Summary
Produktionen av friska laboratorieuppfödda fästingar är avgörande för studier av fästbiologi och tick-patogen interaktioner. Här visar vi ett enkelt protokoll för omoglad fekmatning som är kostnadseffektiv och mindre stressfull för möss.
Abstract
Ixodes scapularis, vektorn av borrelia är en av de viktigaste vektorerna i östra och Midwestern USA sjukdomar. Arten är en tre värd fästing som kräver en blodmjöl från ett ryggradsdjur värd för varje utvecklingsfas, och vuxna kvinnor kräver en blodmjöl för reproduktion. Larvfästingar fäster sin värd för 3 - 5 dagar för matning och lämning värd när den är helt svullna. Detta beroende på ett flertal olika värdar och den långa fästtiden för mjölkstockning försvårar tick uppfödning i laboratoriemiljö. Men för att förstå tick biologi och fästing patogen interaktioner är avgörande produktionen av friska, laboratorie uppfödda fästingar. Här visar vi en enkel, kostnadseffektiv protokoll för omogen tick livnär sig på möss. Vi ändrat de befintliga protokoll för minskad stress på möss och ökad tick mata framgång och överlevnad genom att använda engångs burar utan maskbottnar för att undvika kontakt av fästingar wiDet vatten som är förorenat med urin och avföring från möss.
Introduction
Fästingar är obligatoriska hematofagliga ektoparasiter hos ryggradsdjur och distribueras över hela världen. I Förenta staterna är minst 11 arter av fästingar vektorer av patogener av folkhälsoproblem 1 . Ixodes scapularis är ansvarig för överföringen av flera patogener, såsom orsakssambanden till Lyme- sjukdomen ( Borrelia burgdorferi ) relapsing fever ( B. miyamotoi), human granulocytisk anaplasmos ( Anaplasma phagocytophilum ) och babesiosis (Babesia spp.). Trots vikten av I. scapularis som en sjukdomsvektor är det inte alltid möjligt att samla dessa araknider i överflöd från vilda för studier i laboratoriet. Därför är produktionen av friska laboratorieuppfödda fästingar avgörande för studier av fästbiologi och tick-patogen interaktioner.
Livscykeln för alla hårda fästingar (familjen Ixodidae), inklusive I. scapularis, består av ägget och tre aktivaE-steg: larva, nymf och vuxen. Varje aktivt stadium matar på en vertebrat värd. De komplexa interaktioner som äger rum mellan fästingar och deras värdar under flera dagar av fästning och utfodring är nästan omöjliga att replikera med hjälp av artificiella matare, och det är osannolikt att de ger tillräckligt med fodrade fästingar för massuppfödning 2 , 3 , 4 . Därför används levande möss och kaniner oftast som värdar för odling av omogna (larver och nymfer), och mogna steg (vuxna) av fästingar. Kravet på flera värdar för blodfodring under varje utvecklingsstadium komplicerar fältuppfödning och är tid och kostnadskrävande 5 , 6 , 7 . De flesta fästuppfödningsprotokoll kräver att musen hålls i ett golvburen 7 , 8 eller i ett cylindriskt caGe av sådana dimensioner att djuret inte kan röra sig fritt och bruka sig själv 6 , 9 , 10 .
Dessa cylindriska burar överförs senare till en skobox med ett trådnät. Engorged, fristående ticks uppsamlas sedan från vattnet under. Emellertid resulterar denna metod i att exponera matade fästingar till vatten förorenat med urin och avföring som kan öka svamptillväxt och fäst mortalitet 9 . Dessutom ökar det möjligheten att tippa fly från vattentraget, samt orsaka spänning på möss. För att kringgå dessa problem demonstrerar vi här larvalkfodring på möss i engångsburar av plast-shoebox-typ. Denna metod möjliggör det normala beteendet hos möss, ökar engorged tick recovery och minskar fäst mortalitet på grund av kontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet (Number-00.682) beskrivs nedan har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Nevada Reno och följer riktlinjerna i University of Nevada, Reno djurforskningsetiska kommittén. I korthet, sövdes mössen med isofluran och en noskon användes för att upprätthålla kontinuerliga isofluran nivåer för 20 min. En veterinär salva användes för att förhindra uttorkning av ögon under anestesi. Tå nypa användes för att fastställa anestesinivå och andning mättes under hela förfarandet. Möss hölls i individuella burar och övervakas tills medvetandet återvanns. Möss användes endast en gång för tick utfodring och avlivades efter fästing återhämtning. Eutanasi utfördes av laboratoriet för veterinärmedicin personal personal. CO 2 och halsdislokation användes för euthanizing djur.
OBS: Att arbeta på fästingar kräver användning av fullständig personlig skyddsutrustning equipment. För att räkna omogna fästingar, bära vita labrockar, långa nitrilhandskar för att täcka lockets öppning av lab coaten, täckt med gummiband och slutna tånskor. För infesting möss med fästingar, använd ett hårnät, engångsskydd, långärmad handskar över ärmarna och fotöverdrag. Använd vita eller ljusa överaller för att upptäcka farliga fästingar. Kontrollera regelbundet handskar och ärmar för fästingar.
1. Förberedelse av rum för djurhus
- Beteckna ett separat rum för att huse möss infekterade med fästingar. Placera en klibbig matta eller dubbelsidigt matt tejp utvändigt och inuti dörren för att förhindra oavsiktlig frikoppling.
2. Räkning av fästingar för musinfästning
- Lägg dubbelsidigt tejp runt omkanterna på en 7 "x 5" x 14 "plastbehållare och fyll i ca 2 cm med vatten.
- Placera en annan liten låda eller petriskål i mitten av behållaren och fyll i vatten till 1 cm och skapa en &# 34; vallgrav "runt denna behållare
- Förvara injektionsflaskan med larver eller nymfer inuti petriskålen.
- Använd en fin pensel för att ta bort larver eller nymfer från flaskan och räkna under mikroskopet. Räkna 50 larver eller 25 nymfer i separata scintillationsflaskor. Täck injektionsflaskorna omedelbart med nylonnät eller organdydukskärm och stäng med gummiband.
3. Infestning av möss med omogena fästingar
- Använd en vit eller ljusfärgad arbetsbänk och fäst dubbelhäftande tejp runt omkretsen på arbetsområdet.
- Bedöv musen med isofluran. Kontrollera narkosnivå vid täppning av tån. När du anesteserat, överför musen till en värmepanna som är täckt med pappershanddukar och fäst på en näskon för fortsatt isoflurantillförsel.
- Applicera petroleumgelbaserad ögonsalva för att undvika torrhet. Notera musens andningsmönster för att justera isofluranhalterna (80 - 230 andetag per minut är normalt., Minska isofluranhalten om breathing hastigheten är mindre än 80 andetag per minut för att undvika att döda djuret).
- Ta en flaska med 50 larver eller 25 nymfer och plats markeringar under pälsen på huvudet mellan öronen med en pensel (Figur 1). Håll musen under narkos i 20 minuter efter placering för att ge tillräckligt med tid för fästingar för att fästa.
- Flytta musen till en standard, plast skokartong av engångstyp mus bur med statiska lock och vita sängkläder. Ge leksaker, vatten och mat ad libitum enligt vanlig mus vård.
- Lagra musen buren inom en större råtta eller gerbil bur fodrad med dubbelsidig tejp runt toppkanterna. Fylla den yttre buren med 3 cm vatten (Figur 2).
4. Uppsamling Fästingar från möss
- Omogna fästingar lösgöra mellan dagarna 3 och 6 av utfodring. Kontrollera burar och vatten vallgrav för svullna fästingar varje dag efter dag tre.
- Samla fristående fästingar från buren mellan dag 4 och 6. Använd en smärtaT-borste eller mjuka tångar för att plocka upp fogade fästingar och förvara i rena scintillationsflaskor, täckta med nylonmaskdräkt säkrat med gummiband.
- Bedöva och kontrollera musen på dag 7 för eventuella kvarstående fästingar.
- Kontrollera sängkläderna, matrännan och vattenflaskan för häftiga fästingar på dag 7. Frigör möss enligt proceduren som beskrivits ovan. Autoklaver disponibla burar, sängkläder, vattenflaska och matkrok för att undvika att undvika frikopplingar.
5. Förvaring av Fed Ficks
- Behåll engorged fästingar med 90% fuktighet, 20 ° C och en 12:12 ljus: mörk cykel i en luftfuktighet och temperaturkontrollerad inkubator tills smältning sker. Det kan ta cirka 12 till 18 veckor att inträffa.
- Medan hög luftfuktighet främjar fek överlevnad, gör det också ticksna benägna att svamp överväxt. Kontrollera matad ticks under mikroskopet minst en gång i veckan för mögel. Om det upptäcks tvätta överlevande i 70% etanol för 5Min, skölj i vatten, överför till ett filterpapper för att torka och överföra till nya, rena flaskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi modifierade befintliga fästing uppfödning protokoll 6, 10 för förbättrad matningseffektivitet och minskad stress på musen värd. Resultaten visar att de vanliga skokartong stil mus burar är väl lämpade för tick uppfödning. Den vita sängkläder som en bra kontrast för enkel samling av matade fästingar. De flesta fästingar klättrade uppför väggarna i behållarna efter utfodring och var lätta att samla in. Dessutom den snäva monterade locket av de disponibla plastlådor (som rutinmässigt används för möss bostäder vid UNR) förhindrade kryssa flykt från lådan. Dessutom, vi inte raka möss för fästingangrepp (Figur 1). Dessa förändringar i publicerade protokoll ledde till betydande fästingvidhäftning, svullnad och överlevnad.
Detta protokoll är kostnadseffektivt eftersom det inte kräver några speciella mus burar utanför de already vid användning. Det är också mindre arbetskrävande eftersom vi inte behövde samla svullna fästingar varje dag. Vi samlade fästingar mellan dag 4 och 6 efter angrepp. De flesta fästingar fristående dag fyra och några återstående fristående dag 5. Vid dag 7 alla möss var fria från fästingar. Vi skulle kunna återhämta ett genomsnitt av 67% (intervall 52-92%) blodfyllda larver fästingar (Tabell 1). Alla möss var friska och visade inte några tecken på obehag.
Figur 1: Feeding Ixodes scapularis Larver på möss. Möss individuellt infekterad med 50 larver fästingar. De engorged fästingar sjönk utanför musen mellan dagar 4 - 6 Burarna kontrollerades för eventuella återstående fästingar på dag 7 och kastas därefter. A: angriper möss med unfed larver fästingar. B: En larv tick knutna till örat på en mus. C: EnEngorged larval fästet fäst vid örat av en mus, 3 dagar efter infestation. D: Unfed och helt engorged tick larver.
Figur 2: Musburk Inställd för Tick-infästning. Två disponibla musburar hölls inne i en gerbilbur. Cirka 3 cm. Vatten sattes till gerbilburet för att göra en vallgrav. Dubbelsidig klibbig tejptejp fästs runt kanbilburens övre kanter för att undvika frikoppling.
| Djur (mus) | Totalt antal larvskonsten återhämtade | Procentuell antal larvskonsten återhämtade sig |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| GENOMSNITT | 66,8% |
Tabell 1: Antal engagerade Ixodes scapularis Larvae återställd efter laboratorieinfästning på bedövade musvärdar. Varje mus var infekterad med 50 larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att ha flera nivåer av säkerhetsåtgärder när uppfödning fästingar för att undvika oavsiktlig fly. Användning av tejp och en vatten vallgrav är avgörande för att garantera säkerheten. Det är viktigt att hålla den sövda musen på en värmedyna för att hålla kroppstemperaturen konstant. Vi fann också att raka musen inte ger någon extra fördel för fästingvidhäftning. En enskild mus kan hållas i samma bur under en vecka i en utsedd "tick rum" som ytterligare begränsar kontakt av fästingar med personalen.
Ändringar och felsökning
Produktionen av högkvalitativa, laboratorie uppfödda fästingar är nödvändig för studier på tick biologi och fästing patogen interaktioner. Tidigare matningsprotokoll användes suspenderad tråd golvet 8 eller cylindriska burar för att hålla mössen orörliga 6, en0 vilket medför extra kostnad samt stress för djuret. Dessutom tillåter den suspenderade trådbur de svullna fästingar att falla genom viran in i vatten förorenat med urin och avföring från musen vilket ökar risken för mögeltillväxt.
Begränsningar av tekniken
Såsom visas i uppgifterna, vi framgångsrikt utvanns i genomsnitt 65% (upp till 92%) av fästingar. Vi fann då fästingar i vatten vallgrav utanför musen buren men ingen undan. Tejp på de yttre väggarna av andra behållaren förhindras fästingar från att fly.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Vår protokoll att använda skokartong stil engångs möss burar tillåter fri rörelseomfång och visar att möss inte behöver hållas tillbaka för att möjliggöra tick utfodring. Flesta matade fästingar var lätt ses och samlas in från de transparenta burväggarna och eventuella kvarvarande fästingar är lättDetekteras bland sängkläder i slutet av matningscykeln. Detta protokoll kräver ingen anpassad musbur, så det är kostnadseffektivt.
Litteraturen antyder att mindre än 50% av fästingarna fästs på musen och inte alla fästingar fäster till färdighet. I genomsnitt samlade vi ~ 60% engorged larval fästingar. Vi hittade inte några räddade eller födda fästingar. Ibland hittade vi en eller två engorged larval fästingar i vattensvatten men ingen på klibban. Våra resultat tyder på att inte alla fästingar fäster vid värden och kan dö utan att utfodra. Unfed, döda fästingar var svåra att hitta i kull. Ibland hittade vi också blodfläckar på det vita sängkläderet vilket tyder på att antingen musen har dödat det engorged fästet efter att ha släppt eller repat. Våra data och dagliga observationer av burar tyder på att inslagna fästingar antingen rör sig upp på burvmuren och på toppen av buret eller gömmer sig under sängkläderna från musens räckvidd. Därför har den bifogade buret inte enY negativ påverkan på fästing överlevnad.
Framtida applikationer eller anvisningar efter att ha behärskat denna teknik
Vårt protokoll ger ett förenklat alternativ för massuppfödning av fästingar utan att lägga till extra kostnad eller minska säkerheten hos personalen som hanterar djuren. Framtida experiment kommer att fokusera på att förbättra metoder för utfodring av vuxna I. scapularis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
