Encapsulation de cellules de mammifères dans des perles d'alginate à l'aide d'un récipient agité simple

Summary

Cette vidéo et ce manuscrit décrivent un procédé à base d'émulsion pour encapsuler des cellules de mammifères dans des billes d'alginate à 0,5% à 10% qui peuvent être produites en gros lots en utilisant un simple vaisseau agité. Les cellules encapsulées peuvent être cultivées in vitro ou transplantées pour des applications de thérapie cellulaire.

Abstract

L'encapsulation cellulaire dans des billes d'alginate a été utilisée pour la culture cellulaire immobilisée in vitro ainsi que pour l'immuno-isolement in vivo . L'encapsulation des îlots pancréatiques a été largement étudiée comme moyen d'augmenter la survie des îlots dans des greffes allogéniques ou xénogénétiques. L'encapsulation d'alginate est généralement obtenue par extrusion de buse et par gélification externe. En utilisant cette méthode, les gouttelettes d'alginate contenant des cellules formées à la pointe des buses tombent dans une solution contenant des cations divalents qui provoquent une gélification d'alginate ionotropique lorsqu'ils diffusent dans les gouttelettes. L'exigence de formation de gouttelettes à la pointe de la buse limite le débit volumétrique et la concentration d'alginate qui peuvent être atteints. Cette vidéo décrit une méthode d'émulsification évolutive pour encapsuler des cellules de mammifères dans un alginate de 0,5% à 10% avec une survie cellulaire de 70% à 90%. Selon ce procédé alternatif, des gouttelettes d'alginate contenant des cellules et du carbonate de calcium sont émulsionnées dans de l'huile minérale,Par une diminution du pH conduisant à une libération de calcium interne et à une gélification d'alginate ionotropique. La méthode actuelle permet la production de perles d'alginate dans les 20 minutes d'émulsification. L'équipement requis pour l'étape d'encapsulation consiste en des récipients agités simples disponibles pour la plupart des laboratoires.

Introduction

L'encapsulation des cellules de mammifères a été largement étudiée comme un moyen de protéger les cellules transplantées du rejet immunitaire ¹ ou de fournir un support tridimensionnel pour la culture cellulaire immobilisée ^{2 , 3 , 4} . L'encapsulation d'îlots pancréatiques dans des billes d'alginate a été utilisée pour inverser le diabète chez les rorogènes allogéniques ^{5 , 6} ou xénogéniques ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . Les essais précliniques et cliniques de la transplantation d'îlots pancréatiques encapsulés pour traiter le diabète de type 1 sont en cours ^{13 , 14 , 15} . Pour les applications de transplantation ou à plus grande échelleLa production cellulaire immobilisée in vitro , les générateurs de perles à buse sont généralement utilisés. Typiquement, un mélange d'alginate et de cellules est pompé à travers une buse pour former des gouttelettes qui tombent dans une solution agitée contenant des cations divalents, entraînant la gélification externe des gouttelettes. Le flux de gaz coaxial ^{16 , 17} , la vibration des buses ¹⁸ , la répulsion électrostatique ¹⁹ ou les fils rotatifs ²⁰ facilitent la formation de gouttelettes au niveau de la pointe de la buse.

Les principaux inconvénients des générateurs de perles classiques sont leur débit limité et la gamme limitée de viscosités de la solution qui entraîneront une formation adéquate des talons ²¹ . À des débits élevés, le fluide sortant de la buse se décompose en gouttelettes plus petit que le diamètre de la buse, ce qui réduit le contrôle de la taille. Les générateurs de perles multi-buses peuvent être utilisés pour augmenter le débit, maisLa distribution uniforme du flux entre les buses et l'utilisation des solutions> 0,2 Pas est problématique ²² . Enfin, tous les dispositifs à base de buses devraient donner des dégâts aux îlots, puisque le diamètre des buses utilisées est compris entre 100 μm et 500 μm, alors que ~ 15% des îlots humains peuvent être supérieurs à 200 μm ²³ .

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode alternative pour encapsuler les cellules de mammifères en formant des gouttelettes dans une seule étape d'émulsification au lieu de la goutte à goutte. Étant donné que la production de la perle est réalisée dans un récipient à agitation simple, la méthode est adaptée à une production de perles petite (~ 1 mL) à grande échelle (10 ³ L) avec de faibles coûts d'équipement ²⁴ . Cette méthode permet la production de perles à haute sphéricité en utilisant une large gamme de viscosités d'alginate avec des temps de génération courts courts ( par exemple, 20 minutes). Cette méthode a été développée à l'origine par Poncelet et aL. ^{25 , 26} et utilisé pour immobiliser l'ADN ²⁷ , les protéines ^28, y compris l'insuline ²⁹ et les bactéries ³⁰ . Nous avons récemment adapté ces méthodes à l'encapsulation de cellules de mammifères utilisant des lignées de cellules pancréatiques bêta ^{31 , 32} et des tissus pancréatiques primaires ³² .

Le principe de la méthode consiste à générer une émulsion eau-dans-huile constituée de gouttelettes d'alginate dans de l'huile minérale, suivie d'une gélification interne des gouttelettes d'alginate ( figure 1 ). D'abord, l'encapsulant ( par exemple, les cellules) est dispersé dans une solution d'alginate contenant un sel de calcium à grain fin avec une faible solubilité au pH initial du procédé. Le mélange d'alginate est ensuite ajouté à une phase organique agitée pour créer une émulsion, habituellement en présence d'unTensioactif. Dans le cas de l'encapsulation de cellules de mammifères, les composants présents dans le sérum peuvent agir comme tensioactifs. Ensuite, le pH est réduit afin de solubiliser le sel de calcium en ajoutant un acide soluble dans l'huile qui se divise en phase aqueuse. L'acide acétique, avec un coefficient de partage d'huile minérale <0,005 ³³ , doit être pré-dissous dans de l'huile, puis ajouté à l'émulsion où il est mélangé dans la phase huileuse et partitions rapides dans la phase aqueuse ³⁴ . La figure 2 illustre les réactions chimiques et la diffusion qui ont lieu lors de l'étape d'acidification et de gélification interne. Enfin, les cellules encapsulées sont récupérées par inversion de phase, séparation de phase accélérée par centrifugation, étapes de lavage répétées et filtration. Ces étapes peuvent ensuite être suivies d'un échantillonnage de talons et de cellules pour des analyses de contrôle de qualité, une culture cellulaire in vitro et / ou une transplantation de cellules encapsulées.

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Figure 1: Schéma du procédé à base d'émulsification pour encapsuler des cellules de mammifères. Les perles sont d'abord produites par émulsification d'un mélange d'alginate, de cellule et de CaCO ₃ dans de l'huile minérale (étapes 1 et 2 dans le schéma), déclenchant une gélification interne par addition d'acide acétique (étape 3). Les perles gélifiées sont ensuite séparées de l'huile en ajoutant un tampon aqueux pour déclencher l'inversion de phase (étape 4), puis par centrifugation et aspiration d'huile (étape 5), puis filtration (étape 6). Enfin, les perles collectées sur le filtre sont transférées dans un milieu de culture cellulaire pour une culture in vitro ou pour une transplantation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2: Réactions et étapes de diffusion se produisant lors de la gélification interne. (1) L'acide acétique est ajouté à la phase organique et est transporté vers les gouttelettes d'alginate par convection. (2) L'acide acétique se divise en phase aqueuse. (3) En présence d'eau, l'acide se dissocie et se diffuse pour atteindre les grains de CaCO ₃ représentés en bleu foncé. (4) Les ions H ⁺ sont échangés avec les ions Ca ^{2 +} dans CaCO ₃ , libérant des ions Ca ²⁺ . (5) Les ions calcium diffusent jusqu'à ce qu'ils rencontrent l'alginate n'ayant pas réagi, conduisant à la réticulation ionotropique des chaînes d'alginate. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Contrairement aux encapsulateurs de cellules à base de buses classiques, une grande distribution de taille de perles est expeCité à partir de ce processus en raison du mécanisme de formation de gouttelettes dans une émulsification agitée. Pour un sous-ensemble d'applications, cette distribution de taille de talon peut être problématique. Par exemple, une plus grande fraction de cellules peut être exposée à la surface du talon dans des billes plus petites. Si les limitations d'éléments nutritifs ( par exemple, l' oxygène) sont préoccupantes, ces limitations peuvent être exacerbées dans des perles plus grandes. Un avantage du procédé d'émulsification agité est que la taille moyenne des bourrelets peut facilement être ajustée en modifiant le taux d'agitation pendant l'étape d'émulsification. La large distribution de la taille des perles peut également être exploitée pour étudier l'effet de la taille des talons sur les performances des cellules encapsulées.

L'encapsulation de cellules de mammifères par émulsification et gélification interne est une alternative intéressante pour les laboratoires qui ne sont pas équipés d'un générateur de talons. En outre, cette méthode donne aux utilisateurs la possibilité de réduire le temps de traitement, ou de générer des billes à très faible ou très haut concentré d'alginateTions.

Le protocole décrit ci-dessous décrit comment encapsuler des cellules dans 10,5 ml d'une solution d'alginate à 5% préparée dans un tampon 10 mM d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES). L'alginate se compose d'un mélange 50:50 de LVM de qualité transplantation (teneur en acide mannuronique à faible viscosité élevée) et d'alginate de MVG (teneur moyenne en acide à teneur élevée en acide guluronique). Le carbonate de calcium à une concentration finale de 24 mM est utilisé comme agent de réticulation physique. L'huile minérale légère constitue la phase organique, tandis que l'acide acétique est utilisé pour acidifier l'émulsion et déclencher une gélification interne. Cependant, le type et la composition d'alginate, ainsi que le tampon de processus sélectionné dépendent de l'application souhaitée ³² . Une variété de types d'alginate (voir le tableau des matériaux) a été utilisé pour produire des billes avec ce protocole.

Protocol

1. Préparez la solution d'alginate, la suspension de CaCO 3 et l'huile acidifiée Préparez le tampon de traitement et le support. Préparer le tampon de traitement typique utilisé pour générer des billes d'alginate à haute concentration en utilisant de l'HEPES 10 mM, du NaCl 170 mM. Ajustez le pH à 7,4. Préparer le milieu de culture typique en utilisant le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal…

Representative Results

À la fin de l'émulsion et du processus de gélification interne, un volume de talon similaire au volume initial du mélange d'alginate et de cellule devrait être récupéré. Les perles devraient être très sphériques avec quelques défauts ( figure 3 ). Les perles doivent être suffisamment fortes pour résister à la pipetage à travers des pipettes à gros alvéoles. À des concentrations élevées d'alginate, des gouttelettes encap…

Discussion

Diverses étapes (représentées sur la figure 2 ) pendant la réaction de gélification interne peuvent limiter la cinétique globale. Pour les grains de carbonate de calcium supérieurs à ~ 2,5 μm, le taux de dissolution du carbonate s'est révélé être un taux de limitation de la fréquence ^{26 , 44} . L'étape d'acidification qui conduit à la libération interne de calcium a également été démontrée comme étant la variabl…

Materials

Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).