Summary
Cette vidéo et ce manuscrit décrivent un procédé à base d'émulsion pour encapsuler des cellules de mammifères dans des billes d'alginate à 0,5% à 10% qui peuvent être produites en gros lots en utilisant un simple vaisseau agité. Les cellules encapsulées peuvent être cultivées in vitro ou transplantées pour des applications de thérapie cellulaire.
Abstract
L'encapsulation cellulaire dans des billes d'alginate a été utilisée pour la culture cellulaire immobilisée in vitro ainsi que pour l'immuno-isolement in vivo . L'encapsulation des îlots pancréatiques a été largement étudiée comme moyen d'augmenter la survie des îlots dans des greffes allogéniques ou xénogénétiques. L'encapsulation d'alginate est généralement obtenue par extrusion de buse et par gélification externe. En utilisant cette méthode, les gouttelettes d'alginate contenant des cellules formées à la pointe des buses tombent dans une solution contenant des cations divalents qui provoquent une gélification d'alginate ionotropique lorsqu'ils diffusent dans les gouttelettes. L'exigence de formation de gouttelettes à la pointe de la buse limite le débit volumétrique et la concentration d'alginate qui peuvent être atteints. Cette vidéo décrit une méthode d'émulsification évolutive pour encapsuler des cellules de mammifères dans un alginate de 0,5% à 10% avec une survie cellulaire de 70% à 90%. Selon ce procédé alternatif, des gouttelettes d'alginate contenant des cellules et du carbonate de calcium sont émulsionnées dans de l'huile minérale,Par une diminution du pH conduisant à une libération de calcium interne et à une gélification d'alginate ionotropique. La méthode actuelle permet la production de perles d'alginate dans les 20 minutes d'émulsification. L'équipement requis pour l'étape d'encapsulation consiste en des récipients agités simples disponibles pour la plupart des laboratoires.
Introduction
L'encapsulation des cellules de mammifères a été largement étudiée comme un moyen de protéger les cellules transplantées du rejet immunitaire 1 ou de fournir un support tridimensionnel pour la culture cellulaire immobilisée 2 , 3 , 4 . L'encapsulation d'îlots pancréatiques dans des billes d'alginate a été utilisée pour inverser le diabète chez les rorogènes allogéniques 5 , 6 ou xénogéniques 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Les essais précliniques et cliniques de la transplantation d'îlots pancréatiques encapsulés pour traiter le diabète de type 1 sont en cours 13 , 14 , 15 . Pour les applications de transplantation ou à plus grande échelleLa production cellulaire immobilisée in vitro , les générateurs de perles à buse sont généralement utilisés. Typiquement, un mélange d'alginate et de cellules est pompé à travers une buse pour former des gouttelettes qui tombent dans une solution agitée contenant des cations divalents, entraînant la gélification externe des gouttelettes. Le flux de gaz coaxial 16 , 17 , la vibration des buses 18 , la répulsion électrostatique 19 ou les fils rotatifs 20 facilitent la formation de gouttelettes au niveau de la pointe de la buse.
Les principaux inconvénients des générateurs de perles classiques sont leur débit limité et la gamme limitée de viscosités de la solution qui entraîneront une formation adéquate des talons 21 . À des débits élevés, le fluide sortant de la buse se décompose en gouttelettes plus petit que le diamètre de la buse, ce qui réduit le contrôle de la taille. Les générateurs de perles multi-buses peuvent être utilisés pour augmenter le débit, maisLa distribution uniforme du flux entre les buses et l'utilisation des solutions> 0,2 Pas est problématique 22 . Enfin, tous les dispositifs à base de buses devraient donner des dégâts aux îlots, puisque le diamètre des buses utilisées est compris entre 100 μm et 500 μm, alors que ~ 15% des îlots humains peuvent être supérieurs à 200 μm 23 .
Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode alternative pour encapsuler les cellules de mammifères en formant des gouttelettes dans une seule étape d'émulsification au lieu de la goutte à goutte. Étant donné que la production de la perle est réalisée dans un récipient à agitation simple, la méthode est adaptée à une production de perles petite (~ 1 mL) à grande échelle (10 3 L) avec de faibles coûts d'équipement 24 . Cette méthode permet la production de perles à haute sphéricité en utilisant une large gamme de viscosités d'alginate avec des temps de génération courts courts ( par exemple, 20 minutes). Cette méthode a été développée à l'origine par Poncelet et aL. 25 , 26 et utilisé pour immobiliser l'ADN 27 , les protéines 28, y compris l'insuline 29 et les bactéries 30 . Nous avons récemment adapté ces méthodes à l'encapsulation de cellules de mammifères utilisant des lignées de cellules pancréatiques bêta 31 , 32 et des tissus pancréatiques primaires 32 .
Le principe de la méthode consiste à générer une émulsion eau-dans-huile constituée de gouttelettes d'alginate dans de l'huile minérale, suivie d'une gélification interne des gouttelettes d'alginate ( figure 1 ). D'abord, l'encapsulant ( par exemple, les cellules) est dispersé dans une solution d'alginate contenant un sel de calcium à grain fin avec une faible solubilité au pH initial du procédé. Le mélange d'alginate est ensuite ajouté à une phase organique agitée pour créer une émulsion, habituellement en présence d'unTensioactif. Dans le cas de l'encapsulation de cellules de mammifères, les composants présents dans le sérum peuvent agir comme tensioactifs. Ensuite, le pH est réduit afin de solubiliser le sel de calcium en ajoutant un acide soluble dans l'huile qui se divise en phase aqueuse. L'acide acétique, avec un coefficient de partage d'huile minérale <0,005 33 , doit être pré-dissous dans de l'huile, puis ajouté à l'émulsion où il est mélangé dans la phase huileuse et partitions rapides dans la phase aqueuse 34 . La figure 2 illustre les réactions chimiques et la diffusion qui ont lieu lors de l'étape d'acidification et de gélification interne. Enfin, les cellules encapsulées sont récupérées par inversion de phase, séparation de phase accélérée par centrifugation, étapes de lavage répétées et filtration. Ces étapes peuvent ensuite être suivies d'un échantillonnage de talons et de cellules pour des analyses de contrôle de qualité, une culture cellulaire in vitro et / ou une transplantation de cellules encapsulées.
Figure 1: Schéma du procédé à base d'émulsification pour encapsuler des cellules de mammifères. Les perles sont d'abord produites par émulsification d'un mélange d'alginate, de cellule et de CaCO 3 dans de l'huile minérale (étapes 1 et 2 dans le schéma), déclenchant une gélification interne par addition d'acide acétique (étape 3). Les perles gélifiées sont ensuite séparées de l'huile en ajoutant un tampon aqueux pour déclencher l'inversion de phase (étape 4), puis par centrifugation et aspiration d'huile (étape 5), puis filtration (étape 6). Enfin, les perles collectées sur le filtre sont transférées dans un milieu de culture cellulaire pour une culture in vitro ou pour une transplantation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Contrairement aux encapsulateurs de cellules à base de buses classiques, une grande distribution de taille de perles est expeCité à partir de ce processus en raison du mécanisme de formation de gouttelettes dans une émulsification agitée. Pour un sous-ensemble d'applications, cette distribution de taille de talon peut être problématique. Par exemple, une plus grande fraction de cellules peut être exposée à la surface du talon dans des billes plus petites. Si les limitations d'éléments nutritifs ( par exemple, l' oxygène) sont préoccupantes, ces limitations peuvent être exacerbées dans des perles plus grandes. Un avantage du procédé d'émulsification agité est que la taille moyenne des bourrelets peut facilement être ajustée en modifiant le taux d'agitation pendant l'étape d'émulsification. La large distribution de la taille des perles peut également être exploitée pour étudier l'effet de la taille des talons sur les performances des cellules encapsulées.
L'encapsulation de cellules de mammifères par émulsification et gélification interne est une alternative intéressante pour les laboratoires qui ne sont pas équipés d'un générateur de talons. En outre, cette méthode donne aux utilisateurs la possibilité de réduire le temps de traitement, ou de générer des billes à très faible ou très haut concentré d'alginateTions.
Le protocole décrit ci-dessous décrit comment encapsuler des cellules dans 10,5 ml d'une solution d'alginate à 5% préparée dans un tampon 10 mM d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES). L'alginate se compose d'un mélange 50:50 de LVM de qualité transplantation (teneur en acide mannuronique à faible viscosité élevée) et d'alginate de MVG (teneur moyenne en acide à teneur élevée en acide guluronique). Le carbonate de calcium à une concentration finale de 24 mM est utilisé comme agent de réticulation physique. L'huile minérale légère constitue la phase organique, tandis que l'acide acétique est utilisé pour acidifier l'émulsion et déclencher une gélification interne. Cependant, le type et la composition d'alginate, ainsi que le tampon de processus sélectionné dépendent de l'application souhaitée 32 . Une variété de types d'alginate (voir le tableau des matériaux) a été utilisé pour produire des billes avec ce protocole.
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Protocol
1. Préparez la solution d'alginate, la suspension de CaCO 3 et l'huile acidifiée
- Préparez le tampon de traitement et le support.
- Préparer le tampon de traitement typique utilisé pour générer des billes d'alginate à haute concentration en utilisant de l'HEPES 10 mM, du NaCl 170 mM. Ajustez le pH à 7,4.
- Préparer le milieu de culture typique en utilisant le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 6 mM de glutamine, 100 U / mL de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine.
- Préparer la solution mère d'alginate à 1,17 fois la concentration souhaitée finale dans les billes.
- Tout d'abord, peser la quantité appropriée de poudre d'alginate. Par exemple, pour obtenir une concentration finale d'alginate à 5% avec 50,000 d'alginate de LVM et MVG, peser au total 1,17 g d'alginate de sodium en combinant 0,583 g de poudre d'alginate LVM et 0,583 g de poudre d'alginate de MVG.
- Placer un tampon de traitement de 20 mL dans un autocUn pot de verre lavable sur une plaque d'agitation magnétique et agiter à ~ 200 tr / min. Ajouter progressivement la poudre d'alginate de sodium à la solution.
- Laisser la solution remuer pendant une nuit à basse vitesse. Si nécessaire, fixez le flacon sur la plaque d'agitation.
- Si la solution est complètement dissoute, fixez la bouteille sur un mélangeur rotatif et continuez à mélanger à 37 ° C pendant 24 h supplémentaires.
- Stériliser la solution d'alginate en autoclaveant la solution pendant 30 min dans un vaisseau qui est moins de la moitié plein. Laisser la température diminuer au-dessous de 60 ° C avant de récupérer la solution.
- Si nécessaire, enlever les particules en filtrant la solution d'alginate peu de temps après l'autoclavage avant d'atteindre la température ambiante, alors que la viscosité reste suffisamment faible.
- Préparer la suspension de carbonate de calcium à 21 fois la concentration finale souhaitée pour la gélification interne.
- Pesez la poudre de CaCO 3 . Par exemple, l'annonceD 1 g CaCO 3 à 20 ml de tampon de traitement pour obtenir CaCO3 24 mM comme concentration finale en agent gélifiant.
- Autoclavez la suspension de CaCO 3 pendant 30 min.
REMARQUE: La concentration de CaCO 3 changera avec le temps en raison de l'équilibre du bicarbonate-CO 2 . Évitez d'utiliser le même stock de suspension de CaCO 3 pour plus de 10 procédures d'encapsulation.
- Autoclavez le récipient agité utilisé pour le processus d'émulsification. Avant d'utiliser, enlever toute trace d'eau condensée restant dans la fiole.
- Immédiatement avant le processus d'émulsification, préparer l'huile acidifiée. Dissoudre 44 μl d'acide acétique par 11 ml d'huile minérale placée dans un tube conique de 50 ml.
NOTE: Une erreur commune est la dissolution incomplète de l'acide acétique. Évitez de pipeter de petites quantités d'acide acétique et assurez-vous que l'acide acétique est complètement dissous dans de l'huile par vortex répété.
ATTENTION: l'acide acétique est toxique et D acide volatil. Manipuler ce réactif sous une hotte et garder la solution d'acide acétique / huile dans un récipient fermé jusqu'à l'étape d'émulsification. Reportez-vous aux informations sur la FS de ce réactif pour plus d'informations. - Permettre à toutes les solutions d'atteindre la température ambiante avant de procéder à l'encapsulation cellulaire.
2. Génération de perles d'alginate par émulsification et glaçage interne
- Placez 10 ml d'huile minérale légère dans le flacon et commencez à agiter à une vitesse de rotation faible ( p . Ex., 250 tr / min pour le flacon centrifuge utilisé dans cette vidéo).
- Si les cellules utilisées pour le procédé proviennent de cultures adhérentes, appliquer la trypsine pour suspendre les cellules. Mettre fin à la réaction en ajoutant un inhibiteur de la trypsine ou du milieu contenant du FBS et collecter un échantillon pour l'énumération des cellules.
- Déterminer la concentration et la viabilité des cellules après la coloration au bleu de Trypan à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur automatisé de cellules, tel que décrit précédemmentAss = "xref"> 32.
- Centrifugez les cellules pendant 7 min à 300 xg et lavez-les une fois dans le milieu désiré pour l'immobilisation cellulaire. Assurez-vous que ce milieu contient des émulsifiants tels que le FBS ou l'albumine de sérum bovin (BSA). Par exemple, utiliser le DMEM contenant 10% de FBS.
- Ré-suspendre le culot cellulaire dans le même milieu pour obtenir 10,5 fois la concentration finale souhaitée dans les perles.
- Ajouter 1,1 ml du stock cellulaire concentré 10,5 fois à 9,9 ml de la solution d'alginate. Ensuite, ajouter 550 μL de suspension de CaCO 3 et mélanger en agitant avec une spatule stérile pour assurer une répartition uniforme du CaCO 3 .
- Transférer immédiatement 10,5 ml du mélange d'alginate, de cellule et de CaCO 3 dans l'huile d'agitation à l'aide d'une seringue.
REMARQUE: Pour des solutions très visqueuses, aspirer et éjecter le mélange très lentement pour éviter les bulles d'air. Dans certains cas, il est préférable d'arrêter l'agitation tout en ajoutant le mélange au flacon pour éviterEntraînement d'alginate sur l'arbre de la turbine. - Immédiatement après l'addition du mélange d'alginate, de cellule et de CaCO 3 à l'huile, augmentez le taux d'agitation.
REMARQUE: Pour l'alginate MVG à 5% utilisé ici, une vitesse de rotation de 1025 tours par minute a été appliquée pour générer des perles d'environ 900 μm de diamètre adaptées à la culture in vitro 35 . Des vitesses de rotation plus élevées et des concentrations inférieures d'alginate conduiront à des diamètres de talons moyens inférieurs, comme décrit dans les publications précédentes 25 , 32 . Des légers changements dans la géométrie de la turbine et du vaisseau, ainsi que des propriétés d'alginate peuvent affecter grandement le diamètre moyen des bourrelets. Pour chaque modification de la configuration du navire ou du lot d'alginate, une courbe standard reliant le diamètre moyen du talon de la surface spécifique à la vitesse de rotation devrait être générée 32 . - Démarrez la minuterie et émulsionnez l'alginate pendant 12 min.
- Ajouter 10 mL de tL'huile et la solution d'acide acétique pour acidifier l'émulsion, dissoudre le CaCO 3 et donc réticuler physiquement l'alginate en perles gélifiées. Laisser 8 minutes pour cette étape d'acidification.
3. Recouvrement de perles
- Réduisez le taux d'agitation à 400 tr / min. Ajouter 40 ml de tampon de traitement mélangé avec 10% de milieu pour augmenter le pH et provoquer une inversion de phase.
- Arrêtez l'agitation 1 minute plus tard et transférez le mélange à des tubes de centrifugation de 50 ml. Rincer le flacon centrifuge avec un milieu additionnel de 20 ml et ajouter le à l'échantillon. Aspirer autant de phase aqueuse que possible de la fiole avant d'aspirer la phase huileuse pour minimiser le contact avec la phase huileuse.
REMARQUE: utilisez une pipette à gros alésage ( p . Ex. 25 ml de pipette) à cette étape et à partir de ce point afin d'éviter d'endommager les perles. Pour des volumes plus petits, la suspension des talons peut également être manipulée avec des pointes de pipettes coupées. Pour obtenir de tels conseils, couper l'extrémité de la pointe de pipette avec des ciseaux whIle portant une protection oculaire. - Centrifuger les tubes pendant 3 min à 630 xg pour accélérer le décapage des cordons et la séparation des phases.
- Enlever l'huile et l'excès de solution aqueuse en aspirant avec une pipette Pasteur.
- Laver les perles au moins une fois avec du milieu. Filtrer la suspension de talon sur des tamis de cellules de nylon de 40 μm et aspirer l'excès de liquide associé aux billes en dessous de la crépine. Transférer les perles dans un volume de milieu connu en utilisant une spatule stérile.
REMARQUE: des filtres de taille de pores plus petits ou plus grands peuvent être utilisés à cette étape, en fonction du diamètre de perles minimum cible. Cependant, la filtration par gravité est recommandée plutôt qu'une filtration sous pression par des filtres de taille de pores sous-micron pour éviter d'endommager les perles. - Mesurez le volume du talon par déplacement de volume (volume après avoir ajouté les perles, moins le volume avant d'ajouter les perles) et complétez le support pour obtenir le cordon souhaité: rapport de volume total, qui est généralement de 1: 5 ou 1 mL de perles dans4 mL de milieu. À partir de ce moment, utilisez toujours des pipettes à gros orifices pour éviter d'endommager les perles.
- Transférer les cellules encapsulées dans des flacons en T pour des expériences de culture ou de transplantation in vitro .
4. Contrôle qualité et applications
REMARQUE: Afin d'assurer la qualité des cordes et des cordons encapsulés, la répartition de la taille du talon et la survie cellulaire après le processus doivent être quantifiées. Inverser le gel pour récupérer les cellules à partir des perles pour une analyse plus approfondie est généralement effectuée.
- Pour évaluer la répartition de la taille du talon, tachez les billes avec du bleu de toluidine.
- Placez 0,5 ml de perles dans 4 ml de tampon de traitement contenant 10% de milieu complet.
- Ajouter 500 μL d'une solution de bleu de toluidine 1 g / L préparée dans un tampon de traitement.
- Incuber pendant 60 minutes dans un tube conique sur un agitateur rotatif à 50 tr / min.
- Ajouter 5 ml de tampon de traitement contenant 10% de milieu complet et immedTransférer immédiatement les perles et la solution dans une boîte de Petri et acquérir des images sur un microscope à faible grossissement ou en utilisant un appareil photo numérique portatif. Si nécessaire, placez la boîte de Petri sur une boîte lumineuse avant d'acquérir des images avec une caméra portable pour améliorer le contraste et éviter les ombres.
- Effectuer une analyse d'image pour quantifier la distribution de la taille des talons comme décrit précédemment 32 , par exemple en utilisant un logiciel gratuit d'analyse d'image 36 .
- Pour évaluer qualitativement la survie cellulaire, tachez les cellules en utilisant l'homodimère d'éthidium pour identifier les cellules mortes et la calcéine AM pour identifier les cellules vivantes.
- Ajouter 1 volume de perles à 4 volumes de mémoire tampon de traitement contenant 10% de support complet.
- Ajouter la quantité appropriée de solutions stock de calcéine AM et de homodimère d'éthidium pour obtenir des concentrations de 4 μM et 2 μM, respectivement. Générer des contrôles de taches individuelles en ajoutant un seul des réactifs à certains échantillons de talons.
- Incuber les perles sur de la glace pendant 20 min.
- Placez la solution entre une glissière et une lamelle coulissante à l'aide d'une entretoise telle qu'un joint torique pour éviter de comprimer les perles.
- Procéder au microscope à fluorescence. Utilisez les contrôles de tache unique pour évaluer la purge de la fluorescence. Sélectionnez des filtres de fluorescence appropriés en fonction des longueurs d'onde d'excitation / émission associées à la calceine AM (494/517 nm) et à l'homodimère d'éthidium lié à l'ADN (528/617 nm).
- Pour récupérer les cellules des perles pour une analyse plus approfondie, dégager l'alginate en utilisant un citrate ou une autre solution chélatante.
- Préparer une solution dégraissante contenant du citrate 55 mM, de l'HEPES 10 mM et du NaCl 95 mM à pH 7,4.
- Mélangez cette solution avec 10% de milieu, puis ajoutez 1 mL de perles d'alginate à 9 mL du mélange.
- Dégel les perles sur glace avec une agitation de 75 tr / min pendant 20 min.
REMARQUE: Les cellules peuvent maintenant être utilisées pour l'analyse ou retirées du solde d'alginate dégrailléPar centrifugation. Par exemple, la viabilité cellulaire après dégivrage peut être quantifiée par coloration au bleu de trypan. Alternativement, les cellules peuvent être centrifugées et lavées, suivies d'un échantillonnage et d'une analyse d'ARNm, d'ADN et / ou de protéines.
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Representative Results
À la fin de l'émulsion et du processus de gélification interne, un volume de talon similaire au volume initial du mélange d'alginate et de cellule devrait être récupéré. Les perles devraient être très sphériques avec quelques défauts ( figure 3 ). Les perles doivent être suffisamment fortes pour résister à la pipetage à travers des pipettes à gros alvéoles. À des concentrations élevées d'alginate, des gouttelettes encapsulées d'huile ou d'air peuvent être observées dans les billes. Cela se produit probablement en raison du piégeage d'huile dans des gouttelettes d'alginate pendant l'étape d'émulsification (émulsion double huile / eau / huile). Dans nos mains, ces perles représentaient une petite fraction (<5%) du volume des bourrelets et la plupart de ces billes ont été enlevées lors de l'aspiration de l'huile lors de l'étape de récupération du cordon, en raison de leur faible densité.
Fig.> Figure 3 : Perles d'alginate 5% représentatives contenant des cellules βTC3 encapsulées obtenues par émulsification et processus de gélification interne. Image de contraste de phase de 5% de perles d'alginate contenant 5 x 10 6 cellules de βTC3 / ml. Cliquez ici pour voir une plus grande Version de ce chiffre.
La taille des perles obtenues ne sera pas uniforme - c'est une caractéristique intrinsèque des émulsions agitées ( Figure 4A ). Pendant l'émulsification en écoulement turbulent, les fluctuations de pression agissent pour perturber les gouttelettes 37 , 38 , contrecarrant la tension superficielle et les forces visqueuses dans la phase dispersée 39 . Les forces visqueuses ne sont pas négligeables si la viscosité de la phase dispersée est bien supérieure à celle de laE phase continue. En supposant que le taux maximal de dissipation d'énergie locale est proportionnel au taux moyen de dissipation d'énergie dans le vaisseau, le diamètre maximal de gouttelettes maxi (si >> par rapport à l'échelle de Kolmogorov) peut être calculé comme suit 39 , 40 , 41 , 42 
Où ρ c est la densité de la phase continue, ε est la vitesse moyenne de dissipation d'énergie dans le vaisseau, σ est la tension interfaciale entre les deux fluides, μ d est la viscosité de la phase dispersée et C est une constante de proportionnalité. Lorsque les forces de tension superficielle prédominent sur les forces visqueuses, le côté droit simplifie à C , alors que si les forces visqueuses prédominent, cela simplifie:
Dans les récipients agités, l'entrée d'énergie sous des échelles d'écoulement turbulentes est proportionnelle à l'entrée de puissance par unité de volume, c'est- à- dire à N i 3 D i 2 , où N i est le taux d'agitation et D i est le diamètre de la turbine. Par conséquent, combiné avec l'équation 1 et donné une constante D i , si les forces de tension superficielle prédominent le d max est prédite être proportionnelle à N i -1.2 ( Figure 4B ), alors qu'elle est proportionnelle à N i -0.75 si des forces visqueuses dans le Les perles prédominent en tant que principale force de rétention. Les figures 4B et 4C suggèrent que les effets interfaciaux déterminent le dTaille des roots pour les faibles concentrations d'alginate, tandis que les forces visqueuses deviennent plus dominantes à une concentration d'alginate plus élevée ( par exemple, 5% pour l'alginate n ° 3 décrit dans la table des matières). Comme il est impossible de déterminer expérimentalement d max , des valeurs de quantile élevées ( par exemple, le 95e quantile) du diamètre ou du diamètre moyen du moment de la surface ( d 32 ) ont été utilisées, car elles sont généralement proportionnelles au d max 43 .
Avant d'encapsuler les cellules, il est recommandé de générer une courbe de d 32 en fonction de N i ( Figure 4B ). Cette courbe aidera à sélectionner le N i adéquat pour obtenir une taille de perles moyenne souhaitée. Une nouvelle courbe standard sera probablement requise pour différents lots d'huile ou d'alginate, ou si la concentration d'alginateLa modification est modifiée. En fonction de la géométrie du navire et des concentrations d'alginate, une gamme relativement large de diamètres de talons moyens devrait être réalisable. Par exemple, des valeurs de d 32 entre 200 μm et> 1 mm peuvent être obtenues en utilisant 2% ( Figure 2C dans Hoesli et al., 32 ) à 5% d'alginate ( Figure 4 ) en utilisant le protocole décrit ci-dessus.
Figure 4 : Distribution des tailles des perles. ( A ) de la toluidine bleu-O coloré 5% de perles d'alginate. ( B ) d 32 en fonction du taux d'agitation ( N i ) pour 1,5% et 5% de perles d'alginate en utilisant un mélange de 50:50 d'alginates n ° 1 et n ° 2 (voir tableau de matériaux). Un seul point est indiqué pour l'algi de 5%Nate beads. ( C ) d 32 en fonction de N i pour 2% et 5% d'alginate n ° 3 (voir le tableau des matériaux). Les barres d'erreur représentent l'écart type des tailles de perles dans un échantillon (N> 150 perles). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La survie cellulaire à partir de l'émulsification et du processus de gélification interne dépend principalement de l'étendue et de la durée de la chute de pH observée par les cellules. En utilisant le procédé décrit dans cette vidéo, 76 ± 2% de la survie des cellules βTC3 ont été mesurées 31 . Lors de l'encapsulation de cellules dispersées à 10 5 cellules / ml d'alginate à 10 7 cellules / ml de densité d'ensemencement d'alginate, toutes les billes doivent contenir des cellules. Lors de l'encapsulation de grappes cellulaires telles que des cellules pancréatiques, on peut s'attendre à ce qu'un sous-ensemble de perles soit videY. La figure 5 montre les résultats typiques de coloration des cellules vivantes / cellules mortes obtenues à l'aide de ce procédé. Une survie plus élevée des cellules peut être obtenue en augmentant la capacité du tampon du processus et en diminuant la durée de l'étape d'acidification. Par exemple, on a obtenu une survie de 90 ± 2% de la cellule MIN6 en utilisant 60 mM de MOPS (acide 3- (N-morpholino) propanesulfonique) en tant que tampon de traitement et en diminuant le temps de traitement global à 4 min 32 . Cependant, les billes générées étaient significativement plus fortes avec le tampon de procédé 10 mM HEPES que avec le tampon de traitement MOPS 60 mM en raison des quantités accrues de Ca 2+ libérées à pH inférieur 31 . Le processus MOPS court et le processus HEPES plus long devraient générer des perles suffisamment stables pour une culture ou une transplantation in vitro de 2 semaines. Cependant, les perles peuvent gonfler ou se dégager entièrement dans des solutions à faible teneur en calcium ou avec des concentrations élevées de chélateur (par exemple, Solution saline tamponnée au phosphate exempte de calcium).
Pour les cellules MIN6 encapsulées cultivées in vitro , les agrégats de cellules visibles se forment après ~ 5 à 7 jours d'expansion cellulaire immobilisée in vitro et des sphéroïdes de 150 μm de diamètre peuvent être récoltés après 2 semaines. On s'attend à ce que le taux de croissance des cellules immobilisées par l'alginate soit plus faible que dans les cultures non immobilisées, en particulier pour les gels ayant une concentration en alginate plus élevée ou une teneur plus élevée en acide guluronique.
Figure 5 : Cellules encapsulées immédiatement après le processus. ( A ) Cellule vivante (vert, calcein AM) et coloration de cellules mortes (homodimère rouge, éthidium) de cellules encapsulées. ( B ) Image de contraste de phase du même cordon. Les cellules MIN6 ont été encapsulées dans 2%Des billes d'alginate en utilisant l'émulsification de 12 min, une acidification de 8 min et un tampon HEPES 10 mM tel que décrit dans ce protocole. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Diverses étapes (représentées sur la figure 2 ) pendant la réaction de gélification interne peuvent limiter la cinétique globale. Pour les grains de carbonate de calcium supérieurs à ~ 2,5 μm, le taux de dissolution du carbonate s'est révélé être un taux de limitation de la fréquence 26 , 44 . L'étape d'acidification qui conduit à la libération interne de calcium a également été démontrée comme étant la variable de processus critique affectant la survie cellulaire 32 . Les conditions qui conduisent à la gélification interne sont donc essentielles tant pour la qualité des perles que pour la survie cellulaire. Selon la demande finale pour les perles, différentes conditions opératoires optimales peuvent être choisies. Par exemple, une chute de pH plus élevée ( par exemple, en utilisant une HEPES 10 mM pour tamponner la solution d'alginate) peut être souhaitable pour des applications de transplantation où la stabilité à long terme des perles est cruciale. D'autre part, une baisse de pH plus faible ( p. Ex. En utilisant un MOPS de 60 mM pour buffeR la solution d'alginate) peut être préférable pour les applications in vitro .
En plus d'ajuster le niveau et la durée de l'acidification, d'autres modifications de processus peuvent être envisagées. Par exemple, d'autres configurations de récipient agité, des concentrations d'alginate, des tampons de traitement, des phases organiques et des agents acidifiants peuvent être utilisés. Comme discuté précédemment, la taille moyenne des perles peut être facilement ajustée en modifiant le taux d'agitation pendant l'étape d'émulsification. En outre, des temps d'émulsification plus long peuvent conduire à des tailles de perles plus petites, mais peuvent entraîner une diminution de la viabilité cellulaire. Les publications de Poncelet et al. 25 , 26 , 45 et Hoesli et al. 31 , 32 ont testé et discuté certaines de ces options.
Un léger changement dans le protocole décrit ci-dessus peut avoir un impact profond surLa génération de talons, la qualité des perles et la survie cellulaire. Le tableau 1 fournit un guide de dépannage pour comprendre et résoudre les problèmes qui peuvent survenir.
| Problème | Cause typique | Solutions suggérées |
| La roue empêche de tourner pendant l'addition d'alginate ou d'acide | Le champ magnétique est insuffisant pour un mélange adéquat ou l'arbre de la turbine est mal aligné | Assurez-vous que le ballon rotatif est bien centré sur la plaque magnétique et collé sur la plaque dans une position optimale avant d'ajouter le mélange d'alginate. Testez des taux d'agitation très élevés puis diminuez le taux d'agitation souhaité avant d'ajouter le mélange d'alginate. |
| Assurez-vous que l'arbre de la turbine est bien aligné et stable. Pour le BelLco spinner, assurez-vous que la turbine est fermement maintenue en place par des boulons des deux côtés du capuchon du flacon. Assurez-vous que le mouvement de la turbine est limité à la direction radiale (la roue ne doit pas basculer sur l'arbre). | ||
| Pas de perles obtenues | L'alginate a été mal émoussé | Assurez-vous que les micro-gouttelettes d'alginate sont visibles lors de l'émulsification. Sinon, vérifiez que la densité de la phase huile et la géométrie du récipient 23 sont similaires à celles décrites dans ce protocole. Une phase huileuse dense ou une géométrie de navire qui ne fournit pas une dissipation d'énergie locale suffisante peut ne pas permettre une émulsification d'alginate appropriée. |
| Pas de perles obtenues | La gommage interne n'a pas eu lieu | Une erreur commune est la dissolution incomplète de l'acide acétique dans la phase huileuse. Assurez-vous que le mélange d'acide-huile est suffisamment vortexé et qu'aucun acide acétique n'est observé à laAu bas du tube. |
Si la turbine n'atteint pas l'huile, plus d'huile peut être ajoutée avant d'ajouter l'alginate. Cependant, la quantité d'acide acétique doit être ajustée selon l'équation suivante:  Où  1 est le rapport phase huile / eau avant les modifications (p. Ex. 0,525 pour 10,5 ml d'alginate dans 10 ml d'huile + 10 ml d'huile acide), 2 est le rapport phase huile / eau après modifications au protocole, et Dow est le coefficient de distribution de l'acide acétique entre les deux phases. Ce coefficient de distribution peut être mesuré expérimentalement ou approximativement par des valeurs tirées de la littérature. Par exemple, le coefficient de distribution de l'acide acétique entre l'heptane et l'eau 46 est de 0,011. | ||
| Pas de perleS obtenu, ou les perles sont mécaniquement instables | La viscosité zéro-cisaillement de la solution d'alginate est inférieure à 0,004 Pa.s ou supérieure à 112 Pa.s | En raison de la grande variabilité discontinue des lots d'alginate, il est recommandé de mesurer la viscosité de différentes concentrations de solutions d'alginate. La combinaison d'un lot à haute viscosité avec un lot à faible viscosité peut être nécessaire pour atteindre une viscosité cible. Pour le mélange à 5% de LVM et MVG utilisé ici, la viscosité à cisaillement nulle était de 3,3 Pa.s. Il convient de noter que les alginates avec des longueurs de blocs d'acide guluronique trop courts ou des longueurs de chaîne globales courtes peuvent ne pas permettre la formation de gel. |
| Les perles sont trop grandes ou trop petites | Le taux d'agitation pendant l'émulsification est trop faible ou trop élevé pour la concentration d'alginate ou la viscosité utilisée | L'augmentation de la turbulence en augmentant le taux d'agitation ou en ajoutant des chicots réduira la taille des bourrelets. La concentration d'alginate, la températureLa géométrie du récipient et de la turbine aura tous des répercussions sur la taille du talon obtenue. |
| Beaucoup de perles cassées sont observées | Manipulation sévère des perles, dégâts lors de la phase de gommage interne ou insuffisance des perles. | Les dommages mécaniques aux perles peuvent entraîner une rupture des talons une fois que la gélification interne est initiée. Réduisez le taux d'agitation immédiatement avant l'étape d'acidification et assurez-vous que les perles sont manipulées doucement en utilisant des pipettes de 25 mL ou des pipettes de 1000 μL avec des pointes coupées. Si des perles endommagées sont observées même avec une manipulation prudente et une agitation réduite pendant l'acidification, la résistance du cordon peut être insuffisante. Cela pourrait être dû à une teneur insuffisante en acide guluronique ou à une gélification incomplète (par exemple, une acidification insuffisante). |
| Faible viabilité cellulaire | PH initial du procédé trop élevé ou pH final trop faible | La survie du procédé cellulaire des mammifères peut être augmentée en limitant la chute du pH et le temps d'acidification |
| Faible viabilité cellulaire dans les petites perles | Capacité insuffisante de tampon de la solution d'alginate | Une plus grande chute de pH est attendue dans les perles plus petites que dans les granulés plus gros en raison du plus grand rapport surface / volume de ces billes. Comme l'acide acétique ajouté à l'émulsion est limité, des concentrations plus élevées d'acide acétique sont prédites dans des billes plus petites pour la même concentration de CaCO 3 . L'augmentation de la capacité tampon de la solution d'alginate (par exemple, l'utilisation de MOPS 60 mM au lieu de 10 mM d'HEPES) peut augmenter la survie cellulaire dans les billes plus petites 32 . Les petites perles avec des pertes de cellules élevées pourraient être éliminées sélectivement par filtration ou sédimentation sans subir de grosses pertes volumétriques. |
| jeDissolution complète du CaCO 3 | Temps d'acidification ou d'acidification insuffisant. Notez que ce problème peut ne pas être problématique si la stabilité du talon est suffisante. | Une dissolution incomplète du CaCO 3 a été observée dans les gros perles suite à ce protocole 32 . L'ampleur de la dissolution du CaCO 3 peut varier en fonction de la taille du grain CaCO 3 , de la chute du pH pendant le processus, de la durée de la chute du pH, ainsi que de la concentration d'alginate utilisée. Ce problème n'est pas considéré comme problématique tant que la stabilité mécanique du talon est suffisante pour l'application souhaitée. Pour augmenter la réticulation des talons, assurez-vous que le grain de CaCO 3 est suffisamment petit (~ 2,5 μm). Sonicating la suspension de CaCO 3 peut aider à perturber les grains agrégés 26 . À des concentrations d'alginate très faibles ou élevées, des ajustements dans la concentration de CaCO 3 peuvent être nécessaires. Enfin, les chélateurs ou les solutions à faibleLes niveaux d'ions divalents entraîneront une perte graduelle de Ca 2 + dans le gel. Si la perte progressive de la stabilité mécanique du talon est observée, vérifiez que le tampon de stockage ou le tampon de culture contient> 2 mM Ca 2+ . |
Tableau 1: Guide de dépannage. Liste des problèmes, causes probables et solutions possibles.
Les limitations potentielles de l'émulsification et du processus de gélification interne pour la culture in vitro de cellules de mammifères et les applications de transplantation comprennent: (1) la nécessité d'une exposition transitoire à un faible pH, (2) la nécessité d'éliminer l'huile résiduelle, (3) la taille du cordon polydispersé (4) la contrainte de cisaillement potentielle pendant la formation de gouttelettes d'alginate et (5) la porosité plus élevée de perles gélifiées en interne par rapport aux perles gélifiées à l'extérieur 47 .
La survie à haute cellule et la fonction de MIN6 et de βTC3 ont été obtenuesAprès l'optimisation des processus 32 . Cependant, ce processus peut ne pas convenir à d'autres cellules sensibles au pH. L'élimination complète du pétrole des perles peut également être difficile et les types d'huile approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) sont nécessaires pour les éventuelles applications cliniques. La distribution de la taille du cordon polydispersé peut également être quelque peu problématique pour les applications d'immuno-séparation, où l'encapsulation cellulaire complète et la survie cellulaire à long terme sont souhaitables. Alors que les petites tailles de perles peuvent conduire à la protrusion cellulaire 48 , les gros perles peuvent entraver la diffusion des éléments nutritifs et / ou la fonction cellulaire 35 , 49 . D'autre part, le processus d'émulsification offre une occasion intéressante d'étudier l'effet de la taille des talons sur la survie cellulaire après la transplantation en générant des perles petites et grandes en un seul processus. La taille moyenne des talons peut facilement être ajustée en modifiant le taux d'agitation pendantG l'étape d'émulsification ( Figure 4 ). Enfin, la porosité plus élevée des perles gélifiées en interne peut également être préjudiciable à l'immuno-isolation, où des molécules telles que des anticorps et des cytokines devraient être exclues des perles. Cependant, le processus d'émulsification permet également la génération de talons à partir de solutions d'alginate très concentrées, réduisant ainsi la taille des pores de l'alginate.
Le processus d'émulsification et de gélification interne est une alternative intéressante aux encapsulateurs à base de buses pour les laboratoires souhaitant augmenter l'encapsulation des cellules ou ne pas avoir accès à un encapsulateur. Ce procédé est une méthode robuste et simple pour immobiliser les cellules dans des billes d'alginate en utilisant des solutions d'alginate très diluées ou très concentrées. Certaines des expériences ultérieures qui peuvent être réalisées avec les cellules immobilisées sont de déterminer l'effet de la matrice d'alginate sur les décisions du devenir cellulaire ou de déterminer dans quelle mesure les perles constituent une barrière entre transplanteD et le système immunitaire de l'hôte. La méthode d'émulsification et de gélification interne fournit une nouvelle approche pour encapsuler les îlots primaires dans de gros lots. Le procédé permet également l'encapsulation cellulaire dans des billes d'alginate hautement concentrées avec une porosité réduite et donc une réduction de l'accès des anticorps aux cellules encapsulées. La méthode d'émulsification et de gélification interne fournit donc un nouveau moyen pour générer des quantités cliniquement pertinentes de cellules thérapeutiques encapsulées.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Jill Osborne pour ses travaux de mise en terre sur le processus d'émulsification et Lauren Wilkinson pour un soutien technique. Nous remercions le Dr Igor Laçik, le Dr Timothy J. Kieffer et le Dr James D. Johnson pour leur contribution et leur collaboration. Nous remercions Diabète Québec, la JDRF, ThéCell, le Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG), le Centre pour la transplantation d'islet humain et la régénération bêta-cellulaire, le Réseau canadien de cellules souches, le Fondation Michael Smith pour la recherche en santé, le Fonds québécois de recherche sur la nature et les technologies et COST 865 pour un soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and consumables | |||
| LVM alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #1" in the results. |
| MVG alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #2" in the results. |
| Alginate (cell culture-grade) | Sigma | A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) | A2033 is referred to as "alginate #3" in the results. |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin | Thermo Fisher Scientific | SH3039603 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| HEPES, cell culture tested | Sigma | H4034-100G | |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | S271-1 | |
| Fine-grain CaCO3 | Avantor Materials | 1301-01 | After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month. |
| Light mineral oil | Thermo Fisher Scientific | O121-4 | Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use. |
| Glacial acetic acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | Handle with caution: refer to MSDS. |
| Sterile spatulas | Sigma | CLS3004-100EA | |
| Sterile nylon cell strainers, 40 µm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001 | |
| Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Toluidine Blue-O | Sigma | T3260 | |
| Equipment | |||
| 100 mL microcarrier spinner flasks | Bellco | 1965-00100 | The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet. |
| Magnetic stir plate with adjustable speed | Bellco | 7760-06005 | The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use. |
| Cell counter | Innovatis | Cedex AS20 | This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer. |
| LED light box | Artograph | LightPad® PRO | This item can be replaced by other types of illuminators. |
| Handheld camera | Canon | PowerShot A590 IS | A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images. |
| Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters | Olympus | IX81 | Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives. |
| Image aquisition software | Molecular Devices | Metamorph | A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images. |
| Image analysis freeware | CellProfiler | Non-applicable | A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ). |
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