iF; de ständiga obs tiderved efter elektroporering är typiskt 9 - 13 ms.
  9. Efter elektroporering, överföra celler till en 15-ml koniska rör med 5 ml förvärmda komplett medium. Kritiskt för framgångsrik inriktning: Använd sunt prolifererande hPSCs och hantera cellerna mycket försiktigt vid överföring, återsuspendering och plätering cellerna efter elektroporering.
  10. Pelletera cellerna vid 200 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i 10 ml komplett medium med 10 pM ROCK-inhibitor och plattan 1, 2,5, och 5 x 10 6 celler på var och en av de tre VTN-belagd, 10-cm skålar; detta säkerställer att åtminstone en av plattorna kommer att ha tillräckliga kolonier vid encelliga klonal densitet för koloniplockning.
  11. Dag 1 (dagen efter elektroporering), ändra mediet.
  12. Dag 2-5, startar neomycin val när cellerna är ~ 60% konfluenta. Ändra mediet dagligen med 500 | j, g / ml G418 sulfat; signifikant celldöd på grund av selection typiskt observeras 2 dagar efter G418 val.
  13. På dag 6, ändra medium utan antibiotikaselektion.
  14. På Days 7-9, börja puromycinselektion. Ändra mediet dagligen med 1 mikrogram / ml puromycin dihydroklorid; signifikant celldöd bör observeras nästa dag.
  15. På dag 10, börjar ändra mediet dagligen utan antibiotikaselektion tills hPSC singel-cellkolonier nå 1 - 2 mm i diameter.
    OBS! Normalt är 50 kolonier i en 10-cm skål observerades med 2,5 x 10 6 hPSCs pläterade på dag 0.
  16. Pick 12 - 24 kolonier under ett stereomikroskop. Mekaniskt disaggregera de hPSC kolonier i små bitar (~ 10 stycken per koloni) med användning av en 23 G-nål (en 200-mikroliter pipettspetsen är också bra) och överföra celler direkt in VTN-belagda 24-brunnars plattor.
  17. Ändra mediet dagligen tills cellerna blir konfluenta. Passage cellerna i varje brunn i 24-brunnsplattor idubbla brunnar i sex-brunnars plattor.
  18. När cellerna blir sammanflytande i 6-brunnsplattor, använda en brunn för en frusen lager och andra väl för genomisk DNA-extraktion för ytterligare karakterisering.
  19. Karakterisera och validera de etablerade iCas9 linjerna genom PCR genotypning, Southern blotting, RT-qPCR analys karyotypering och pluripotens analys. Se Zhu et al. 21 för detaljerade experimentella procedurer.

3. Framställning av hPSC Mutant Lines Använda iCRISPR System

  1. Generation hPSC knockout linjer
    1. gRNA design och produktion
      1. Välja målregionerna i den intressanta genen för att maximera möjligheten att störa vildtyp proteinfunktion. För väl kommenterade gener, välja ett målområde uppströms en väsentlig funktionell domän. Alternativt kan konstruktions gRNAs rikta en region nedströms om startkodonet. Välj åtminstone två olikaregioner för en gen av intresse.
      2. Design gRNAs använder online crispr designverktyg (http://crispr.mit.edu). För varje målområde, design 3 gRNAs med låg potential off-mål och använda den med den högsta inriktning effektivitet för att generera klonal mutant linje 22.
        OBS: För att uppnå hög genomet redigering effektivitet, är det rekommenderat att leverera gRNA som RNA oligos i stället för som plasmid-DNA på grund av den högre transfektion effektivitet små RNA jämfört med plasmider i tidigare erfarenheter.
      3. Beställa 120 nukleotid (nt) DNA-oligos innehållande T7-promotorsekvensen, den variabla 20-nt crRNA igenkänningssekvensen (N) 20 (inkluderar inte PAM-sekvensen), och den konstanta chimära styrsekvens. Späd oligos till 100 iM stamlösning i DDH 2 O och förbereda 250-nM som arbetslösning.
        OBS: TAATACGACTCACTATAGGG (N) 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplifiera oligos med användning av de T7F och TracrR primrar (se tabell 2) för att producera det dubbelsträngade DNA (dsDNA) mall för gRNA in vitro-transkription (IVT). Använda 50 mikroliter av PCR-reaktionsblandningen (se tabell 3) och PCR-cykelförhållanden (se tabell 4).
      5. Använd en hög avkastning T7 transkription kit för in vitro gRNA transkription med PCR-förstärkta mall i 20 mikroliter in vitro gRNA transkriptionsblandning (se tabell 5) enligt tillverkarens anvisningar. Rena gRNA produkter med hjälp av transkriptions sanering kit enligt tillverkarens anvisningar.
      6. Eluera gRNAs efter hög genomströmning reningsprotokoll enligt tillverkarens instruktioner (typiskt ~ 50-100 pg) i 100 mikroliter elueringsbuffert. Justera koncentrationen till 320 ng / l (10 M) när det är möjligt och förvara vid -80 &# 176; C fram till användning.
    2. PCR och Sånger sekvenseringsprimer utformning
      1. Design och validera PCR-primrar som amplifierar målregionen, med produktstorlekar som typiskt sträcker sig från ~ 500 - 1000 bp.
      2. Design Sanger sekvenseringsprimrar bindande internt till PCR-produkterna för att tillåta direkt sekvensering av PCR-produkterna utan rening.
    3. gRNA transfektion i iCas9 hPSCs
      1. På dag -1, behandla iCas9 celler med 2 mikrogram / ml doxycyklin 24 timmar före gRNA transfektion.
      2. På dag 0 av gRNA transfektion, förbereda VTN-belagda plattor i förväg.
      3. Dissociera iCas9 celler till enskilda celler genom att använda 1x dissociation reagens, som beskrivs i steg 2,5.
      4. Pelletera hPSCs vid 200 xg under 5 min och resuspendera cellerna vid ~ 0,5 x 10 6 celler / ml i fullständigt medium kompletterat med 2 | j, g / ml doxycyklin och 10 pM ROCK-inhibitor. Platta 0,5 ml av de resuspenderade cellerna i individuella brunnar i 24-brunnsplattor. Förbereda ytterligare brunnar för att fungera som icke-transfekterade kontroller.
      5. För varje gRNA, gör följande transfektion blandningar: Blanda A, 50 mikroliter av minskad serummedium + 1 mikroliter av gRNA (10 ^ M); Mix B, 50 mikroliter av minskad serummedium + 3 mikroliter av transfektion reagens.
      6. Kombinera Mix A och B för att göra 100 mikroliter blandning. Inkubera under 5 min vid RT. Tillsätt 50 mikroliter av blandningen till celler i dubbla brunnar hos de 24-brunnsplattor och blanda väl.
      7. På dag ett, utföra en andra transfektion om det behövs för att ytterligare öka den målsökande effektiviteten. Annars ändra medium utan doxycyklin.
      8. Dag 2-3, ändra mediet dagligen.
      9. På dag 4, extrahera genomiskt DNA från en brunn av varje transfekterade och icke-transfekterade kontrollcell med användning av ett DNA-extraktion kit. Justera koncentrationen till 50 ng / μL.
      10. PCR-amplifiera målregionerna flankerar gRNA målsökningssekvenser och uppskatta redigeringseffektivitet med användning av T7-endonukleas I (T7EI) digestion eller restriktionsfragmentlängd-polymorfism (RFLP) -analys, som beskrivits tidigare 5.
    4. T7EI assay
      1. PCR-amplifiera målregionen med hjälp av primrar utformade och validerade i steg 3,1.
      2. Förbered blandningar (se tabell 6) och utför DNA-denaturering och hybridisering av PCR-produkter som använder villkor som anges i tabell 7.
        OBS: Baserat på vår erfarenhet, är det i allmänhet inte nödvändigt att rena PCR-produkter för T7EI analysen vid användning av vår PCR tillstånd. Kunde dock rening vara fördelaktig vid andra förhållanden.
      3. Utföra en T7EI digerering vid 37 ° C under 30 min med användning av 10 mikroliter av denaturerad och hybridiserades PCR-produkt och 0,2 | il (2 U) av T7E1 (10 U / pl).
      4. resolvE T7E1-spjälkade PCR prover med gelelektrofores. Använd ImageJ att bestämma de relativa bandintensitetskär och uncut DNA. Beräkna Indel frekvens med användning av formeln: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, där a är intensiteten hos den osmält PCR-produkten och b och c är intensiteterna hos T7E1-klyvda produkter.
    5. RFLP-analys
      OBS: I de fall där ett restriktionsställe är i omedelbar närhet (<5 bp) till en Cas9 klyvningsställe (3 bp 5 'om PAM-sekvensen), kan utföras en RFLP-analys för att kvantifiera Indel frekvensen.
      1. Använd samma PCR-produkter som beskrivs i steg 3.1.4.1.
      2. Digerera PCR-produkten med ett restriktionsenzym som innehåller ett restriktionsställe i omedelbar närhet av den Cas9 klyvningsstället.
      3. Lös de uppdelade PCR prover med gelelektrofores. Använd ImageJ att bestämma de relativa bandintensitetskär och uncut DNA. Beräkna Indelfrekvens med användning av formeln: a / (a + b + c) x 100, där a är intensiteten hos den osmält PCR-produkten och b och c är intensiteterna hos de nedbrutna produkterna.
    6. Fastställande av klonade mutantlinjer
      OBS: Genome redigering i hPSCs använder iCRISPR systemet med gRNA transfektion är effektiv, och det behövs ingen antibiotikaselektion. Att etablera klonala linjer, är det nödvändigt att ympa celler vid en relativt låg densitet för att säkerställa bildningen av encelliga-härledda kolonier.
      1. Identifiera gRNAs med den högsta redigering effektivitet (med T7EI eller RFLP-analys) och med god cellöverlevnad. Använd motsvarande duplikat bra för klonal mutant linje anläggning.
      2. Dissociera hPSCs till en enda cellsuspension med användning av 1x dissociation reagens, såsom beskrivs i steg 2,5. Förnyad utbredning 500, 1000, och 2000 celler på var och en av de tre VTN-belagd, 10 cm rätter.
      3. Ändra mediet dagligen until den encelliga kolonier nå ~ 2 mm i diameter.
      4. Pick 24 - 48 kolonier för varje gRNA, beroende på uppskattningen av inriktnings effektiviteten av T7EI och / eller RFLP-analysen. Mekaniskt dela upp varje koloni i små bitar (~ 10 stycken per koloni) med användning av en 23 G-nål (en 200-mikroliter pipettspetsen är också bra) och förnyad utbredning av cellerna i dubbletter VTN-belagda, 96-brunnars plattor. Använd en platta för genomisk DNA-extraktion och Sanger-sekvensering och den andra plattan för ytterligare expansion.
      5. När cellerna i 96-brunnsplattor har blivit konfluent, extrahera genomiskt DNA (utan fenol / kloroform-extraktion) med användning av ett enkelt protokoll, som beskrivs nedan.
      6. Avlägsna mediet och tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +. Tillsätt 50 mikroliter av lyseringsbuffert (5 mikroliter av proteinas K (10 mg / ml), 5 | il av PCR-buffert 10x, och 40 mikroliter av DDH 2 O) till varje brunn i en 96-brunnsplatta. Förslut plattan med hjälp av en adhesiv film och incubate över natten vid 55 ° C.
      7. Nästa dag, överföra cellysat in i en 96-brunnars PCR-platta och inkubera i 10 min vid 99 ° C i en termocykler för att inaktivera proteinas K.
      8. PCR-amplifiera målregionen med användning av samma primers som för T7EI eller RFLP-analys, med användning av en mikroliter av cellysat som en mall.
      9. Använda 1 mikroliter av PCR-produkten för Sanger-sekvensering med en primer-bindning internt till PCR-produkten.
      10. Förstärka kloner med frame Indel mutationer för frysta lager. Dessutom förstärker ett par vildtyp kloner från samma inriktning experiment för att fungera som isogena styrledningar för ytterligare experiment.
  2. Generering av muterade rader med exakta nukleotidförändringar
    OBS: Jämfört med knockout-mutanter som genereras av icke-homolog sammanfogning (NHEJ), kan exakt nukleotid förändring uppnås genom homologi-riktad reparations (HDR) i närvaro av DNA repair mallar. Sådana exakta nukleotidförändringar möjliggör generering av patientspecifika mutationer i vildtyp hPSCs och för korrigering av mutationer i patientgenererade iPSCs.
    1. Design av ssDNA som en HDR-mall
      1. Design och producera 2 - 3 gRNAs i nära anslutning till en patient-specifik mutation, såsom beskrivs i steg 3.1.1.
      2. Utforma ett enkelsträngat DNA (ssDNA) som innehåller den patientspecifika mutationen flankerad av ~ 40-80 nt av homologi på varje sida som en HDR-mall.
      3. För att minska ytterligare skärning efter att rätt reparation, införa en tyst mutation till ssDNA-mall i regionen inom gRNA igenkänningssekvensen och i nära anslutning till PAM-sekvensen eller i PAM sekvensen själv, om möjligt.
      4. Om möjligt utforma tyst mutation för att introducera ett nytt restriktionsdigere webbplatsen samt så att den kan användas för att uppskatta reparationseffektiviteten med hjälp av RFLP-analysen.
      2. GRNA / ssDNA samtransfektion och inrättandet av klonlinjer
      1. Utför samtransfektion av gRNA / ssDNA in iCas9 celler, såsom beskrivs i steg 3.1.3, med transfektion blandningarna A och B. För varje gRNA och icke-transfekterade kontroll, transfektera cellerna i dubbla brunnar av 24-brunnsplattor. Blanda A: 50 mikroliter av minskad serummedium + 1 mikroliter av gRNA (10 M) + 2 mikroliter av ssDNA (10 M). Blanda B: 50 mikroliter av minskad serummedium + 3 mikroliter av transfektion reagens.
      2. Efter transfektion, extrahera genomiskt DNA från en brunn i varje transfekterade och icke-transfekterade kontrollcell och uppskatta reparationseffektiviteten med hjälp av T7EI och / eller RFLP-analys.
      3. Identifiera gRNA / ssDNA blandning med högsta reparations effektivitet och god cellöverlevnad. Använd motsvarande duplikat bra för klonal mutant linje anläggning.
      4. Pick 48 - 96 kolonier beroende på uppskattningen av den målsökande effektiviteten av T7EI och / eller RFLP assay. I allmänhet, är verkningsgraden hos HDR-medierad mutation lägre än knockout mutation och således fler kolonier måste plockas.
      5. Sekvens, expandera och validera klonala linjer, som beskrivs i steg 3.1.6.

4. In vitro hPSC Differentiering till glukos-responsiva pankreatiska p-celler

OBS: In vitro differentiering av hPSC mutanter i sjukdomsrelevanta celltyper ger en plattform för sjukdom modellering i en skål. Följande protokoll fokuserar på differentiering in vitro av hPSCs i glukoskänsliga pankreas P-celler för pankreasutvecklings och diabetesstudier 9, 16, 17.

  1. hPSC differentiering till definitiv endoderm
    1. Behåll hPSC mutanter och vildtyp styrledningar i det kemiskt definierade och matare fritt tillstånd, som beskriverd i steg ett.
    2. Att förbereda hPSCs för differentiering, dissociera hPSCs använder 1x dissociation reagens och sprida ut dem i encelliga suspension i komplett medium.
    3. Pelletera cellerna vid 200 xg under 5 min och återsuspendera cellerna i komplett medium med 10 pM ROCK-inhibitor. Räkna antalet celler och utsäde cellerna vid ~ 1,4 x 10 5 celler / cm2 på VTN-belagda plattor.
    4. Ändra mediet 24 h efter sådd.
    5. På dag 0, startar differentieringen efter 48 timmar, när cellerna har nått ~ 80% konfluens.
      OBS: För att uppnå hög pancreatic differentiering effektivitet, optimera såddtäthet och nivån av sammanväxning vid 48 h rekommenderas för varje enskild linje.
    6. Aspirera hPSC mediet och skölj cellerna en gång med PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +.
    7. Ändra mediet differentiering dag 0 (d0) medium.
    8. Dag 1-2, ändra differentiation mediet dagligen, enligt recepten i Tabell 8.
    9. Dag 3, undersöka de slutgiltiga endoderm markörerna SOX17, FOXA2 och CXCR4 av immunofluorescerande färgning och flödescytometri analys.
  2. Definitiv endoderm differentiering till pancreatic progenitor
    1. På dag 3-9, fortsätter slutgiltig endoderm differentiering mot den pankreatiska härstamning genom att ändra mediet dagligen, enligt recepten i Tabell 9.
    2. På dag 7, undersöka den tidiga pancreatic progenitor (PP1) markör PDX1 genom immunofluorescerande färgning och flödescytometri analys.
    3. På dag 10, undersöka senare pancreatic progenitor (PP2) markörer PDX1 och NKX6.1. Samtidigt förbereder sig för att överföra PP2 celler till luft-vätskegränssnitt för ytterligare differentiering i bukspottkörteln endokrina celler.
  3. Pankreatisk endokrin skiljerentiation i luft-vätskegränssnittet
    1. Behandla PP2 celler med 10 pM ROCK-hämmare 4 timmar före dissociation.
    2. Avlägsna mediet och skölj cellerna en gång med PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +.
    3. Tillsätt 2 ml 1x dissociation reagens till PP2-celler i en 10-cm skål och inkubera vid 37 ° C under 2-3 min.
    4. Aspirera dissociation reagens innan cellerna har lossnat. Tillsätt 10 ml Blar medium och skingra PP2 celler i enstaka celler genom att försiktigt pipettera upp och ned.
    5. Uppsamla det enkel-cellsuspension. Räkna antalet celler och pellet vid 200 xg under 5 min.
    6. Resuspendera cellpelleten vid ~ 0,5 x 10 5 celler / mikroliter i S5 differentieringsmedium och plats 5-10 mikroliter av celler per fläck på en transwell insatsfilter. Placera 10 - 15 platser i en 6-brunns insats och ~ 100 platser i en 10-cm insatsen.
    7. Lägg S5 medium till botten av varje transwell insats, ~ 1,5 ml för sex brunnar skär och ~ 8 ml feller 10-cm skär.
    8. Ändra mediet dagligen med recepten i Tabell 10.
    9. Undersöka pancreatic endokrina markörer PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insulin, och glukagon på dag 34 genom immunofluorescerande färgning och flödescytometri analys 17.
    10. Undersök hPSC härrörande β-liknande cellfunktion med en glukosstimulerad insulinutsöndring (GSIS) -analys 16, 17.

Representative Results

hPSC kemiskt definierade och Feeder-fri kultur Anpassning och underhåll

hPSCs odlade på Imef matare snabbt kan anpassas till VTN-belagda plattor i mataren fria odlingsbetingelser. Samma delningsförhållande som normal Imef feeder kultur kan användas under anpassning. Figur 1A visar typiska morfologier av hPSCs på Imef matare i KSR baserat medium och på en VTN-belagd yta i mataren fritt medium. Figur 1B visar en typisk morfologisk förändring och tillväxt hPSC kolonier under den första passagen av anpassning (4 dagar). Cellerna kan vara ytterligare passe eller frysas för framtida experiment. Utför 2 - 3 passager anpassning kultur innan differentieringsexperiment. Karyotypering rekommenderas också efter anpassning, även om vi inte har observerat karyotyp avvikelser under anpassningen fasen.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> generation av iCas9 hPSC Lines genom talen-medierad AAVS1 Targeting

Som visats tidigare, var hPSCs elektro med ett par AAVS1 Talen plasmider och Cas9 och M2rtTA plasmider 5. Figur 2A och B visar detaljerad donatorvektor inriktning design och hela proceduren att generera iCas9 hPSC klonala linjer. Efter antibiotikaselektion, encelliga-härledda kloner uppvisar tillräcklig storlek och typiska hPSC morfologi var redo att plockas (10 - 12 dagar efter elektroporering, figur 2C). Vanligtvis ~ 50% av klonerna är korrekt riktade utan slumpmässiga integrationer, vilket skall verifieras genom Southern blotting (figur 2D) 5. Slumpmässig integration kan orsaka läckande uttryck av Cas9 i frånvaro av doxycyklin behandling.

Effektiv Genetisk Modification i hPSCs Använda iCRISPR Platform

I etablerade iCas9 hPSCs är Cas9 uttrycks med doxycyklin behandling och styrs till sitt mållokuset av de transfekterade gRNAs, där den genererar DSB. I avsaknad av en mall reparation, DNA-reparation genom NHEJ genererar InDels, vilket ofta resulterar i gen störningar eller knockout. I närvaro av en mall reparation (t.ex. ett ssDNA donator), kan HDR användas för exakta genetiska förändringar, såsom att alstra en patientspecifik mutation i en vildtyp hPSC bakgrund eller korrigera en sjukdomsassocierad genetisk variant i patient härledda iPSCs (figur 3a). Det tar cirka 1 månad för att generera klonala mutantlinjer använder iCRISPR systemet. Efter iCas9 induktion och gRNA transfektion, T7EI och / eller RFLP-analyser användes för att bedöma Cas9 skäreffektivitet, och de transfekterade cellerna senare ympades som enskilda celler i 10-cm skålar vid låg densitet (~ 500-2, 000celler / 10-cm skål). 10 - 12 dagar senare, var encelliga-härledda kloner placerades i brunnarna på en 96-brunnars platta för expansion och ytterligare karaktärisering (dvs., genotypning och Western blotting) (figur 3B). Eftersom iCRISPR-medierad gen knockout är effektiv, är ingen urvalsprocessen inblandade, och vanligen 20-50% bialleliska mutanter kan lätt uppnås (Figur 3C) 5. För effektiva och exakta genetiska förändringar, gRNAs samtransfekteras med en ssDNA donator som bär den specifika sekvensen förändring (för en liten men viss förändring av arvsmassa). Ofta, för att förhindra återskärning i modifierade alleler, är det rekommenderat att inkludera en tyst mutation i omedelbar närhet av eller i PAM-sekvensen (Figur 3D). Med detta system, ~ 10% av kloner som bär den önskade HDR-medierad genom modifiering utan ytterligare ändringar i båda allelerna uppnås (figurerna 3E). Den snabba och precise modifiering av hPSC genomet med hjälp av iCRISPR plattformen ger oss möjlighet att snabbt och effektivt göra hPSC linjer som fungerar som modeller för att studera människans utveckling och sjukdom.

Effektiv Differentiering av hPSCs mot glukos-responsiv p-liknande celler

Den senaste tidens framsteg i hPSC pankreas differentiering har möjliggjort utvecklingen av protokoll som är nära sammanfatta pankreas embryonal utveckling. Odifferentierade hPSCs först differentieras till den slutgiltiga endoderm, sedan i PDX1 + tidiga pankreatiska progenitorceller (PP1) och PDX1 + NKX6.1 + senare pankreatiska progenitorceller (PP2), och slutligen till glukos-responsiva β-liknande celler 16, 17, 19, 20 23, 24. dessa protocOLS var ytterligare optimerad för att på ett tillförlitligt sätt generera PDX1 + NKX6.1 + bukspottkörteln progenitorceller och glukoskänslig p-liknande celler 9. Figur 4A visar de detaljerade kemiska kosttillskott som används i varje steg av differentiering. Vanligtvis är ~ 80% konfluens 2 dagar efter den initiala cell pläteringen idealisk för start av differentiering av HUES8 hPSCs (Figur 4B). Testa flera olika sådd densitet rekommenderas för att upptäcka den optimerade tillstånd för varje specifik cellinje. Vanligen åtminstone 75% FOXA2 + SOX17 + celler vid DE steget och 40% PDX1 + NKX6.1 + celler vid PP2 stadium kan uppnås (Figur 4C). Vid S5 skede, är närvaron av en aura liknande form runt cellaggregat en indikator för god överlevnad hos cellerna, vilket är viktigt för ytterligare differentiering till NKX6.1 + CPEP + glukoskänslig p-liknande celler (Figur 4D ). Detta protokoll är användbar för att studera human pankreas d tveckling och sjukdom i en skål.

Figur 1
Figur 1. hPSC kemiskt definierade och Feeder fritt underhåll och kultur Anpassning från Imef matare. (A) Representativa bilder av hPSCs odlas på Imef matare eller VTN på dag 4, redo att delas. (B) typisk morfologi hPSCs under den första passagen av anpassning till matar fri kultur från en Imef matare. Dag 4 hPSCs odlade på Imef matare delades och ströks ut på VTN-belagda plattor i kemiskt definierat medium med ROCK-hämmare. Den delningsförhållande var densamma som den vanliga delningsförhållande för odling i Imef matarförhållanden. Mediet byttes varje dag utan ROCK-hämmare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2. Framställning av iCas9 hPSC Lines. (A) Inriktning strategi för generering av iCas9 hPSC linjer. Puro-Cas9 donator och Neo-M2rtTA donator riktade in i den mänskliga AAVS1 locus av ett par AAVS1 Talens. (B) Schema för hela inriktning processen, inklusive elektroporering, antibiotisk selektion, koloni plockning och expansion, och cellinje karakterisering. (C) representant encelliga klon redo att plockas på cirka 10-12 dagar efter elektroporering. (D) Southern blot exempel för att identifiera korrekt riktade kloner utan ytterligare integration av två givar plasmider. Rätt kloner är markerade i rött. (A) och (D) var anpassade från Referens 5, med tillstånd.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Effektiv Genmodifiering i hPSCs Använda iCRISPR System. (A) Schema för generering av genutslagning mutanter eller exakta genen modifiering med användning av iCRISPR systemet. (B) Inriktning förfarande och klon linje etablering. (C) Gene knockout effektivitet genom NHEJ i hPSCs 9. (D) Konstruktion av en ssDNA bär en specifik nukleotid modifikation. P, i rött: patientspecifika mutation; X, i grönt: tyst mutation. (E) Effektivitet av HDR-medierad exakt nukleotid modifikation. En exakt R456C mutation (orsakad av en specifik nukleotid C> T-mutation) i GATA6 lokuset infördes med användning av iCRISPR systemet.(Se Referens 5 för mer detaljerad information). (C) och (E) anpassades från referens 9 och referens 5, respektive, med behörigheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Riktad hPSC differentiering till glukos-responsiv pankreatiska p-liknande celler. (A) Schema för detaljerad differentieringsprotokoll, med kemikalier kompletteras vid varje steg av differentiering. Signalvägar som aktiveras eller hämmas under differentieringen är markerade i grönt eller rött, respektive. CHIR: GSK3-hämmare; GDF8: tillväxtdifferentieringsfaktor 8 eller myostatin, en TGF-beta-proteinfamiljemedlem; TT: Hedgehog; DE: Slutgiltig endoderm; PP1:PDX1 + tidig pancreatic progenitor; PP2: PDX1 + NKX6.1 + senare pancreatic progenitor. (B) Typisk sammanflytande (70-80%) av hPSCs 48 timmar efter sådd när redo för differentiering initiering. (C) Representativa immunofluorescerande färgning bilder som visar den framgångsrika differentiering i det slutgiltiga endoderm (DE) steget (FOXA2 och SOX17 co-färgning), pankreas progenitor steg (PP2: PDX1 och NKX6.1 co-färgning), och glukos-responsiv β- som cellstadiet (NKX6.1 och C-peptid co-färgning). I allmänhet, för att uppnå mer än 10% NKX6.1 + CPEP + celler vid β-liknande cellstadiet, åtminstone 75% FOXA2 + SOX17 + de celler och 40% PDX1 + NKX6.1 + PP2 celler krävs vid motsvarande stadier. (D) Typisk morfologi av en cellaggregat vid S5 scenen på en insatsfiltermembranet i gränssnittet kultur luft och vätska. De överlevande cellerna har migrerat till centrum av aggregatet (i mörker) och lämnade en aura-liknande struktur på kanten. (A (D) anpassades från referens 9 med behörighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

plasmid mängd
AAVS1-talen-L 5 ^ g
AAVS1-talen-R 5 ^ g
AAVS1-Puro-iCas9 40 mikrogram
AAVS1-Neo-M2rtTA 40 mikrogram

bord 1

Primer Sekvens
T7F TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR AAAAGCACCGACTCGGTGCC

tabell 2

tabell 3

Komponent mängd
DDH 2 O 35,5 | il
5x PCR-reaktionsbuffert 10 mikroliter
dNTP-blandning (25 mM) 0,5 | il
T7F (10 ^ M) 1,25 mikroliter
TracrR (10 ^ M) 1,25 mikroliter
T7-gRNA IVT mallen (250 nM) 1 mikroliter
DNA-polymeras 0,5 | il
Totala PCR-reaktionsblandning 50 mikroliter
PCR-cykelbetingelser
cykelantal Denaturera Glödga Förlänga
1 94 ° C, 2 min
2-31 94 ºC, 20 s 60 ºC, 20 s 72 ° C, 1 min
32 72 ° C, 2 min

tabell 4

Komponent
T7 ATP 2 | il
T7 CTP 2 | il
T7 GTP 2 | il
T7 UTP 2 | il
T7 10x buffert 2 | il
T7 enzymblandning 2 | il
PCR-amplifierade templat 8 | il
Totalt in vitro gRNA transkription mix 20 mikroliter
Inkubera vid 37 ° C under 6 timmar till över natten

tabell 5

Komponent Mängd (| il)
Orenad PCR-produkt 8 Buffert 2 10x 2
Destillerat vatten (dH 2 O) 10

tabell 6

DNA denaturering och hybridiseringsbetingelser cykelbetingelser
Temperatur Varaktighet termocykler förhållanden
95 ° C 10 min
85 ° C 1 min Ramp till 85 ° C vid 2 ° C / s
75 ° C 1 min Ramp till 75 ° C vid 0,3 ° C / s
65 ° C 1 min Ramp till 65 ° C vid 0,3 ° C / s
55 ° C </ Td> 1 min Ramp till 55 ° C vid 0,3 ° C / s
45 ° C 1 min Ramp till 45 ° C vid 0,3 ° C / s
35 ° C 1 min Ramp till 35 ° C vid 0,3 ° C / s
25 ° C 1 min Ramp till 25 ° C vid 0,3 ° C / s
4 ° C Håll

tabell 7

Skede Dag Media Tillägg
S1 d0 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99021
3 ^ M
d1 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99021
0,3 | iM
d2 S1 GDF8
100 ng / ml
S1 media: MCDB 131 + 1x L-glutamin tillägg + 0,5% BSA + 1,5 g / L NaHCOa 3 + 10 mM glukos

tabell 8

S3
Skede Dag Media Tillägg
S2 d3-d4 S1 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		IWP-2
2,5 | iM
d5-d6 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		SANT-1
0,25 ^ M 		RA
1 ^ M 		LDN
100 nM 		TPB
200 nM 		ITS-X
1: 200
S4 d7-d9 S3 LAA
0,25 mM 		FGF7
2 ng / ml 		SANT-1
0,25 ^ M 		RA
0,1 ^ M 		LDN
200 nM 		TPB
100 nM 		ITS-X
1: 200 		IWP-2
2,5 | iM
S3 media: MCDB 131 + 1x L-glutamin tillägg + 2% BSA + 2,5 g / L NaHCOa 3 + 10 mM glukos

tabell 9

Skede Dag Media Tillägg
S5 d10-d12 S5 T3 1 ^ M ALK5i II 10 ^ M SANT-1 0,25 | iM RA 0.05 uM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 pM Heparin 10 | ig / ml
S6 D13-sty d19 S5 T3 1 ^ M ALK5i II 10 ^ M GSiXX 100 nM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 pM Heparin 10 | ig / ml
S7 d20- D33 S5 T3 1 ^ M ALK5i II 10 ^ M N-Cys 1 mM Trolox 10 ^ M R428 2 iM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 pM Heparin 10 | ig / ml
S5 media: Blar + 1x L-glutamin tillägg + 2% BSA + 1,5 g / L NaHCOa 3 + 20 mM glukos

tabell 10

Discussion

Tids Överväganden för att generera Mutant Lines

Även de senaste metoder baserade på crispr / Cas system för genom redigering har lett till en framgångsrik inriktning skulle en mer effektiv och universell plattform vara att föredra för större skala analyser av geners funktion. Den iCRISPR plattformen erbjuder en snabb och effektiv metod för att introducera mutationer i någon gen av intresse 5, 9. För det första medger det PCR-baserade gRNA syntesmetod produktionen av hundratals gRNAs i klädd format i en dag utan de tidskrävande kloningssteg. För det andra, med doxycyklin-inducerbara Cas9 uttryck i iCas9 hPSCs steget involverar gRNA transfektion kräver endast en minimal mängd arbete, och därmed kan flera gRNA inriktnings experiment genomföras samtidigt. Tredje, på grund av den höga inriktning effektiviteter kan uppnås med vårt system, analysen av ~ 24 - 48 kolonier per gRNA transfekterade bör vara sufficient att etablera flera monoallel och bialleliska muterade linjer för en enda gen, även om effektivitet varierar beroende på målstället. Eftersom det är möjligt för en utbildad person att mekaniskt plocka 384 kolonier (4 x 96 brunnar) i ett sammanträde, som ska ta ~ 4 timmar under ett dissektionsmikroskop, kan man räkna med en utbildad person att generera muterade linjer som påverkar 12 gener inom 12 månader. Den strömlinjeformade generation hPSC mutanter på kort tid gör det möjligt att systematisk analys av en uppsättning av transkriptionsfaktorer och / eller signaleringsvägen komponenter som samverkar med varandra, genom utvecklingsprocessen 9. Dessutom, effektiv multiplex genmålinriktning öppnar också dörren för att undersöka genetiska interaktioner underliggande komplexa mänskliga drag.

Generation av Precise genetiska modifieringar

Härledningen av patientspecifika iPSCs från lättillgänglig somatisk celltyp s och differentieringen till sjukdomsrelevanta celltyper ger en stor möjlighet för den funktionella validering av sjukdomsassocierade mutationer. Men på grund av den stora variationen i genetisk bakgrund mellan individer, direkta jämförelser mellan iPSCs från patienter och från friska donatorer kan inte tillåta en att skilja sjukdoms fenotyper från bakgrundseffekter. Därför är det nödvändigt att generera isogena kontroll iPSCs genom att korrigera sjukdomen mutationen tillbaka till vildtypssekvensen eller att införa patientspecifika mutationer i en vild-typ hPSC bakgrund, som föreslagits av andra 25, 26. Förutom förlust-of-funktion (null) mutationer, kan man nu mer exakt dissekera sjukdomsmekanismer genom införandet av ett patientspecifika sekvensförändringar i det endogena lokus i hPSCs, inklusive hypermorphic, hypomorphic, neomorphic eller dominant-negativa patienter mutationer.

ntent "> Precise genetisk modifiering sysselsätter HDR för DSB-reparation i närvaro av en mall reparation. Eftersom det är mycket mindre effektiv än NHEJ-medierad DNA-reparation, en donatorplasmid som innehåller den patientspecifika mutationen, en läkemedelsselektionskassett, och homologiarmarna har tidigare använts som reparations mall 2. Efter val av läkemedel och kontroll av patientspecifika mutationen är ett andra steg i allmänhet krävs för att ta bort markeringen läkemedelskassetten. Även de mest använda Cre-loxP och FLP-FRT-system lämnar bakom restsekvensen i den endogena lokuset, har användningen av piggyBac transposon tillåts för sömlös avlägsnande av läkemedelsselektionskassetten 27. Mer nyligen korta ssDNA mallar har också visats att stödja effektiv HDR med konstruerade DNA-endonukleaser 28. Jämfört med en donatorplasmid , ssDNA kan direkt syntetiseras och kringgår därmed tidskrävande kloningssteg. Här har det varasv visat att genom att samtransfektera gRNA och en ssDNA-mall för att inducera homologi riktad reparation kan iCRISPR användas för att introducera specifika nukleotid ändringar med hög verkningsgrad. Detta är avgörande för att inte bara dissekera roll essentiella nukleotider inom protein funktionella domäner, utan också för att modellera mutationer humana sjukdoms och potentiellt korrigera dessa sjukdomsassocierade mutationer för terapeutisk intervention. På grund av det stora antalet susceptibility loci som var och en är associerad med multipla sekvensvarianter, modellering komplexa och multigena sjukdomar såsom diabetes har varit en utmaning för genetiker. Eftersom iCRISPR plattformen är tillåtande för snabb generering av en allel serie eller multiplexable gen inriktning kan det underlätta utredningen av flera sjukdomsassocierad loci, antingen enskilt eller i kombination med isogena bakgrunder.

Inriktning effektiviteten och Off-mål Effekter

Vi har funnit en god korrelation mellan den T7E1 och RFLP-analysresultat och antalet mutanta linjer som identifieras genom sekvensering. Detta understryker vikten av att utföra dessa analyser parallellt med etableringen av klonala linjer. Medan de inriktnings effektiviteter uppnås kan variera beroende på den genomiska loci i de flesta enkel-gene-targeting experiment, 20 - var 60% av klonema hittades med båda allelerna muterade (inklusive in-ram och ramskiftningsmutationer) 9. I de fall där multiplex gen inriktning utfördes, var trippel bialleliska muterade kloner med 5-10% effektivitet erhållits 5. ssDNA-medierad HDR av flera gener utfördes också för att få exakta genetiska förändringar, med effektivitet för att erhålla homozygota knock-in kloner som sträcker sig från 1 till 10% 5. Arbeta med crispr / Cas i hPSCs eventuella mutationer i potentiella utanför mål webbplatser som inte delar samma gRNA målsekvensen ännu inte upptäcktlass = "xref"> 5, 9, 12. Helgenom-sekvensering utförs i en färsk studie har också misslyckats med att identifiera betydande utanför mål mutationer i klon hPSC linjer genereras med hjälp crispr / Cas 29. Ändå, för att minimera eventuella effekten av confounding fenotyper infördes genom mutationer vid off-mål effekt platser, föreslås det att generera oberoende muterade linjer med åtminstone två oberoende gRNAs inriktade på olika sekvenser inom samma gen. Liknande fenotyper som observerats i flera rader som genereras med hjälp av olika gRNAs kunde huvudsakligen utesluta möjligheten att fenotypen kommer från en off-target effekt.

Feeder-beroende kontra oberoende kultur och inriktning

Traditionella metoder för hPSC kultur involverar deras underhåll och expansion på matarceller i media som innehåller serum eller ersättnings serum som innehåller djur proddukter, såsom bovint serumalbumin. Matarceller, serum, serumersättnings och albumin alla innehåller komplexa odefinierade komponenter och visar betydande parti variabilitet. Anpassning till mataren fria och kemiskt definierade tillstånd minskar avsevärt ansträngningar för hPSC underhåll och, ännu viktigare, ökar konsekvens av differentieringsexperiment. För närvarande finns det mycket få studier som beskriver genomredigerings förfaranden för hPSCs odlade i fullständigt definierade odlingsbetingelser 30. Vi har funnit högre crispr inriktning effektiviteten när gRNA transfektion och klon avsättning utfördes i matarfria förhållanden jämfört med matarberoende odlingsbetingelser. Vi tror att detta beror på ökad cellöverlevnad efter transfektion och encelliga sådd för kolonibildning. Dessutom har matarceller som tidigare visats binda transfektionsreagens och därigenom sänka transfektionseffektivitet.

KombinerandeGenome redigering med riktad differentiering

Har gett tidigare differentiering protokoll endast en liten del av insulinpositiva celler, varav de flesta var polyhormonal och liknade foster endokrina celler 23. Den senaste tidens framsteg har gjort det möjligt differentieringen av hPSCs i mer mogna glukoskänslig beta-liknande celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinmässigt erhålla åtminstone 75% definitiva endoderm celler, 40% PDX1 + NKX6.1 + bukspottkörteln stamceller, och cirka 20% NKX6.1 + CPEP + glukoskänslig beta-liknande celler med hjälp av HUES8 hPSCs 9. I kombination med iCRISPR genomet redigering system, har detta mer robust differentiering protokoll underlättade analysen av transkriptionsfaktorer som är avgörande för bukspottkörteln progenitorceller och endokrina stadier av pankreas differentiering. Detta kommer att göradet möjligt att i framtida studier för att undersöka ett stort antal kandidat sjukdomsgener för funktionell validering och utredning av mekanismer som ligger bakom diabetes 9.

Framtida Program eller Vägbeskrivning

Vårt iCRISPR systemet kan underlätta skapandet av mer komplexa genomiska modifieringar, såsom skapandet av reporter alleler genom HDR-medierad gen inriktning med lång givar DNA-mallar som kodar för protein taggar eller fluorescerande reportrar 12. Vi har visat att, beroende på den höga crispr inriktnings effektiviteter uppnås i systemet, kan denna process utföras i hPSCs, utan behov av urvalet 12 ytterligare läkemedel. Dessutom kan multiplex genmålinriktning användas för att undersöka genetiska interaktioner underliggande komplexa mänskliga sjukdomar, som visas i vår senaste studie, som vi tror är det första exemplet på sådant arbete 31. ICRISPR kan också användas för att förstå gen tillsyn genom att skapa deletioner antingen icke-kodande RNA eller i genen regulatoriska regioner, såsom promotorer och förstärkare. Att effektivt generera regulatoriska mutanter med användning iCRISPR kan gRNAs vara utformade för att störa bindningsstället av ett DNA-bindande protein, innefattande men inte begränsad till den basala transkriptionsmaskineriet eller en vävnadsspecifik transkriptionsfaktor. ssDNA-mall-förmedlad HDR kan också användas för att mutera specifika proteinbindande ställen. Slutligen föreställa vi att ytterligare optimering skulle möjliggöra användningen av iCRISPR plattform i hPSCs för högre genomströmning genetiska analyser av pluripotens fenotyper eller sjukdoms fenotyper när de kombineras med en in vitro-differentieringsprotokoll. Dessa iCRISPR-medierad studier kan göra det möjligt att snabbare identifiera kandidatsjukdomsassocierade gener och studier av deras funktionella betydelse.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats delvis av NIH / NIDDK (R01DK096239) och New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ stöddes av NYSTEM postdoktorsstipendium från Centrum för Stem Cell Biology av Sloan Kettering Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemically defined medium (E8) Thermo Fisher Scientific A1517001 Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included
Truncated recombinant human form of vitronectin Thermo Fisher Scientific A14700
ROCK inhibitor Y-27632 Selleck Chemicals S1049
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563029 1x, animal origin free, recombinant enzyme
G418 Sulfate Thermo Fisher Scientific 10131035 Geneticin Selective Antibiotic
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P8833 Puromycin Selective Antibiotic
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) Agilent Technologies 600679 PCR kit
MEGAshortscript T7 Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1354
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
Opti-MEM medium Thermo Fisher Scientific 31985062 Reduced Serum Medium
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778150
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN 69504 Genomic DNA extraction kit
Proteinase K Roche 3115879001
MCDB 131 medium Thermo Fisher Scientific 10372-019
BLAR medium Thermo Fisher Scientific Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)
L-glutamine supplement (GlutaMAX) Thermo Fisher Scientific 35050061
NaHCO3 Thermo Fisher Scientific 144-55-8
Glucose Sigma-Aldrich G8769
BSA LAMPIRE Biological Laboratories 7500855 Fatty acid free
GDF8 PeproTech 120-00
CHIR-99021 Stemgent 04-0004 GSK-3 inhibitor
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Vitamin C
FGF7 R&D Systems 251-KG
SANT1 Tocris Bioscience 1974 Hedgehog inhibitor
RA Sigma-Aldrich R2625 Retinoic acid
LDN Stemgent 04-0019 BMP inhibitor
IWP-2 Tocris Bioscience 3533 Wnt antagonist 
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056
TPB EMD Millipore 565740-1MG PKC activator
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
ALK5i II Enzo Life Sciences ALX-270-445 ALK5 inhibitor II
ZnSO4 Sigma-Aldrich Z0251
Heparin Sigma-Aldrich H3149
GSiXX EMD Millipore 565789 Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma-Aldrich A9165
Trolox EMD Millipore 648471 Vitamin E analogue
R428 Selleck Chemicals S2841 AXL receptor tyrosine kinase inhibitor
24 mm Transwell with insert Corning Life Sciences 3414
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660
0.4 cm Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652081
AAVS1-TALEN-L Addgene 59025
AAVS1-TALEN-R Addgene 59026
AAVS1-Neo-M2rtTA Addgene 60843
AAVS1-Puro-iCas9 Addgene 58409
T7 Endonuclease I NEB M0302L
Buffer 2 NEB B7002S NEBuffer 2
Long oligonucleotide Eton Bioscience or IDT
SOX17 antibody R&D Systems AF1924 1:500
FOXA2 antibody Millipore 07-633 1:100
CXCR4-APC antibody R&D Systems FAB170A 1:25
PDX1 antibody R&D Systems AF2419 1:500
NKX6.1 antibody DSHB F55A12 1:500
NKX2.2 antibody DSHB 74.5A5 1:100
NEUROD1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-1084 1:100
Insulin antibody Dako A0564 1:2,000
C-peptide antibody DSHB GN-ID4-c 1:2,000
Glucagon antibody Sigma-Aldrich G2654 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  2. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  3. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).
  4. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  5. González, F., et al. An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  8. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).
  9. Zhu, Z., et al. Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes. Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).
  10. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  11. Carlson-Stevermer, J., et al. High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).
  12. Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).
  13. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Rezania, A., et al. Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).
  16. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  17. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  18. Chen, S., et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage. Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).
  19. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  20. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  21. Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).
  22. Soh, C. L., Huangfu, D. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium. Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).
  23. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  24. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).
  25. Musunuru, K. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).
  26. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  27. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  28. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  29. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  30. Huang, X., et al. Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  31. Shi, Z. D., et al. Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development. Cell Stem Cell. , in press (2017).

Tags

Genetik crispr / Cas9 iCas9 genom redigering AAVS1 mänskliga pluripotenta stamceller bukspottkörtel differentiering glukoskänslig p-liknande celler diabetes
Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z.,… More

Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z., Huangfu, D. Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development. J. Vis. Exp. (121), e55267, doi:10.3791/55267 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter