Summary
健康实验室饲养蜱的生产对蜱生物学和蜱虫病原体相互作用的研究至关重要。在这里，我们展示了一种简单的方案，用于不成熟的蜱喂养，其成本效益和对小鼠的压力较小。
Abstract
肩突硬蜱 ，莱姆病的载体，是在东部和中西部的美国最重要的疾病载体之一。本种是三大主机剔需要从脊椎动物宿主的每个发展阶段血粉，而成年女性需要再现血粉。幼虫蜱附着其主机3 - 5天，喂食和脱落的主机时，完全充血。在几个不同的主机，这种依赖性和较长的附属时间怒张在实验室环境中蜱饲养复杂。然而，了解蜱生物学和蜱病原体相互作用，生产健康，实验室饲养的蜱是必不可少的。在这里，我们表现出不成熟蜱对小鼠喂食一种简单，经济高效的协议。我们修改了现有协议用于对小鼠应力减小和增大蜱通过使用一次性笼而不网格塔底供给成功和生存，以避免蜱无线的接触水被小鼠尿液和粪便污染。
Introduction
蜱是脊椎动物的专性吸血体外寄生虫和分布在世界各地。在美国，至少有11种蜱的是公众健康的重要性1病原体的载体。 肩突硬蜱负责若干病原体传播诸如莱姆病（ 布氏疏螺旋体 ）回归热（B. miyamotoi），人粒细胞无形体（ 无形体吞噬细胞 ），和巴贝虫病的病原体（巴贝虫属）。尽管肩突硬蜱的重要性作为一种疾病矢量，野生在实验室研究中收集大量这些蛛形纲动物并不总是可行的。因此，生产健康实验室饲养的蜱是靠赊账生物学的研究必不可少的，蜱病原体相互作用。
所有硬蜱（家庭硬蜱科），包括肩突硬蜱的生命周期，包括鸡蛋和三个ACTIV的e阶段：幼虫，若虫和成人。每个活动阶段饲养脊椎动物宿主。在几天的附着和喂养之间发生的蜱虫与其宿主之间发生的复杂相互作用几乎不可能使用人造饲料进行复制，并且不太可能提供足够数量的喂食蜱进行大规模饲养2,3,4 。因此，活体小鼠和兔子最常用作饲养未成熟（幼虫和若虫）和成熟阶段（成虫）蜱的宿主。在每个发育阶段，多个主机对供血的要求使得蜱饲养复杂化，并且是时间和成本密集的5,6,7 。大多数蜱饲养方案需要将小鼠保持在悬挂的网格地板笼7,8或圆柱形ca这样的尺寸，该动物不能自由地移动和新郎本身6，9，10的GE。
这些圆筒形保持架以后转移到鞋盒笼线栅。充血，独立蜱然后从下面的水收集。然而，在曝光馈此方法将导致蜱到污染的尿和粪便，可以增加真菌生长和蜱死亡率9的水。另外，它增加了从水槽蜱逃逸，以及引起应力小鼠的可能性。为了避免这些问题，我们在这里展示的塑料鞋盒型一次性笼中老鼠幼蜱喂养。此方法允许小鼠，充血蜱恢复增加的正常行为，并且降低由于污染蜱的死亡率。
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Protocol
下文概述的议定书（第00682号）由内华达里诺大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循内华达大学，雷诺动物研究伦理委员会的指导方针。简言之，将小鼠用异氟醚麻醉，并使用鼻锥来维持连续的异氟醚水平20分钟。使用兽医软膏防止麻醉下眼睛的干燥。使用脚趾钳来确定麻醉水平，并且在整个程序中测量呼吸频率。将小鼠保存在单独的笼中并进行监测，直到意识恢复。小鼠仅使用一次蜱喂养，并在蜱回收后进行安乐死。安乐死由动物医学实验室人员进行。 CO 2和颈脱位用于安乐死动物。
注意：打勾时需要使用完整的个人防护等级uipment。为了计数未成熟的蜱，请佩戴白色实验室外套，长的丁腈手套，以覆盖用橡皮筋覆盖的实验室外套的袖子开口，以及封闭式脚趾鞋。对于用蜱虫感染小鼠，请使用头发网，一次性工作服，袖口上的长袖手套和脚套。使用白色或浅色的工作服来检测方向蜱。定期检查手套和袖子的蜱虫。
动物屋准备室
- 指定一个单独的房间，以容纳被蜱虫感染的小鼠。在门外部和内部放置粘垫或双面地毯胶带，以防止意外剔除。
2.计数小鼠感染蜱虫
- 将双面胶带放在7“x 5”x 14“塑料容器的顶部边缘上，并充满水至约2厘米。
- 将另一个小盒子或培养皿放在容器的中心，并加满水至1厘米，＃34;护城河“围绕这个容器
- 将含有幼虫或若虫的小瓶存放在培养皿内。
- 使用精细的油漆刷从小瓶中取出幼虫或若虫，并在显微镜下计数。将50只幼虫或25只若虫计数到独立的闪烁瓶中。立即用尼龙网或有机布屏幕盖上小瓶，并用橡皮筋关闭。
3.用不成熟的蜱感染小鼠
- 使用白色或浅色工作台，并在工作区周边贴上双面胶带。
- 用异氟烷麻醉老鼠通过脚趾夹紧检查麻醉水平。一旦麻醉，将鼠标转移到用纸巾覆盖的加热垫上，并连接到鼻锥上以继续供应异氟烷。
- 使用基于油膏的眼膏软膏以避免干燥。注意鼠标的呼吸模式来调节异氟烷水平（每分钟80 - 230次呼吸是正常的，如果发生异烟灰，减少异氟烷水平呕吐率不超过每分钟80次呼吸以避免杀死动物）。
- 取一瓶50只幼虫或25只若虫，并用油漆刷将耳朵上的毛皮放在耳朵之间的头皮上（ 图1 ）。在放置后将鼠标置于麻醉下20分钟，以给足够的时间附上蜱。
- 将鼠标移动到带有静电盖和白色床上用品的标准塑料鞋盒型一次性鼠标笼。按照正常的老鼠护理， 随意提供玩具，水和食物。
- 将鼠标笼放置在较大的大鼠或沙鼠笼内，双侧粘胶带围绕顶部边缘。用3厘米的水填充外笼（ 图2 ）。
4.从小鼠收集蜱
- 饲养3至6天之间不成熟的蜱分离。在第3天之后，每天检查笼子和水壕沟。
- 在第4天和第6天之间从笼子收集分离的蜱。使用痛苦t刷或软镊子拾起蜷缩的蜱，并存放在用橡皮筋固定的尼龙网布上的干净的闪烁瓶中。
- 麻醉和检查鼠标在第7天任何剩余附加的蜱。
- 在第7天检查床上用品，食物槽和水瓶，以进行加注。按照上述步骤对小鼠进行安乐死。高压灭菌一次性笼子，床上用品，水瓶和食物槽，以避免任何逃逸的屁股。
美联储仓储
- 保持湿度为90％的潮湿蜱 °C和12:12光：在湿度和温度控制的培养箱中的黑暗循环，直到发生蜕皮。这可能需要大约12到18周的时间才能发生。
- 当高湿度促进蜱生存时，它也使蜱容易发生真菌过度生长。每星期至少检查一次显微镜下的喂食蜱，以进行模具。如果检测到，将70％乙醇中的幸存者洗涤5次分钟，在水冲洗，转移至滤纸干燥，并转移到新的，干净的小瓶中。
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Representative Results
我们修改现有蜱饲养协议6，10可以改善喂养效率和鼠标主机上减小的应力。结果表明，标准鞋盒风格鼠笼非常适合蜱饲养。白色的床上用品提供了美联储的刻度容易收集形成鲜明的对比。大多数蜱爬上容器壁后喂养，并很容易收集。此外，一次性的塑料盒，紧配合的盖子（常规地用于小鼠UNR住房）防止从盒剔逃逸。此外，我们没刮胡子蜱侵袭小鼠（ 图1）。这些变化在公布的方案导致显著蜱附着，暴饮暴食，和生存。
因为它不要求这些alread以外的任何特殊鼠笼该协议是成本有效的在使用中它也减少劳动密集型，因为我们不必每天收集积累的蜱虫。我们在感染后4到6天收集了蜱。大多数蜱在第4天分离，剩下的几个在第5天分离。到第7天，所有的小鼠都没有蜱。我们能够恢复平均67％（范围52 - 92％）的幼虫蜱（ 表1 ）。所有的小鼠都是健康的，没有出现任何不舒服的迹象。
图1：在小鼠上喂食喙鞘幼虫。小鼠单独感染50只幼虫蜱。在4-6天之间，小鼠的蜱虫从小鼠中脱落。在第7天检查笼子上剩下的任何蜱，之后丢弃。 A：用不成熟的幼虫蜱感染小鼠。 B：附在小鼠耳朵上的幼虫滴。 C：安在幼虫感染后3天，附着在小鼠耳朵上的幼虫幼虫滴落。 D：未充分和充分蜱虫幼虫。
图2：鼠标笼设置为蜱感染。将两只一次性鼠笼保存在沙鼠笼内。约3厘米将水加入沙鼠笼中制成护城河。将双面粘性地毯带固定在沙鼠笼的顶部边缘周围，以避免蜱虫逃逸。
| 动物（小鼠） | 幼虫蜱总数已恢复 | 百分比幼虫蜱恢复 |
| 1 | 34 | 68％ |
| 2 | 32 | 64％ |
| 3 | 38 | 76％ |
| 4 | 28 | 56％ |
| 五 | 39 | 78％ |
| 6 | 26 | 52％ |
| 7 | 46 | 92％ |
| 8 | 29 | 58％ |
| 9 | 29 | 58％ |
| 10 | 33 | 66％ |
| 平均 | 66.8％ |
表1： 实验室侵袭后恢复对麻醉鼠标主机 充血的 肩突硬蜱 幼虫 的数量 。每只小鼠用50幼虫。
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Discussion
议定书内的关键步骤
在饲养蜱时要有几个级别的安全措施，以避免意外逃跑。使用粘性胶带和水沟护理对于确保安全至关重要。将麻醉的鼠标保持在加热垫上以保持体温恒定是很重要的。我们还发现，剃须鼠标不会为蜱附着提供任何额外的好处。单个鼠标可以在指定的“蜱室”中保存在同一个笼子中一周，这进一步限制了蜱虫与人员的联系。
修改和故障排除
对于蜱生物学和蜱虫病原体相互作用的研究，生产高质量的实验室饲养蜱是必需的。以前的饲养方案使用悬吊丝地板8或圆柱形笼子来保持小鼠不动6,10，这会招来额外的费用，也会对动物造成压力。此外，悬挂线笼可以让蜷缩的蜱从线中掉入被尿液和小鼠粪便污染的水中，从而增加霉菌生长的风险。
技术的局限性
数据显示，我们平均成功恢复了65％（高达92％）的蜱。我们偶尔在小鼠笼外的水护环中发现蜱虫，但没有人逃脱。第二个容器的外壁上的粘性胶带阻止了蜱虫的逃逸。
对现有/替代方法的技术意义
我们使用鞋盒式一次性小鼠笼子的方案允许自由运动范围，并且表明小鼠不需要被约束以允许蜱喂养。大多数喂食的蜱都容易从透明笼壁看到并收集，任何剩余的蜱都很容易在喂养周期结束时检测床上用品。此协议不需要任何自定义鼠标笼，因此，它是成本有效的。
文献表明，小于50％的滴答贴在鼠标上，并不是所有附加的蜱饲养完成。平均而言，我们收集了约60％的幼虫蜱。我们没有找到任何逃脱的没有或喂食的蜱虫。偶尔，我们在水壕中发现一两个幼虫蜱，但在胶带上没有。我们的研究结果表明，并不是所有的蜱都附着在宿主身上，可能会死亡而不进食。在垃圾中很难找到死亡的蜱虫。偶尔，我们还发现白色床上的血迹，表明两只老鼠在脱落或刮掉后都会死亡。我们的数据和网箱的日常观察表明，蜷缩的蜱可以在笼壁和笼子的顶部上移动，或者隐藏在被褥之下，远离鼠标的距离。因此，封闭的笼子没有对蜱生存的负面影响。
掌握此技术后的未来应用或方向
我们的协议提供了一个简单的替代方案，大量饲养蜱，而不增加额外的费用或减少处理动物的人员的安全。未来的实验将重点是改善喂养成年sc ular病的方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
