Summary
La produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni. Qui mostriamo un semplice protocollo per l'alimentazione tick immaturo che è costo-efficace e meno stressante per i topi.
Abstract
Ixodes scapularis , il vettore della malattia di Lyme, è uno dei più importanti vettori delle malattie negli Stati Uniti orientali e mediorientali. Questa specie è un trifoglio host che richiede un pasto di sangue da un ospite vertebrato per ogni fase di sviluppo e le femmine adulte richiedono un pasto di sangue per la riproduzione. Le zecche di larve si attaccano al loro ospite per 3 - 5 giorni per l'alimentazione e scendono l'ospite quando sono completamente ingolfati. Questa dipendenza da diversi host differenti e il lungo periodo di attacco per l'ingranaggio complicano l'allestimento del ticchettio nell'ambiente di laboratorio. Tuttavia, per comprendere la biologia dei tick e le interazioni tra tick-pathogen, la produzione di zecche sane e testate da laboratorio è essenziale. Qui dimostriamo un semplice e conveniente protocollo per l'immatura del tick in mouse sui topi. Abbiamo modificato i protocolli esistenti per diminuire lo stress sui topi e aumentare il successo e la sopravvivenza di alimentazione dei ticchetti usando gabbie monouso senza fondi a maglie per evitare il contatto di ticks wiAcqua contaminata con urine e feci di topi.
Introduction
Le zecche sono obbligati ectoparassiti ematofagi dei vertebrati e sono distribuiti in tutto il mondo. Negli Stati Uniti, almeno 11 specie di zecche sono vettori di agenti patogeni di importanza per la salute pubblica 1. Ixodes scapularis è responsabile per la trasmissione di diversi agenti patogeni come gli agenti causali della malattia di Lyme (Borrelia burgdorferi) febbre ricorrente (B. miyamotoi), anaplasmosi granulocitica umana (Anaplasma phagocytophilum), e babesiosi (Babesia spp.). Nonostante l'importanza di I. scapularis come vettori di malattie, la raccolta di questi aracnidi in abbondanza in natura per gli studi in laboratorio non è sempre fattibile. Pertanto, la produzione di zecche allevate in laboratorio sano è essenziale per gli studi di biologia tick, tick e-patogeno interazioni.
Il ciclo di vita di tutte le zecche dure (famiglia Ixodidae), tra cui I. scapularis, è costituito da l'uovo e tre activE stadi: larva, ninfa e adulti. Ogni fase attiva viene alimentata da un host vertebrato. Le complesse interazioni che si verificano tra zecche e loro ospiti durante diversi giorni di attacco e di alimentazione sono quasi impossibili da replicare usando mangimi artificiali e sono improbabili che forniscono un numero sufficiente di zecche alimentate per l'allevamento di massa 2 , 3 , 4 . Pertanto, i topi e conigli vivi vengono utilizzati più frequentemente come host per l'allevamento di immaturi (larve e ninfe), e fasi mature (adulti) di zecche, rispettivamente. Il requisito di ospedali multipli per l'alimentazione del sangue durante ogni fase di sviluppo complica l'allattamento dei ticchetti e è tempo e costi intensivi 5 , 6 , 7 . La maggior parte dei protocolli per l'allevamento del ticchettio richiede la conservazione dei topi in una gabbia a pavimento griglia metallica sospesa 7 , 8 o in un cilindro caGe di tali dimensioni che l'animale non può muoversi liberamente e lo sposo stesso 6 , 9 , 10 .
Queste gabbie cilindriche vengono successivamente trasferite in una gabbia di scarpiere con una griglia metallica. Quindi vengono raccolti le zecche ad anello incastrate e smontate. Tuttavia, questo metodo consente di esporre le zecche alimentate ad acqua contaminata da urine e feci che possono aumentare la crescita delle funghi e la mortalità dei segni. Inoltre, aumenta la possibilità di fuggire dal bacino dell'acqua, oltre che causare stress ai topi. Per aggirare questi problemi, qui dimostriamo che la tambura di larvale è alimentata su topi all'interno di gabbie monouso di tipo plastic shoebox. Questo metodo consente il normale comportamento dei topi, aumenta il recupero ingorgo del ticchettio e diminuisce la mortalità dei segni a causa della contaminazione.
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Protocol
Il protocollo (Number-00682) descritto qui di seguito è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) presso l'Università del Nevada Reno e segue le linee guida della University of Nevada, animale comitato etico della ricerca di Reno. In breve, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano e un'ogiva è stato utilizzato per mantenere livelli isoflurano continui per 20 min. Un unguento veterinario è stato usato per l'essiccamento della occhi sotto anestesia. Toe pinch stata utilizzata per determinare il livello di anestesia e la frequenza respiratoria è stata misurata durante tutta la procedura. I topi sono stati tenuti in gabbie individuali e monitorati finché fu recuperato. I topi sono stati utilizzati una sola volta per l'alimentazione zecche e sono stati sottoposti ad eutanasia recupero post tick. L'eutanasia è stata realizzata dal Laboratorio di personale di staff animale medicina. CO 2 e dislocazione cervicale sono stati utilizzati per l'eutanasia degli animali.
NOTA: Lavorare su zecche richiede l'uso di completa eq di protezione individualeAZIONE DEI DISPOSITIVI. Per il conteggio delle zecche immature, indossare cappotti di laboratorio bianco, guanti nitrilici lunghi per coprire l'apertura del manicotto del cappotto di laboratorio con bande di gomma e scarpe chiuse. Per infestare i topi con le zecche, utilizzare una rete di capelli, tuta da lavoro usa e gonna, guanti a maniche lunghe sulle maniche e coprisedili. Utilizzate tute bianche o colorate per rilevare le zecche instabili. Controllare periodicamente i guanti e le maniche per le zecche.
1. Preparazione della sala per l'alloggiamento degli animali
- Designare una stanza separata per ospitare i topi infestati da zecche. Posizionare una tappetino appiccicoso o un nastro di moquette su entrambi i lati dentro e fuori la porta per evitare fughe accidentali.
2. Conteggio delle zecche per l'infestazione del mouse
- Inserire nastro a doppia faccia intorno ai bordi superiori di un contenitore di plastica da 7 "x 5" x 14 "e riempire con acqua a circa 2 cm.
- Inserire un'altra piccola scatola o un piatto di Petri al centro del contenitore e riempi con acqua a 1 cm creando un &# 34; fossero "intorno a questo contenitore
- Conservare il fiale contenente le larve o le ninfe all'interno del piatto di Petri.
- Utilizzare un pennello di vernice fine per rimuovere le larve o le ninfe dalla fiala e contare sotto il microscopio. Conta 50 larve o 25 nimfe in flaconi di scintillazione separati. Coprire immediatamente i flaconcini con lo strato di maglia nylon o organdy e chiudere con fasce di gomma.
3. Infestare i topi con le immature zecche
- Utilizzare una panca da lavoro bianco o leggera e bastone a nastro biadesivo lungo il perimetro dell'area di lavoro.
- Anestetizzare il mouse con isoflurano. Controllare il livello di anestesia con il pizzico della punta. Una volta anestetizzato, trasferire il mouse su un tappetino riscaldato rivestito di tovaglioli di carta e fissarlo a un cono di naso per la fornitura continua di isoflurano.
- Applicare unguento a base di gelatina petrolifera per evitare la secchezza. Si noti il pattern di respirazione del mouse per regolare i livelli di isoflurano (80 - 230 respiri per min è normale., Ridurre il livello di isoflurano in brIl tasso di eathing è inferiore a 80 breath per min per evitare l'uccisione dell'animale).
- Prendete un fiale di 50 larve o 25 nimfe e posizionate le zecche sotto la pelliccia sulla testa tra le orecchie con un pennello ( figura 1 ). Tenere il mouse sotto l'anestesia per 20 minuti dopo il posizionamento per dare tempo sufficiente per le zecche da attaccare.
- Spostare il mouse su una gabbia usa e getta monouso tipo scatola in plastica con coperchi e biancheria bianca. Fornire giocattoli, acqua e cibo ad libitum come per la cura del mouse normale.
- Conservare la gabbia del mouse all'interno di una gabbia più grande di ratto o gerbil, rivestita di nastro adesivo su due lati intorno ai bordi superiori. Riempire la gabbia esterna con 3 cm di acqua ( Figura 2 ).
4. Raccolta di zecche dai topi
- I ticchetti immaturi si separano tra i giorni 3 e 6 dell'alimentazione. Controllare ogni giorno dopo giorno le gabbie e il fossato d'acqua per le zecche ingannate.
- Raccogli le zecche distaccate dalla gabbia tra i giorni 4 e 6. Utilizzate un doloreT pennello o pinze morbide per raccogliere le zecche ingrassate e conservare in flaconi di scintillazione puliti con panno in maglia nylon fissati con bande di gomma.
- Anestetizzare e controllare il mouse il giorno 7 per qualsiasi rimanente zecche allegate.
- Controllare la biancheria da letto, l'alimento e la bottiglia d'acqua per le zecche ingannate il giorno 7. Eutanizzare i topi seguendo la procedura descritta in precedenza. Autoclave le gabbie usa e getta, la biancheria, la bottiglia d'acqua e il cibo per evitare qualsiasi scompigliamento delle zecche senza peli.
5. Immagazzinamento delle zecche di Fed
- Mantenere le zecche ingrossate all'umidità del 90%, 20 ° C, e una luce 12:12: il ciclo scuro in un incubatore di umidità e temperatura controllato fino a quando si verifica un molting. Ciò può richiedere circa 12 a 18 settimane.
- Mentre l'elevata umidità favorisce la sopravvivenza del bersaglio, rende anche i ticks suscettibili di sovrapposizione fungina. Controllare le zecche alimentate sotto il microscopio almeno una volta alla settimana per lo stampo. Se rilevato, lavare i sopravvissuti in etanolo al 70% per 5Min., Sciacquare in acqua, trasferire su un filtro da asciugare e trasferirlo in flaconi nuovi e puliti.
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Representative Results
Abbiamo modificato i protocolli 6 , 10 per l'allevamento dei tick , per migliorare l'efficienza di alimentazione e ridurre lo stress sull'host del mouse. I risultati dimostrano che le gabbie di mouse standard in stile shoebox sono adatte per l'allevamento dei ticchetti. La biancheria bianca forniva un buon contrasto per una facile raccolta di zecche alimentate. La maggior parte delle zecche si sono arrampicate sulle pareti dei contenitori dopo l'alimentazione e sono state facilmente raccolte. Inoltre, il coperchio stretto delle scatole di plastica monouso (usato normalmente per i topi alloggiati a UNR) ha impedito la fuga di tastatura dalla scatola. Inoltre, non abbiamo rasato i topi per l'infestazione dei ticchetti ( Figura 1 ). Questi cambiamenti nei protocolli pubblicati hanno provocato un significativo attaccamento dei tick, l'ingranaggio e la sopravvivenza.
Questo protocollo è conveniente in quanto non richiede alcuna gabbia di mouse speciale al di fuori di quelle legatey in uso. E 'anche meno laborioso perché non abbiamo avuto bisogno di raccogliere le zecche gonfio ogni giorno. Abbiamo raccolto le zecche tra i giorni 4 e 6 infestazioni postali. La maggior parte delle zecche staccati dal giorno 4 e pochi quelli rimasti staccati dal giorno 5. Di giorno 7 tutti i topi erano liberi di zecche. Siamo stati in grado di recuperare una media del 67% (range 52-92%) Engorged zecche larvali (Tabella 1). Tutti i topi erano sani e non hanno mostrato alcun segno di disagio.
Figura 1: alimentazione Ixodes scapularis larve su topi. I topi sono stati infestati singolarmente con 50 zecche larvali. Le zecche gonfie lasciati il mouse tra i giorni 4 - 6. Le gabbie sono stati controllati per i restanti zecche il giorno 7 e scartati in seguito. A: infestano i topi con le zecche larvali digiuni. B: Un segno di spunta larvale fissaggio all'orecchio di un topo. C: UnLancetta di labbro ingradita attaccata all'orecchio di un topo, 3 giorni dopo infestazione. D: Unfed e larve di tick tick completamente.
Figura 2: La gabbia del mouse è impostata per l'infestazione Tick. Due gabbie a gettoni monouso erano tenute all'interno di una gabbia gerbil. Circa 3 cm. L'acqua è stata aggiunta alla gabbia gerbil per fare un fossato. Il nastro adesivo a doppia faccia è stato apposto intorno ai bordi superiori della gabbia gerbil per evitare la fuga di ticchettio.
| Animale (mouse) | Il numero totale di zecche di larve recuperato | Le zecche di larve in percentuale recuperate |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| MEDIA | 66,8% |
Tabella 1: Numero di Ixodes scapularis Larvae recuperate dopo l'infestazione da laboratorio sugli anestetizzati Mouse Hosts. Ogni mouse è stato infestato da 50 larve.
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Discussion
Passi critici all'interno del protocollo
È importante avere diversi livelli di misure di sicurezza durante l'allevamento delle zecche per evitare fuga accidentale. L'uso di nastro adesivo e fossato d'acqua sono fondamentali per garantire la sicurezza. È importante mantenere il mouse anestetizzato su un tappetino per mantenere costante la temperatura corporea. Abbiamo anche scoperto che la rasatura del mouse non fornisce alcun vantaggio in più per l'attaccatura del tick. Un singolo topo può essere tenuto nella stessa gabbia per una settimana in una "stanza del tick" designata che limita ulteriormente il contatto di zecche con il personale.
Modifiche e risoluzione dei problemi
La produzione di zecche coltivate in laboratorio di elevata qualità è necessaria per studi sulla biologia delle zecche e sulle interazioni tra agenti tick-pathogen. I precedenti protocolli di alimentazione hanno utilizzato un pavimento a filo sospeso 8 o gabbie cilindriche per mantenere i topi immobile 6 , 10 che incorrere costo aggiuntivo così come lo stress per l'animale. Inoltre, la gabbietta sospesa permette zecche gonfio a cadere attraverso il filo in acqua contaminata da urina e feci di topo, aumentando così il rischio di crescita di muffe.
LIMITI DELLA TECNICA
Come mostrato nei dati, abbiamo recuperato con successo in media 65% (fino al 92%) delle zecche. Occasionalmente trovato zecche in fossato acqua al di fuori della gabbia del mouse, ma nessuno riuscì a fuggire. Il nastro adesivo sulle pareti esterne del secondo contenitore impedito zecche fuoriuscita.
Importanza della tecnica in materia d 'esistenti / metodi alternativi
Il nostro protocollo di usare scarpa box stile gabbie topi monouso permette gamma libera di movimento e dimostra che i topi non hanno bisogno di essere trattenuto per consentire l'alimentazione tick. La maggior parte zecche fed erano facilmente osservati e raccolti dalle pareti della gabbia trasparenti e le rimanenti zecche sono facilmenterilevata tra assestamento al termine del ciclo di alimentazione. Questo protocollo non richiede alcuna gabbia del mouse personalizzato, quindi, è conveniente.
Letteratura suggerisce che meno del 50% delle zecche allegare to topo e non tutte zecche attaccate alimentano al completamento. In media, abbiamo raccolto ~ 60% zecche larvali gonfio. Non abbiamo trovato alcun sfuggito zecche digiuni o alimentati. Di tanto in tanto abbiamo trovato uno o due tick larvali engorged in fossato d'acqua, ma nessuno sul nastro adesivo. I nostri risultati suggeriscono che non tutte le zecche si attaccano per l'host e possono morire senza alimentazione. Digiuni, zecche morti erano difficili da trovare nella lettiera. Di tanto in tanto, abbiamo anche trovato macchie di sangue sul letto bianco che suggerisce che sia il mouse aver ucciso il segno di spunta engorged dopo aver lasciato spento o graffiato. I nostri dati e l'osservazione giornaliera di gabbie suggeriscono che gonfio zecche o salire sulle pareti della gabbia e la parte superiore della gabbia o nascondere sotto la biancheria da letto lontano dalla portata del mouse. Pertanto, la gabbia chiusa non hanno uny impatto negativo sulla sopravvivenza tick.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Il nostro protocollo fornisce un'alternativa semplificata per l'allevamento di massa di zecche, senza aggiunta di costi extra o ridurre la sicurezza degli movimentazione degli animali del personale. Sperimentazione futuro si concentrerà sul miglioramento dei metodi di alimentazione degli adulti I. scapularis.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
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