Summary
Мы подробно метод для изготовления трехмерных бумажных микрожидкостных устройств для использования в разработке иммуноанализа. Наш подход к сборке устройства представляет собой тип многослойной структуры, добавка производства. Мы демонстрируем сэндвич иммуноанализа для получения репрезентативных результатов для этих видов бумажных устройств.
Abstract
Бумага фитили жидкости автономно за счет капиллярного действия. По кучность бумаги с гидрофобными барьерами, транспортировка жидкостей может контролироваться и направляться в слой бумаги. Кроме того, укладка нескольких слоев бумаги узорной создает сложные трехмерные микрожидкостных сети, которые могут поддержать развитие аналитических и биоаналитических анализов. Бумага на основе микрофлюидальные устройства недороги, портативный, легкий в использовании и не требуют внешнего оборудования для работы. В результате, они имеют большие перспективы в качестве платформы для точки оказания медицинской помощи диагностики. Для того, чтобы правильно оценить полезность и аналитическую производительность бумажных устройств, подходящие методы должны быть разработаны для обеспечения их производство является воспроизводимым и в масштабе, который подходит для лабораторных установок. В этой рукописи, способ для изготовления общей архитектуры устройства, которое может быть использовано для бумажных иммуноанализа описывается. Мы используем форму аддитивной изготовления уг (многослойное ламинирование) для подготовки устройства, которые содержат несколько слоев узорной бумаги и узорной клея. В дополнение к демонстрации надлежащего использования этих трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств с иммуноанализа для хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), ошибки в процессе производства, что может привести к отказам устройств обсуждаются. Мы ожидаем, что этот подход к технологии производства бумаги на основе устройства найдут широкое применение в разработке аналитических приложений, разработанных специально для условиях ограниченных ресурсов.
Introduction
Бумага широко доступен в диапазоне составов или классов, могут быть функционализированные для настройки его свойств, и может транспортировать жидкости автономно под действием капиллярных сил или впитывания. Если бумага с рисунком с гидрофобным веществом (например, фоторезист 1 или воск 2), впитывающее жидкости можно регулировать в пределах пространственно слоем бумаги. Например, приложенное водный образец может быть направлен на ряд различных зон, чтобы вступать в реакцию с химическими и биохимическими реагентами, хранящимся в бумаге. Эти бумажные микрофлюидальные устройства были продемонстрированы , чтобы быть полезной платформой для разработки портативных и недорогих аналитических анализов 3, 4, 5, 6, 7. Применение бумажных микрофлюидальных устройств включают в себя пункт-ухода диагностикиэф "> 8, мониторинг загрязнителей окружающей среды 9, обнаружение поддельных лекарственных средств 10, и делокализованы здравоохранения (или" телемедицина ") в ограниченных ресурсов установки 11.
Несколько слоев узорчатой бумаги могут быть собраны в единое устройство , где гидрофильные зоны из соседних слоев (то есть, выше или ниже) подключаются к образуют непрерывные жидкостных сети , чьи входы и выходы могут быть соединены или влево независимыми. 12 Каждый слой может содержать уникальный шаблон, который позволяет пространственное разделение реагентов и нескольких анализов , которые должны выполняться на одном устройстве. В результате трехмерная Микрожидкостных устройство не только способны впитывания жидкости, позволяющие аналитических анализов (например, функция печени тесты 13 и электрохимическую обнаружение малых молекул 14), но он может также вирпорт ряд сложных функций (например, клапаны 15 и 16 простых машин) , общие для традиционных микрофлюидальных подходов. Важно отметить, что из-за бумаги фитили жидкости под действием капиллярных сил, эти устройства могут работать с минимальными усилиями со стороны пользователя.
Поскольку реагенты могут быть сохранены в пределах трехмерной архитектуры бумажной основе устройства, сложные протоколы могут быть сведены к одному добавлением водного образца к устройству. Недавно мы представили общую архитектуру трехмерное устройство, которое может быть использовано для разработки бумажных иммуноанализа с использованием метода восковой печати для создания узорных слоев. 17, 18 Эти исследования были сосредоточены на том , как аспекты , связанные с конструкцией устройства-количества наложенных друг на друга слоев используется, состав слоев, и образец трехмерной микрожидком сети под контролем общей перпроизводительности таких иммуноанализа. В конечном счете, мы смогли использовать эти правила проектирования для содействия быстрому развитию мультиплексированного иммуноанализа 19. В этой рукописи, ранее разработанная для иммунологического анализа хорионического гонадотропина человека (ХГЧ; беременность гормон) 17 используется в качестве примера для иллюстрации стратегий , которые мы разработали для сборки и изготовления трехмерных бумажных иммуноанализа. Соответственно, мы ориентируемся на монтаже и эксплуатации устройства, а не разработке анализа.
В сэндвич иммуноанализа, который является форматом, используемым для обнаружения ХГЧ захвата антитела, специфичные к одной субъединице гормона наносят на твердую подложку, которая затем блокируют, чтобы ограничить неспецифической адсорбции образца или любого последующего реагента. Этот субстрат является наиболее часто полистирольный планшета дл (например, для твердофазного иммуноферментного анализа или ELISA). Затем образецдобавлены в лунку и оставляли выдерживаться в течение определенного периода времени. После тщательного промывания добавляют антитело, специфичное к другому субъединицей ХГЧ и позволили инкубировать. Это антитело обнаружения может быть конъюгирован с коллоидной частицы, фермент или флуорофором с целью получения измеримого сигнала. Хорошо снова промывают до интерпретации результаты анализа (например, с использованием планшет - ридера). В то время как коммерческие наборы полагаться на этот многоступенчатой трудоемкий процесс, все эти шаги могут быть быстро выполнены в бумажной основе микрожидкостных устройств с минимальным вмешательством к пользователю.
Устройство , используемое для ХГЧ иммунологического анализа включает в себя шесть активных слоев, которые, сверху вниз, используемые для добавления образца, сопряженного хранения, инкубации, захвата, промывка и блоттинга (рисунок 1). Образец дополнение слой изготовлен из качественной фильтровальной бумаги. Это облегчает введение жидкого образца и защищает реагенты в сопряженном ЛэR от загрязнения из окружающей среды или случайного контакта пользователем. Сопряженная слой (качественный бумажный фильтр) держит цвет по производству реагента (например, коллоидное золото-меченых антител) для иммуноферментного анализа. Инкубационный слой (качественный фильтровальная бумага) позволяет образец путешествовать в боковом направлении в пределах плоскости бумаги, чтобы способствовать связыванию аналита с реагентами до достижения следующего слоя, слой захвата. Слой захвата (нейлоновую мембрану) содержит лиганды, специфичные для анализируемого вещества, адсорбированного на материале. После того, как анализ завершен, то этот слой раскрывается для того, чтобы визуализировать законченного иммунокомплексными. Мыть слой (качественный фильтр бумаги) привлекает избыток жидкости в том числе свободных сопряженных реагентов вдали от поверхности слоя захвата в блот слой (толщиной хроматографической бумаги). Устройство шестислойный проводится совместно пятью слоями узорчатого, двухстороннюю клейкую: четыре слоя клея постоянного поддержания целостности ASSEMкровоточили устройство и один слой съемного клея облегчает отслаивание устройства для проверки результаты иммунологического анализа на слое захвата.
Для целей этой рукописи, мы используем только положительные и отрицательные контрольные образцы ХГЧ (0 мМЕ / мл и 81 мМЕ / мл, соответственно) для получения репрезентативных результатов бумажной основе иммуноферментного анализа, что позволяет специальный обсуждение взаимосвязи между способы изготовления и производительность устройства. В дополнение к демонстрации того, как успешно производить устройства, мы выделяем несколько производственных ошибок, которые могут привести к выходу из строя устройства или невоспроизводимых результатов анализа. Протокол и обсуждение подробно в этой рукописи предоставит исследователям ценную информацию о том, как на бумажной основе иммунологические разработаны и изготовлены. В то время как мы фокусируем нашу демонстрацию на иммуноанализа, мы ожидаем, что принципы, представленные здесь, будут широко полезны для изготовления трех-Дименасиональных на бумажной основе микрожидкостных устройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка слоев микрожидкостных устройств на бумажной основе
- Подготовка моделей для слоев бумаги, нейлона и клея с помощью графической программы проектирования программного обеспечения. 6 Каждый слой может иметь различный характер.
Примечание: Шаблон может включать в себя отверстия выравнивания, которые не требуются для функционального бумажной основе иммуноферментного анализа, но помочь с воспроизводимым изготовления трехмерных устройств. Размещение этих отверстий будет отличаться, если устройства собраны в индивидуальном порядке, в лентах или в виде полных листов. Программа программное обеспечение , используемое для разработки моделей может варьироваться в зависимости от выбора метода структуризации (например, фотолитографии, воск печати или резки). 6 - Брызги рабочую зону с раствором 70% (об / об) этанола и воды. Протрите область работы с чистым бумажным полотенцем.
2. Подготовка слоев бумаги: Примеры того, Сопряженно хранения, инкубирование и умой Слои
- Подготовьте слои качественной фильтровальной бумаги, используя большой резак настольный бумаги. Вырезать фондовый лист бумаги в стандартный формат бумаги для облегчения кучность с использованием твердых чернил (воск) принтер. Например, один 460 х 570 мм 2 лист может сделать 4 листа бумаги US Letter (8,5 х 11 дюймов 2). Ручка с бумагой чистые перчатки в любое время, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Загрузите вырезать лист хроматографической бумаги в лоток принтера. Печать ранее разработанные слои (рисунок 1).
Примечание: Шаблон может быть напечатан непосредственно на этом листе, используя автоматическую подачу. Только один лист бумаги должен быть напечатан в то время, чтобы избежать застревания бумаги. Для всех слоев, используйте "Enhanced" параметры печати.
3. Получение нейлоновой мембраны Layer: Capture Layer
- Вырезать фондовый рулон нейлоновую мембрану на листы (7,5 х 10 дюймов 2) с помощью резака бумаги столешница. Соблюдайте осторожность при обращении с нейлономмембраны для поддержания его целостности и защиты от копирования. Храните неиспользованную материал в эксикаторе шкафу, так как нейлоновые мембраны чувствительны к влаге.
Примечание: Обрежьте листы являются более узкими, чем US Letter бумаги. Поскольку нейлоновые мембраны являются тонкими и хрупкими, они не могут быть обработаны с помощью принтера непосредственно и требуют поддержки. Подробности описаны ниже. - С помощью воска принтер, распечатать шаблон захвата слоя на лист бумаги для копирования и ленты ее светового короба, чтобы служить в качестве руководства для позиционирования нейлоновой мембраны. Светлая коробка помогает выравнивание нескольких слоев.
- Поместите чистый лист бумаги для копирования на ранее напечатанного листа бумаги для копирования. Лента чистый лист бумаги к светлой коробке, но не магнитофоны два листа вместе.
- Поместите форматный лист нейлоновой мембраны на чистый лист бумаги для копирования. Убедитесь, что мембрана закрывает печатную площадь нижнего слоя бумаги для копирования. Лента все четыре стороны нейлоновой мембраны для чистого листабумаги для копирования.
Примечание: Убедитесь , что нейлоновая мембрана является плоской и гладкой , так что нет никаких проблем с печатью (например, замятия бумаги или неравномерной печати воска). Воск может быть напечатано на ленте, где нейлоновые мембраны, прикрепленной к копировальной бумаги. В этом случае, области, где нейлон неполностью узорчатые из-за покрытия на магнитной ленте должны быть отброшены. Для будущих препаратов, более крупные куски нейлоновой мембраны могут быть использованы, чтобы избежать этой ошибки печати. - Загрузите лист нейлоновой мембраны (поддерживаемый копировальной бумаги, прикрепленному к нему) в лоток ручной подачи принтера. Печать только один лист нейлоновой мембраны одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет никаких шагов по подготовке необходимых для блот-слоя, так как он не по образцу.
4. Создание гидрофобные барьеров в напечатанном слое
- Лента отпечатанные слои на акриловой рамки для равномерного нагрева выше и ниже слоя при помещении в гравитационный конвекционной печи. Держите нейлоновую мембрану приклеенный кподдержка листа бумаги для копирования до после того, как воск плавится и образуются гидрофобные барьеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: акриловая рамка представляет собой выполненное на заказ, лазерная резка кусок 1/2 ".. Толстый оргстекла двух размеров в зависимости от количества устройств, изготовленных были использованы внешняя граница меньшего кадра измеряет 11 5/8" х 2 3/4 ", а внутреннее отверстие рамы измеряет 10 3/8" х 1 3/4 ". внешняя граница большего кадра измеряет 11 5/8" х 8 7/8 ", а внутренний отверстие рамы измеряет 10 1/4 "х 7 7/8". открытая, внутреннее пространство позволяет даже плавлении воска по всей толщине листа. - Поместите слои в печи при 150 ° С в течение 30 секунд до тех пор, пока воск не растает в толщине бумаги. Убедитесь, что воск пронизана толщину бумаги, повернув его и проверяя несовершенства конструкции.
Примечание: Принудительный печи воздух или горячий пластины также могут быть использованы для плавления твердого воска чернил. раз плавильныеили температуры могут варьироваться в зависимости от способа нагрева. - Извлеките бумагу и нейлоновую мембрану из акрилового кадра. Кроме того, удалить нейлоновую мембрану из опорного листа бумаги для копирования.
5. Подготовка адгезивных слоев
- Pattern Двухсторонняя листы клейкой пленки с использованием роботизированного ножа плоттера, используя проектные файлы, предварительно подготовленный (шаг 1.1). Защитите любую открытую клейкую поверхность, используя лист воска лайнера.
Примечание: Клеевой двухсторонний следует узорной с отверстиями, позволяющими образец течь через слои в виде непрерывного струйного пути. Воск вкладыш легко удаляется из клея, и служит для защиты от загрязнения и разрывам во время резания. Резак лазер или умирают пресса также могут быть использованы для формирования рисунка слоев клейкой пленки.
6. Подложка из слоев устройства с помощью клейкой
- Спрей световую коробку с раствором 70% (об / об) этанола и воды. Протрите чистой бумаги тOwel.
- Лента фигурным слоем бумаги или нейлоновой мембраны, которая должна быть подкреплена с клеем на световом коробе с отпечатанной стороной вниз.
- Пил одну сторону защитной гильзы из узорчатого листа клея и прикрепить его к слою бумаги или нейлоновой мембраны. С помощью светового короба, чтобы обеспечить надлежащее выравнивание моделей. Сжать. Поместите частично собранное устройство в защитной полосой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитный скольжения является сложенный лист пленки для ламинирования подложки, которая защищает устройства от загрязнения или повреждения, гарантируя, что они не контактируют с ламинатор роликами. - Пропускают полученную сборку двухслойную через автоматизированный ламинатор, чтобы полностью нажмите клей и бумагу вместе, удаляя карманы воздуха из присоединяемых слоев.
Примечание: воздушные карманы между слоями устройства могут создавать помехи целостности устройства и затекания воспроизводимостью путем приводит к утечкам.
7. Лечение Сопряженных LАйер с реагентами для иммуноанализа перед сборкой устройств
- Ленточный конъюгат слой на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
- Добавить 2,5 мкл 100 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в гидрофильной зоне на конъюгате слое. Дайте ей высохнуть при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем при 65 ° С в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем достаточно лишь смочить зону бумаги. Раствор БСА помогает предотвратить агрегацию коллоидных наночастиц в процессе сушки, что облегчает высвобождение наночастиц, когда бумага и реагенты регидратации образцом. - Добавьте 5 мкл 5 OD коллоидного золота наночастицы конъюгированных с анти-бета-ХГЧ антителом, и повторить процесс сушки.
Примечание: Единицы концентрации наночастиц коллоидного золота часто выражаются в виде оптической плотности (OD), измеренной по абсоrbance при λ = 540 нм. Никакое лечение не требуется для фитиля прокладки перед монтажом устройства в Разделе 10.
8. Лечение бокового канала с реактивом для иммуноанализа Перед сборкой устройств
- Ленточный слой боковой канал на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
- Добавьте 10 мкл блокирующего агента (5 мг / мл обезжиренного молока и 0,1% (об / об) твина 20 в 1x PBS) для лечения бокового канала. Повторите тот же процесс сушки (2 мин при комнатной температуре, а затем при 65 ° С в течение 5 мин) в качестве сопряженного слоя.
9. Лечение захвата слоя с реагентами для иммуноанализа перед сборкой устройств
- Лента захвата слой на акриловой раме таким образом, что гидрофильные зоны, подлежащей обработке приостанавливается, и не вступает в контакт с рамой.
- Обрабатывают слой захвата с 5 мкл 1 мг / мл анти-α-ХГЧ антителом, а затем позволитьобразец высохнуть при комнатной температуре в течение 2 мин, затем 8 минут при температуре 65 ° С.
- Добавьте 2 мкл блокирующего агента (5 мг / мл обезжиренного молока и 0,1% (об / об) твина 20 в 1x PBS). Повторите процесс сушки для слоя захвата.
Примечание: Эта сумма подходит для покрытия бумаги без закупоривания пор нейлоновой мембраны, что может произойти, когда слишком много используется блокирующий агент.
10. Монтаж Трехмерная бумаги на основе микрожидкостных устройств
- Лента промывочной слой на световом коробе (отпечатанной стороной вверх). Если используются отверстия выравнивания, удалите их с последующими слоями с помощью ручного инструмента перфорирования.
- Удалите защитную пленку на задней стороне слоя захвата, чтобы обнажить клей. Совместите слой захвата над промывочного слоя, используя отверстия выравнивания в качестве ориентира. Нажмите два слоя вместе. Избегайте прикосновения гидрофильных зон, чтобы свести к минимуму загрязнение или повреждение устройства. Пинцет может быть использован для оказания помощи АССАМБЛЕЯLY.
- Удалите защитную пленку на задней части инкубационного слоя, чтобы обнажить клей. Совместите инкубационный слой над слоем захвата и нажмите их вместе. Продолжайте добавлять слои таким образом, пока все активные слои не будут собраны.
- Поместите частично собранное устройство в защитной полосой и надежно прикрепить слои вместе, используя ламинатор.
- Удалите защитную пленку на задней части промывного слоя и прикрепить Блот слой на нижней части устройства. Повторите шаг ламинирование 10.4, чтобы завершить сборку трехмерной бумажной основе микрожидкостных устройств. Вырезать требуемое количество устройств из полос или листов полностью собранных устройств с помощью ножниц.
Примечание: полные листы устройств, полосы устройств или отдельные устройства могут быть получены с использованием аналогичного подхода.
11. Выполнение иммуноанализа на бумажной основе
- Добавьте 20 мкл образца к гидрофильной зоне на верхней части устройства (то есть, тон образец слоя).
- Подождите образца впитывать полностью в устройство, а затем добавляют 15 мкл промывочного буфера (0,05% об / об Твина 20 в 1x фосфатным буферным раствором). После того, как первый аликвоту промывочного буфера нечестивым полностью в устройство, добавить второй 15 мкл аликвоты буфера для промывки.
ПРИМЕЧАНИЕ: промывочный буфер имеет полностью нечестивые в устройство, когда капля жидкости исчезла, не показывая мениск на поверхности бумаги. Анализ завершается, когда второй аликвоты буфера для промывки полностью вошел в устройство. - Для выявления результатов анализа, отслаиваться трех верхних слоев устройства с помощью пинцета , чтобы обнажить слой захвата.
- Интерпретировать результаты анализа качественно путем наблюдения за наличие или отсутствие цвета. В качестве альтернативы, изображение считывания слой с помощью сканера на рабочем столе и использовать программное обеспечение для обработки изображений или алгоритмы для количественной оценки результатов и характеризуют распределение интенсивности в пределахЗона обнаружения. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Получение воспроизводимых опробования представления в трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств зависит от способа изготовления, что обеспечивает согласованность между устройствами. Для достижения этой цели, мы определили ряд производственных процессов и материальных соображений, и обсуждать их здесь, в контексте демонстрации бумаги на основе иммуноферментного анализа. Мы используем метод восковой печати для формирования гидрофобных барьеров в бумажной основе микрожидкостных устройств (Рисунок 2А). 2 Этот метод является идеальным , поскольку он опирается только на широко доступного офисного оборудования, требует минимальных процедурных шагов для завершения, и не требует использования химических веществ (например, фоторезистов) , который может взаимодействовать с адсорбции белка или изменяющие смачиваемость волокон бумаги. Кроме того, воск печати производит жидкостных пути с воспроизводимыми размерами, что является критическим для анализов с повторяемостью характеристик и длительности титез. После того, как формируются гидрофобные барьеры, клейкие листы наносят на слои , чтобы облегчить сборку трехмерных устройств (рис 2В). Любые реагенты , необходимые для иммунологического анализа может быть применен после того , как клейкая пленка добавляется к задней части слоя (фиг.2с). Эта процедура полезна для процессов изготовления в академической лаборатории, так как многие устройства могут быть получены параллельно. Процесс сборки для иммунологического анализа устройства завершается после того, как все слои прибора уложены и ламинированных вместе (рис 2D). Добавим, образец, чтобы начать анализ. В этом примере мы используем контроль мочи набор для тестов на беременность, который содержит положительные и отрицательные образцы ХГЧ в буфере, в качестве образцов для демонстрации работы наших устройств и воспроизводимость анализов проводили их использованием. Две аликвоты промывочного буфера, затем добавляют последовательно. После того, как окончательный аликвоту промывочного буфера полностью вошел в устройство, темАнализ считается завершенной. Верхние три слоя затем отслаивают , чтобы открыть слой захвата (рис 3А). Этот шаг необратимо портит устройство, обеспечивающее, что он не может быть использован повторно. Завершение бумажной основе результатов иммунологического анализа в качественном цветном отсчетом, которые могут указать отрицательный или положительный вывод при визуальном осмотре. Объективность этих результатов проявляется в некорректированных изображений , полученных с помощью планшетного сканера (рис 3B).
Неудачные эксперименты часто может выделить определенные процедурные шаги, важность которых может быть иначе незаметны при анализе эксперимента ориентирован на успешных результатов. Мы демонстрируем три ошибки при изготовлении и сборке трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств, которые приводят к сбоям иммунологического: (I) Иногда сбои устройств не очевидны, пока после того, как анализ будет завершен. Например, милиsalignment между слоями , содержащими инкубационной канала и захвата зоны может вызвать развитие нерегулярные схемы положительного сигнала, что может привести к неправильной интерпретации качественного сигнала пользователем (рис 4A). (II) Если воск не печатается в достаточном количестве или не могут полностью расплавить через всю толщину листа, то целостность полученных гидрофобных барьеров может быть поставлена под угрозу. Неполное образование этих барьеров приведет к потере контроля над капиллярного затекания и привести к утечкам внутри устройства. Например, вместо того, чтобы удерживающего потока в канале в пределах слоя, полупроницаемую восковой барьер позволит жидкости впитывать в другом месте в плоскости бумаги. Без определенных каналов, образец вряд ли достигнет захвата или мыть слоев. Пользователь будет воспринимать такого рода ошибки, как сильно укороченном времени продолжительности анализа. Мы демонстрируем этот отказ прибора нанесением раствора красного пищевого красителя а-ляЕр которого воск образец не дают расплавиться в течение всего 30 секунд (рис 4В). Иммунологический анализ с использованием такого слоя был "завершен" через 6 мин, что явно отличается от ожидаемой продолжительностью 15 мин. (III), которые берут анализы дольше, чем ожидалось, чтобы закончить может указывать на неисправность в изготовлении устройства. Например, неправильно вырезать клейкие или закупоренных поры в связи с применением избыточного количества реагентов (например, агенты , блокирующие или коллоидного золота) может запретить образец или буфер для промывки от входа в устройство (фиг.4С).
В целом, наш протокол производства полезен для изготовления многочисленных бумажных микрожидкостных устройств параллельно в масштабе, который является полезным для академической лаборатории. Показана производительность ХГЧ на бумажной основе иммунологического приготовленного с использованием данного метода, выполнив 70 анализов параллельно: 35 негативных повторах и 35 положительных гeplicates. Для целей демонстрации, мы приготовили набор слоев с конструкциями нашего устройства, присоединили слоев бумаги с клеем, а затем разрезают листы в ряды устройств. Каждый лист был разрезан на 7 строк, которые содержали десять устройств. Это способствовало расположение слоев на более мелкие акриловые кадры, где слои проклеены, а затем обрабатывают реагентами, необходимыми для выполнения анализов. Этот способ подготовки устройства предлагается в примечании в протоколе. После обработки слоев, устройства были собраны в виде полос из десяти, а затем ламинируют. После того, как были завершены последние шаги изготовления устройства, устройства остались в полосах десяти и образца добавляли к каждому устройству. Мы наблюдали интенсивность отказов 0% для устройств, изготовленных с использованием нашего протокола. Мы использовали программное обеспечение для обработки изображений 20 с открытым исходным кодом для количественной оценки результатов этих анализов. Хотя ряд методов доступны для анализа интенсивности раздачиионов в круглых пятен (например, радиальных или линейных распределений) 21 мы измеряем среднее значение интенсивности от зеленого канала цветовых оттенков изображения устройства , используя всю точку обнаружения как области , представляющей интерес. 17, 18, 19 Затем мы нормировать измерения как положительных , так и отрицательных анализов путем вычитания исходных данных отрицательные (рис 3б). Мы определили коэффициент вариации для каждого набора данных составляет 1% для анализов проводили с использованием отрицательных проб и 3% для анализов проводили с использованием положительных образцов.
Рисунок 1: Схема трехмерной бумажной основе устройства. На этом рисунке показаны гидрофобные и гидрофильные участки, которые определяют жидкостный путь внутри устройства, а также PATTerned слои постоянного и сменного клея, которые держат слои вместе. Каждый слой имеет метку функции, которую он выполняет в анализе. Красный, синий или зеленый контур на каждом слое указывает на материал, используемый для изготовления этого конкретного слоя (красный: хроматография бумаги, синий: нейлон мембраны, зеленый: толстый хроматографическую бумагу). Размеры приведены для каждой зоны в пределах устройства в мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Процедура , используемая для изготовления иммунологических из трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств. (A) Изображения передней и задней части листа хроматографической бумаги с рисунком , используя восковую печать до и после нагревания. (Б) Лист хроматографической бумагипри поддержке с пленкой узорной клея. (C) обработки , которые применяются к гидрофильным зонам полосы узорной мембраны из нейлона. (D) Монтаж полос многослойного устройства с использованием светового короба и отверстия выравнивания в качестве ориентира. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Интерпретируя результаты на бумажной основе иммуноферментного анализа. (A) Верхние три слоя бумаги на основе устройства ободраны назад , чтобы обнажить слой захвата и интерпретации результатов анализа. (B) Графическое представление выполнения бумажной основе иммуноферментного анализа для ХГЧ. Результаты, изображенные являются средние 70 повторах выполняются одновременно, где 35 дублирует каждый используются FOг положительные и отрицательные образцы ХГЧ. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение набора данных. Откорректировано, репрезентативные изображения, изображающие положительный (красный цвет) и отрицательные (белый цвет) результаты из ХГЧ иммунологического анализа приведены выше соответствующих данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Примеры погрешностей изготовления. (А) Из - за перекоса бокового канала над слоем захвата, позитивный сигнал концентрируется на небольшом участке зоны считывания. "Мокрый" круговой области (пунктирные контуры) можно наблюдать справа от зоны считывания в результате контакта между смещенной боковой канал со слоем захвата (слева). Изображение положительного отсчетом назахват слой выровнен устройства (справа). (Б) Неполное плавления воска по всей толщине слоя может привести к утечкам внутри устройства. Пищевой краситель добавлен к раствору, чтобы помочь с визуализации образца в слоях с неполным или полностью сформированным гидрофобными барьерами. (С) неправомерное вырезать клей может блокировать жидкостный сеть между слоями бумаги, которая останавливает поток образца. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Изготовление трехмерных бумажных микрожидкостных устройств. Схематическое изображает сборку и ламинирование нескольких слоев узорчатой бумаги в готовые трехмерных устройств. В этом примере, 70 устройств сбыть сделано одновременно. Слои клеевых и выравнивания отверстий были удалены из схемы для упрощения. После сборки, отдельные устройства могут быть удалены и использованы в анализах. Красные, синие, зеленые и контуры на каждом слое указывают материал, используемый для изготовления этого конкретного слоя (красный: хроматография бумаги, синий: нейлон мембраны, зеленый: толстый хроматографическую бумагу). Шкала бар = 25 мм для отдельного устройства (справа), который имеет размеры 12 х 28 мм 2 , за исключением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение воспроизводимый стратегии производства является одним из важнейших компонентов развития анализа. 22 Мы используем последовательный, слой за слоем подход к производству трехмерных бумажных микрожидкостных устройств. В отличие от тех методов , которые применяются складные или оригами методы для производства многослойных устройств из одного листа бумаги 23, 24 добавка для производства предлагает целый ряд преимуществ: (I) Множественные материалы могут быть включены в единую архитектуру устройства без модификации методов печать, выравнивание, или сборка слоев. (II) Шаблонные клейкие пленки могут быть интегрированы в процесс сборки. Эти пленки аффикс примыкающие слои, и, основываясь на прочность клея, может быть обратимым, чтобы позволить отслаивание и оценку внутренних слоев. Кроме того, клеи обеспечивают структурную целостность трехмерного устройства, что исключает необходимостьдля связующего вещества 25 зажимов или механической обработке корпусов. 23 (III) Отдельные листы хроматографической бумаги US Letter можно разместить массив повторах, который может значительно улучшить пропускную способность лабораторного масштаба производства (рисунок 5). Это особенно полезно при оценке многочисленных экспериментальных условий, которые требуют технических повторах. При таком подходе, 70 трехмерные устройства на основе бумаги, могут быть получены одновременно. (IV) Аналогична многослойное ламинирование подходы используются для производства больших объемов многочисленных коммерческих продуктов в области здравоохранения (например, раневых повязок по уходу и трансдермальные пластыри), которые , следовательно , значительно снижает продуктивность барьера для перевода этих трехмерных бумажных микрожидкостных устройств.
В дополнение к облегчению шелушение и сборки, выбор клея также имеет важное значение для конструкции трехмерной струйного сети. Объявлениеhesive пленка может служить в качестве дополнительного барьера между слоями бумаги, которые могут дать возможность маскирования гидрофильных зон на соседних слоях. На практике, использование тонких слоев клея желательно. Если клей слишком густой (например, многие двусторонние ленты), то разрыв , образованный между слоями бумаги будет слишком большим , чтобы облегчить затекания и должны быть заполнены гидрофильным веществом (например, порошок целлюлозы) , чтобы восстановить функцию. 12 В то время как этот дополнительный шаг добавляет сложности изготовления и вещество , используемое могут создавать помехи в анализах, эти разрывы становятся полезной функцией для производства управляемой, жидкостных стековой клапанов. 15 Другие формы клея были использованы при изготовлении трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств. Клеевые спреи предлагают простой способ наносить слои друг с другом. 26 С помощью этого метода, адгезивный материал наносится равномерно на обе тон гидрофобные и гидрофильные площадь бумаги. Преимущество этого метода состоит в том , что дополнительное оборудование (например, нож или плоттер лазерный резак) не требуется , чтобы разработать шаблон для клеевого слоя. Тем не менее, условия для равномерного нанесения клея распылением должны быть определены экспериментально для каждого вида используемого материала. Рельеф материала может влиять на интерфейс клеящего материала и более длительное время распылители могут быть необходимы для более грубых поверхностей. Кроме того, распыление клея на гидрофильных зон жидкостный пути может привести к нарушению капиллярного затекания путем изменения смачиваемости бумаги. В качестве альтернативы, использование трафаретов 27 или трафаретной печати 8 может быть использован для клея рисунка непосредственно на слои узорчатой бумаги.
Два основных соображения для разработки трехмерных бумажных микрофлюидальных устройств являются выбор материалов и дизайн ФлуиDIC сеть. (I) Мы выбираем материалы и комбинации материалов на основе капиллярного скорости, прочность во влажном состоянии, толщина и белка-связывающей способности. Влагоотведение скорость может влиять на продолжительность и анализе количества времени реагентов должны реагировать или связываться внутри слоя. Различные сорта бумаги характеризуются затекания ставки на основе, например, обработка бумаги, его пористости, а также его толщины. Можно использовать несколько слоев бумаги, чтобы увеличить эффективную скорость впитывания устройства. 28 Хорошая прочность во влажном состоянии, желательно для приложений , которые требуют обработки (например, шелушение иммуноанализа) после того, как устройство было насыщенное с образцом. Материалы , которые являются слишком толстыми или которые не могут быть пропущены через коммерческий принтер из - за хрупкости потребуется альтернативный метод для получения узорчатые каналов (например, фотолитографии). Тем не менее, в отличие от этого, более толстые материалы идеальны для блот слоев (или стоков) для рисования жидкости через йе устройство. Многие сорта нейлоновые мембраны имеются в продаже, которые могут отличаться в их способности связывать белки необратимо в зону захвата. Существенные замены (например, нитроцеллюлоза вместо нейлоновую мембрану) может также влиять на связывающую способность, что может повлиять на чувствительность анализа. (II) Использование симметрии при проектировании жидкостных сетей гарантирует , что уникальные каналы узорчатые в трехмерные устройства ведут себя одинаково (например, заполняется одновременно), что имеет решающее значение для мультиплексных анализов. 19 Симметрия дополнительно упрощает конструкцию слоя, помогает с выравниванием слоя при сборке полных листов устройств, и может свести к минимуму количество отходов. Изменения в конструкции устройства могут влиять на производительность анализа. Например, при увеличении длины бокового канала в инкубационной слое будет влиять на продолжительность анализа, так как жидкость будет впитывать пропорционально большее расстояние до достижения НУtlet. 17 В приложениях , которые полагаются на связывание мишени биомолекулы, более длительное время для анализа может быть предпочтительным , поскольку он может увеличить долю связанных, помеченных видов до иммобилизации на слое захвата.
В заключение, мы представили способ изготовить трехмерных бумажных микрожидкостных устройств, которые поддерживают развитие иммуноанализа. Этот метод, который использует тип производства присадок для производства многослойных устройств, облегчает производство устройств в масштабе, который подходит для проведения лабораторных исследований. Протокол, описанный в этой рукописи специфичен для бумажных иммуноанализа устройств; Тем не менее, мы ожидаем, что процедуры, связанные с сборки этих иммунологические-восковой печати, структурирование клей, выравнивая слои, и ламинирование-будут легко расширяемый до многочисленных бумажных архитектур трехмерных микрожидкостных устройств. Понимание методологии изготовления может привестик разработке новых анализов точки оказания медицинской помощи с широким спектром применения в области здравоохранения, окружающей среды и сельского хозяйства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).
- Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).
- Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
- Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
- Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129 (2012).
- Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).
- Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).
- Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).
- Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).
- Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).
- Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).
- Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6 (5), e18940 (2011).
- Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).
- Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
- Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).
- Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).
- Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).
