Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

doi: 10.3791/55310 Published: July 16, 2017

Summary

Het artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen worden gecompenseerd voor gebruik bij het karakteriseren van beide totale lipiden en de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters.

Abstract

Microbiële gemeenschappen zijn belangrijke bestuurders en regelgevers van ecosysteemprocessen. Om te begrijpen hoe het beheer van ecosystemen microbiële gemeenschappen kan beïnvloeden, is een analyse van fosfolipide vetzuur (PLFA) een relatief precieze, maar inspannende intensieve techniek om microbiële samenleving te analyseren. PLFA is ontwikkeld om fosfolipide biomarkers te analyseren, die kan worden gebruikt als indicatoren van microbiële biomassa en de samenstelling van de brede functionele groepen schimmels en bacteriën. Het is meestal gebruikt om grondsoorten te vergelijken onder alternatieve plantengemeenschappen, ecologie en beheersregimes. De PLFA-methode blijkt gevoelig te zijn voor het opsporen van verschuivingen in de microbiële gemeenschapssamenstelling.

Een alternatieve methode, extractie en analyse van vetzuurmethylester (MIDI-FA) werd ontwikkeld voor snelle extractie van totale lipiden, zonder scheiding van de fosfolipidfractie, uit pure culturen als een microbiële identificatie techniek. Deze methode isSnel, maar is minder geschikt voor bodemmonsters omdat het een eerste stap ontbreekt die gronddeeltjes scheidt en in plaats daarvan begint met een verzepingstoestand die waarschijnlijk artefacten op de achtergrond organische stof in de bodem produceert.

Dit artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid worden gecompenseerd voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen voor gebruik bij het karakteriseren van zowel totale lipiden als de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters. De methode combineert de nauwkeurigheid die wordt bereikt door PLFA-profilering door het opvullen en concentreren van bodemlipiden als een eerste stap, en een vermindering van de inspanning door het organisch materiaal te extraheren en te verwerken met de MIDI-FA methode als tweede stap.

Introduction

Gezien de sleutelrol van micro-organismen in de voedingscyclus 1 , wijziging van plantengemeenschapssamenstelling 2 , regulering van plantproductiviteit 3 en decompositie van organische stof 4 , is het begrip van bodemmicrobiële gemeenschappen van vitaal belang om terrestrische ecosystemen te begrijpen.

Vanwege hun relatief hoge overvloed in bodem en hun chemische handtekening kunnen lipide biomarkers worden gebruikt om de dominante ecologische groepen te profileren die bodemmicrobiële gemeenschappen omvatten 5 . Door het kwantificeren van lipide biomarkers die kenmerkend zijn voor verschillende microbiële groepen, kunnen we de totale lipiden schatten en deze lipiden vervolgens scheiden in ecologisch relevante groepen, zoals Gram-positieve (Gm +) en Gram-negatieve (GM) bacteriën, arbusculaire mycorrhizale (AM) en saprotrofe Schimmels en actinomyceten 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Er zijn veel methoden om aspecten van microbiële gemeenschappen te karakteriseren. De PLFA-methode is een die algemeen gebruikt wordt om de basis microbiële gemeenschap structuur te begrijpen. Het is een effectieve manier om de relatieve overvloed aan microbiële groepen en totale microbiële biomassa te beoordelen. Door de snelle lipideverschakeling maakt PLFA-profilering ook relatief snelle detectie van veranderingen in de bodemmicrobiële gemeenschap mogelijk en geeft informatie die een vergelijking van de ecosysteemfunctie mogelijk maakt, bijvoorbeeld schimmel: bacterieverhoudingen om de voedingscyclus 1 , 9 , 10 te beoordelen . Echter, terwijl de PLFA-extractiemethode wordt geëerd en gerespecteerd, is het ook tijdrovend en leent het zich niet goed aan ecosysteem-schaalstudies die een groot aantal monsters van veldschaalreplicaten vereisenF "> 11 , 12 .

In tegenstelling hiermee kan de extractiemethode voor vetzuurmethylester (MIDI-FA) het mogelijk maken om snel door te voeren. Bij deze methode worden monsters gesaponeerd, geconverteerd naar FAMEs, geëxtraheerd en vervolgens geanalyseerd. De MIDI-FA methode is snel maar minder discriminerend dan PLFA, die de extractie van lipiden combineert met scheiding van verschillende lipidklasse 13 (fosfolipiden, neutrale lipiden en glycolipiden).

In dit protocol beschrijven we een methode die elementen combineert van zowel lipofilamenten als PLFA. Het maakt gebruik van extractie van lipiden met behulp van de initiële chloroform extractie stappen van de gemodificeerde Bligh en Dyer methode, en vervolgens verzeping en conversie naar FAMEs. Dit biedt een robuuste manier om microbiële gemeenschapsstructuur te detecteren, terwijl veel van het achtergrondgeluid uit niet-microbiële materialen 5 , 14 wordt uitgesloten 15 te analyseren. Door de initiële extractie uit te voeren en de organische oplosbare componenten ( bijv. Lipiden) te isoleren voordat MIDI-FA wordt uitgevoerd, en dit met een zuiveringsstap afronden, biedt het protocol een evenwicht tussen snelheid en precisie.

Protocol

OPMERKING: Draag altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) gedurende de hele procedure. Om potentiële monsterverontreiniging te vermijden, raakt u geen glaswerk met blote handen aan. Draag geschikte handschoenen bij het uitvoeren van protocolstappen die de behandeling van chloroform vereisen.

1. Voorbereidingen (2 dagen voor ~ 40 monsters)

  1. Verzamel grond in steriele zakken en vervoeren van het veld in een ijskoeler. Als het niet mogelijk is om verse grond onmiddellijk te sijpen en onmiddellijk te bevriezen, bewaart u de monsters in een -80 ° C diepvries totdat u klaar bent met de analyse.
  2. Bereid de grond door homogeniseren. Verwijder wortels en stenen en knip het door grof zeven ( bijv. 2 mm).
  3. Bereid u voor vriesdrogen door submonsters in een geschikte container volgens instructies van de handvries van de vriesdroger zo snel mogelijk te vriezen. Zodra de bodems zijn bevroren, bewaren ze in een afgesloten houder met droogmiddel tot extractie. Het is het beste om te sGescheurde bevroren grond op een minimum van -20 ° C, maar bij voorkeur bij -80 ° C.
  4. Ter voorbereiding op de extractie, verwijder bevroren gedroogde grondstoffen uit de opslag en maal tot een bloemachtige consistentie. Methoden voor het slijpen omvatten kogelmolen, kogelkoker en mortel en stamper. Bewaar in een diepvriezer na het slijpen (zie 1.3).
    OPMERKING: De hoeveelheid monster die wordt gebruikt voor extractie hangt af van het gehalte aan organische stoffen. Een algemene richtlijn is om 0,5 tot 1 g van een bodem te gebruiken die 12 tot 18 gew.% Koolstof is en 3 tot 5 g voor een bodem van 1 tot 3 gew.% Koolstof.
  5. Spoel 30 ml centrifugebuizen met hexaan af. Voeg ongeveer 2 tot 3 ml hexaan toe aan buizen en vortex gedurende 5 sec. Dek hexaan aan een andere buis en vortex. Hexaan (2 tot 3 ml) kan worden gebruikt om zes buizen serieel te spoelen. Houd de met hexaan gespoelde buizen om in de afzuigkap omgedraaid en verwijder tweedehands hexaan in een geschikte afvalbak.
  6. Wikkel de glaswerk in 2 tot 3 lagen aluminiumfolie en plaats in de muffeoven. Bakken(Muffle) glaswerk bij 450 ° C gedurende 4,5 uur.
  7. Reagens reageren.
    1. Voor de bodem hoeveelheid gebruikte chemicaliën toe te voegen in een 0,8: 1: 2 volumeverhouding op fosfaat-buffer (P-buffer): CHCl3: MeOH.
    2. Bereid P-bufferoplossing: Fosfaatbuffer: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Voeg 61 ml 1M K 2 HPO 4 voorraad toe, steriel (chemisch moet ACS gecertificeerd zijn of beter). Voeg 39 ml 1 M KH 2 PO 4 voorraad toe, steriel (chemisch moet ACS gecertificeerd zijn of beter). Vul tot 1000 ml met type 1 water. Pas de pH aan op 7,0 met NaOH of HC1. Bewaar ongebruikte oplossing voor maximaal 7 d bij omgevingstemperatuur of 30 dagen in de koelkast.
      2. Alternatief weeg 10,62 g K 2 HPO 4 en 5,31 g KH 2 PO 4 af ; Verdund tot 1 liter met type 1 water. Controleer de pH, pas indien nodig aan.
    3. Reagent 1, Saponificatie Reagens Repareer.
      1. Dispenseer 300 ml van type 1 water.Voeg 300 mL CH3OH (HPLC-kwaliteit of hoger). Voeg 90,00 g NaOH (gecertificeerd ACS of beter) toe. Voeg NaOH pellets toe aan de oplossing onder roeren. Roer tot de pellets oplossen. Het is aan te bevelen deze oplossing niet meer dan 30 d te bewaren.
    4. Reagent 2 opstellen, methyleringsreagens.
      1. Afzien 275 ml CH3OH (HPLC-kwaliteit of hoger). Voeg 325 ml gecertificeerd 6,00 N HCL bij roeren. Het is aan te bevelen deze oplossing niet meer dan 30 d te bewaren.
    5. Bereid Reagens 3, Extraction Reagent: 50% C 6H 14 (hexaan), 50% C 5 H 12 O (MTBE).
      1. Combineer 200 ml C 6 H 14 (HPLC-gehalte of hoger) en 200 ml C 5 H 12 O (HPLC-gehalte of hoger) in de afzuigkap. Goed mengen; Cap stevig. Bewaar in vlamkastenkast of afzuigkap voor maximaal 1 jaar.
    6. Reagent 4 opmaken, Reagens op basiswas reageren.
      1. Dispense 900Ml van type 1 water aan beker. Voeg 10,80 g NaOH (gecertificeerde ACS of beter) bij roeren toe. Roer tot de pellets oplossen. Het is aan te bevelen deze oplossing niet meer dan 30 d te bewaren.
    7. Bereid voorraadoplossing van de interne standaard op.
      1. Weeg 100 mg van 19: 0 EE-standaard af. Voeg toe aan 50 ml hexaan gespoeld volumetrische fles. Voeg ~ 15 ml Hexane-MTBE-oplossing (reagens 3) toe aan de fles, wervel om op te lossen. Boven 50 ml met Hexane-MTBE-oplossing (reagens 3). Cap en wervel om te mengen. Overbrengen naar hexaan gespoelde glazen buizen met PTFE gevoerde caps en opslaan bij -20 ° C.

2. DAG 1 - Extractie van vetzuren uit de grond (4 tot 5 uur voor ~ 40 monsters)

  1. Bereid drie 5 tot 10 ml afgiftepipetten voor P-buffer, chloroform en methanol.
    OPMERKING: Minder gevaarlijke alternatieven voor chloroform zijn voorgesteld als extractiemiddelen. Deze kunnen resulteren in equivalente lipide herstelwaarden 16 , 17 , maar worden niet geëvalueerd in dit protocol.
  2. Weeg gevriesdroogde bodems in 30 ml centrifugebuizen en registreer de bodemmassa.
  3. Maak twee spaties en sluit een checkstandaard in (een grond die eerder is geëxtraheerd).
  4. In de zuurkast, voeg de reagentia om de bodem van de centrifugebuis in de volgende volgorde: P-buffer, CHCl3 en MeOH (tabel 1). Laat de bodem na het toevoegen van de CHCl 3 na het toevoegen van de P-buffer nat worden. Cap de centrifuge buizen stevig en bedek om te beschermen tegen licht.
  5. Plaats ze op de schudder horizontaal en zorg ervoor dat ze goed beveiligd zijn. Met de snelheid instelling op 280 rpm, schud 1 uur 18 .
  6. Bereid twee 16 mm x 150 mm glazen buizen voor elk monster als volgt: Label de buis en voeg dezelfde hoeveelheid CHCI3 en een gelijk volume van P-buffer.
  7. Verwijder de centrifugebuizen uit de shaker en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.430Xg en 25 ° C. Fasescheiding moet zichtbaar zijn in de glazen buis.
  8. Dek de supernatant uit de centrifugebuis in een dampkoker in een van de buizen bereid in stap 2.6. Herhaal stappen 2.4 tot en met 2.5 en dek de supernatant in de tweede buis.
  9. Beveilig alle 16 mm × 150 mm glazen buizen met PTFE-beklede kapjes en draai invert 10 x om te mengen.
  10. Laat de monsters 's nachts ongestoord staan ​​om de twee fasen te scheiden. Om dit te doen, houd de monsters in een donkere kast / ruimte of bedekt met aluminiumfolie bij kamertemperatuur. Het is aanvaardbaar om de extracten in het weekend te laten scheiden.
    1. Als alternatief, als u direct naar de volgende stap wilt gaan, of als u de volgende dag verstoord raakt, centrifuge u de monsters gedurende 10 minuten bij 1.000 xg en 25 ° C.
      OPMERKING: Onderwerp alle monsters binnen een vergelijkingsgroep tot dezelfde fase van de scheiding van de fase.

3 DAGEN2 - Isolatie van lipiden (3 tot 4 uur voor ~ 40 monsters)

  1. Zet de verdampingsapparaat en de oplosmiddelafleider aan. Stel verdampingsapparaat op 33 ° C en voorverwarmen.
  2. Zuig een vacuüm aspirator in de kap: een zijarmkolf verbonden met een vacuümpomp, een lengte met hoge zuiverheidslang en een glazen pipet.
  3. Aspireer de bovenste laag en de interface (ongeveer 2/3 van de weg naar beneden) van de twee glazen buizen, houd de waterlaag vast. Herhaal het proces met een schoon pipet voor elk monster.
  4. Combineer de waterige extraktlagen van de tweede buis met die in de eerste buis door zorgvuldig af te decanteren. Zorg ervoor dat de buis die afvalt, vrij is van krassen of krassen.
  5. Zodra de CHCl 3 extracten zijn gecombineerd, controleer de vloeistof - het moet duidelijk zijn. Voeg MeOH niet toe totdat het duidelijk is.
  6. Droog alle monsters af met behulp van de vacuümverdampingsapparaat. Begin met instellingen van temperatuur 33 ° C, draaikolk snelheid 26% en druk 400 mbar.
  7. PKant de monsters in het verdampingssysteem en laat na 10 minuten de druk langzaam tot 350 mbar verlagen.
  8. Controleer de voortgang en wanneer het vloeistofniveau in de buis het niveau van het verwarmingsblok heeft bereikt, verlaag de druk naar 300 mbar.
  9. Controleer de hoogte van de resterende vloeistof en wanneer het ongeveer 1 cm diep is, verminder de druk tot 200 mbar.
  10. Nadat de monsters gedroogd zijn, verwijder u monsters en laat de pomp 10 minuten verder lopen om dampen te verwijderen.
  11. Pak de buizen stevig vast en houd de lipiden in een vriezer op -80 ° C.
  12. Verwijder de aangezogen vloeistof volgens de geldende chemische veiligheidsvoorschriften.

4. DAG 3 - Saponificatie en methylering (6 tot 7 uur voor ~ 40 monsters)

  1. Zet de waterbaden aan. Stel bad 1 tot 95 ° C en bad 2 tot 80 ° C.
  2. Stel de pipet dispensers in en zorg ervoor dat ze het juiste volume verdelen.
    Reagens 1: 1 ml per monster
    Reagens 2: 2 ml per monster
    Reagens 3: 1,25 ml per monster
    Reagens 4: 3 ml per monster
    OPMERKING: Het verwarmingsproces zal druk in de buis bouwen. Gebruik geen krassen, gebarsten of gescheurde buizen.
  3. Met behulp van een pipet dispenser voeg 1,0 ml Reagent 1 toe aan de gedroogde lipiden. Cap stevig, vortex voor 5 s en plaats in een rek.
  4. Plaats het rek van de monsterbuizen in het waterbad van 95 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het rek van buizen uit het bad en controleer de buizen voor lekken, aangegeven door bellen die in de buis stijgen. Houd de kapjes van lekkende buizen vast of vervang ze en controleer ze opnieuw op kraken of chips. Verhit de buizen in het waterbad gedurende nog 10 minuten.
  5. Verwijder monsters uit bad 1 en plaats in bad 2 (80 ° C) en voer de incubatie gedurende nog eens 15 minuten door.
  6. Verwijder de buizen en afkoel de monsters door het rack in een bak met kraanwater te plaatsen voor koeling.
  7. Voeg 2 ml Reagent 2 toe aan elk monster. Dop strak en vortex voor 5 tot 10s. Plaats het rek in het waterbad van 80 ° C en incubeer gedurende 10 minuten.
  8. Verwijder het rek van buizen uit het waterbad en plaats in een bakje kraanwater voor koeling. Roer het rek van buizen om het koelproces te versnellen.
    OPMERKING: Tijd en temperatuur niet overschrijden. Te veel verwarming kan FAMEs afbreken.
  9. Met behulp van de pipet dispenser voeg 1,25 ml Reagent 3 toe aan elke monsterbuis om de vetzuurmethylesters te extraheren. Doe de stekker stevig vast en zet de buizen op de shaker gedurende 10 minuten.
  10. Na het schudden, laat het rack van de buizen 10 minuten zitten, zodat de fasen kunnen scheiden. Breng de organische fase (bovenste laag) over op een glasbuis van 16 mm x 100 mm met een glazen pipet.
  11. Herhaal de extractie door Reagent 3 opnieuw toe te voegen, te schudden, fasen te scheiden en de bovenste fase over te dragen.
    OPMERKING Zet geen van de onderste fase over. Het is goed om een ​​kleine hoeveelheid topfase in de buis te verlaten.
  12. Met behulp van de pipet dispenser, voeg 3 ml Reagent 4 tot th toeE 16 mm x 100 mm buizen.
  13. Doe de proefbuizen stevig en vortex voor 20-30 s.
  14. Na vortexing centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.000 × g.
  15. Met een schone glazen pipet, aspireer de bovenste organische fase en overbrengen naar een 4- ml amber flesje.
  16. Zet de verdampingsapparaat en de oplosmiddelafleider aan. Stel de verdampingsinrichting op 30 ° C, de vortex snelheid tot 26%, het vacuüm tot 200 mbar, en druk voorverwarming.
  17. Monitor de voortgang. Nadat de monsters gedroogd zijn, verwijder u monsters en laat de pomp 10 minuten verder lopen om dampen te verwijderen.
  18. Verwijder pipet uit de reagensflessen 1 en 4 en pomp door middel van verdund zuur ( bijv. 1% HCl), gevolgd door DI water. Spoel de pipet die wordt gebruikt voor Reagent 2 door te pumpen via DI water. In het afzuigkap moet u het oplosmiddel van de pipet die Reagent 3 gebruikt, in een passende houder afvoeren en in de afzuigkap houden totdat de oplosmiddelresiduen zijn verdampt.
  19. Bewaar de pipetten omgekeerd, met de plunjer verwijderd om de klep te voorkomenG van de controleventielen.
  20. Gebruik eenmaal een glaspijp en doe dan een passende houder in.
  21. In de afzuigkap laten oplosmiddelresiduen op glaswerk om te verdampen.
  22. Spoel glaswerk met schoon water en wasmiddeloplossing.

5. DAG 4 - Voorbereiding van de werkoplossing en overdracht van FAMEs naar de GC-injectieflacons (2-3 uur voor ~ 40 monsters)

  1. Verzamel materialen: 4 ml amber flesjes met gedroogde monsters; Amber 2 ml GC flesjes; 400 μL platte bodem glazen inserts en caps; 500 μL glazen spuit; 50 ml volumetrische fles; Voorraadoplossing - Ethyleanadecanoaat (19: 0 EE interne standaard) in 50/50 hexaan / MTBE (Reagent 3).
  2. Met behulp van de glazen spuit, voeg 500 μL ethyl nonadecanoaat (19: 0 EE) voorraadoplossing toe aan een 50 ml volumetrische fles.
  3. Vulkolf in volumetrische score met Reagent 3.
  4. Cap fles en omgekeerde 5x om te mengen.
  5. Breng 3 ml over aan een schone 4 ml injectieflacon voor een werkoplossingsreservoir.
  6. Met behulp van thE glazen spuit, voeg 300 μL van de werkoplossing toe aan elk van de 4 ml flesjes die de gedroogde vetzuurmethylesters en pet bevatten.
  7. Vortex het monster gedurende 15 s en zet opzij om 15 minuten te staan.
  8. Met behulp van een glaspasteurpipet, zet de gesuspendeerde vetzuurmethylesters zorgvuldig over op een 2 ml GC-injectieflacon met de 400 μL insert.
  9. Bewaar verzegelde GC-injectieflacons in een -20 ° C vriezer voorafgaand aan de analyse.
  10. Stuur monsters voor GC analyse.
    OPMERKING: De analyse moet worden uitgevoerd met behulp van een specifieke GC-kolom en voorwaarden die worden beschreven in aanvullend bestand S1 . Het is best dat de GC-analyse binnen 2 weken na methylering wordt voltooid.

Representative Results

De data tabellen uit de rapporten kunnen worden verzameld in een spreadsheet of database. Na het aanpassen van de responsfactor (een correctiefactor die het antwoord voor verschillende ketenlengten normaliseert) kunnen piekgebieden worden vergeleken met het piekgebied van externe of interne normen om tot een concentratie in het extract te komen. Door te delen door de massa uitgetrokken grond, kunnen de gegevens worden uitgedrukt als massa FAME per gram grond of, door het molecuulgewicht van elke FAME te gebruiken, de meer algemeen gemelde nmol per gram grond. De som van microbiële FAME's is indicatief voor totale microbiële biomassa, en kan vergeleken worden onder behandelingen ( Figuur 1 ). Bepaalde FAME's kunnen ook worden geassocieerd met bepaalde microbiële groepen zoals Gram-positieve of Gram-negatieve bacteriën, actinomyceten, arbusculaire mycorrhizale schimmels en saprotrofe schimmels 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . Verhoudingen van de massa van specifieke biomarkers kunnen de relatieve overvloed van deze groepen weerspiegelen ( Figuur 2 ). De totale FAME-overvloedpatronen maken vingerafdrukken op de community-niveau, waardoor vergelijking van microbiologische gemeenschapsverschillen mogelijk is door middel van multivariate technieken zoals ordinatie ( figuur 3 ). In tegenstelling tot de meeste DNA-gebaseerde benaderingen kan lipidegegevens op gemeenschapsniveau zowel als relatieve of absolute overvloed worden geanalyseerd. Als de totale biomassa aanzienlijk verschilt tussen monsters, zullen deze twee benaderingen zeer verschillende resultaten geven; De ecologische vragen die aan het experiment liggen, moeten bepalen welke aanpak wordt gebruikt.

Figuur 1
F Iguur 1 : Totale FAME biomassa. Vergelijking van de totale biomassa Biomassa Biomassa (nmol g -1 bodem) van continue FAME-biomassa van continentale maïs, bevruchte prairie en niet-geperforeerde prairie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : FAME biomassa van bacteriën en schimmels. Behandeling vergelijking van biologische biologische biomassa (nmol g -1 grond) van bacteriële en schimmelvormige FAME-biomassa van continentale maïs, bevruchte prairie, en onbevruchte prairie. Zwam- en bacteriemassa uit absolute overvloed. Gemiddeld (som f / som b). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ve_content "voor: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 3
Figuur 3 : Niet-metrische dimensionale schaal van FAME lipide biomarkers. Vergelijking van de totale microbiële gemeenschap met behulp van absolute overvloed profielen van alle microbiologische FAME lipide biomarkers. In dit voorbeeld zijn permanente maïs- en onbevruchte prairiegemeenschappen gescheiden en zijn ze heel ver van elkaar, terwijl sommige bevruchte prairiemonsters microbiële gemeenschappen hebben die lijken op maïs, en andere lijken op de onbevruchte prairie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1: T h e zol t ven soort, evenre tie s toegevoegd g -1 bodem e n t h EIR orde r d e toe ITI o n. Dit is belangrijk voor de juiste extractie en scheiding van de organische en waterige fasen.

Discussion

Voor het onderzoek van meerdere monsters uit experimenten met veel replicaten en / of experimentele eenheden, kunnen onderzoekers fosfolipide vetzuuranalyse (PLFA) onvoldoende vinden in termen van tijd en materialen 25 . Met de PLFA-methode worden celmembraanfosfolipiden geëxtraheerd, gezuiverd en geïdentificeerd met gebruikmaking van de gemodificeerde Bligh en Dyer 26 tweefase waterige organische extractie. Dit wordt gevolgd door vaste fase silica chromatografie om lipiden door polariteit te scheiden en een alkalische methylering van fosfolipide vetzuren in vetzuurmethylesters. In PLFA kan profielen lipide opbrengst laag zijn maar met een zeer hoge zuiverheid. Microbiële ID introduceerde een alternatieve methode, de methyleester-methode van de vetzuur (MIDI-FA). In de MIDI-FA methode worden alle lipiden rechtstreeks geëxtraheerd uit pure culturen of grond- / sedimentmonsters 11 , 12 , 27 tot en metverzeping. Deze methode heeft een lager lipideverlies en is snel omdat het geen van de concentratie- of zuiveringsstappen van de PLFA-methode heeft. Hoewel de MIDI-FA methode snel en minder duur is, omdat het oorspronkelijk is ontworpen voor het identificeren van organismen in pure cultuur, zijn er geen initiële extractie- of zuiveringsstappen. Zo kan het lipide-achtige verbindingen omvatten die gecoëxtraheerd zijn uit bodem organisch materiaal dat de gemeenschapshandtekening 27 , 28 , 29 vervormt. Omdat deze opname ook biomassa-maatregelen kan vervormen, is MIDI-FA doorgaans alleen gebruikt om grondlipiden 13 grof kwalitatief te beschrijven.

De procedure die we hier beschrijven combineert het beste van de twee afzonderlijke extractieprocedures: 1) een extractie en concentratie van lipiden met behulp van de gemodificeerde methode Bligh and Dyer 26 , en 2) de vetzuurmethylester saPonificatie-, methylering-, extractie- en basiswasprocedure die commercieel is ontwikkeld. Deze methode is ontwikkeld om de voordelen van beide van deze protocollen te bereiken, terwijl de nadeel 15 tot een minimum wordt beperkt. Door de initiële extractie uit te voeren en de organische oplosbare componenten ( bijv. Lipiden) te isoleren voorafgaand aan het uitvoeren van MIDI-FA, en dit te voltooien met een zuiveringsstap, biedt dit protocol een evenwicht tussen snelheid en precisie. Hoewel deze methode mogelijk niet geschikt is wanneer hoge zuiverheid vereist is (dat wil zeggen bij 13 C PLFA analyse) of bij het analyseren van fosfolipiden en neutrale lipiden afzonderlijk, kan het in veel gevallen het detecteren van microbiële gemeenschapsreacties op milieuomstandigheden met grotere gevoeligheid dan DNA-gebaseerd Methoden 30 , 31 , 32 , 33 . Membraanlipiden ontleden snel na de dood van de cel waardoor ze kunnenWeerspiegelen de levende microbiële gemeenschap ten tijde van steekproefneming 5 , 7 , in tegenstelling tot milieu-DNA waarin veel van de informatie afkomstig is van dode of inactieve organismen 34 . Gezien het hoge dormiteitsniveau tussen bodemmicro-organismen 35 , kan de karakterisering van levende biomassa worden gebruikt om temporele plant-microbe-interacties op een relatief fijne temporale schaal te begrijpen en lipidbiomarkers kunnen gebruikt worden om de fysiologische status van de microbiële gemeenschap te beoordelen 7 . Er is gebleken dat hoge doorvoermethoden nodig zijn om microbiële respons in grote veldinstellingen 25 te beoordelen en terwijl de methode die we hier voorstellen niet de nauwkeurigheid van PLFA biomarkerprofielen repliceert, verhoogt het de doorvoer, terwijl de variabiliteit die met de MIDI-FA gerealiseerd wordt, worden beperkt procedure. De methode is bewezen een effectief hulpmiddel bij het aanpakkenVragen over microbiële gemeenschapsdynamiek op een breed scala aan gronden in grootschalige landbouw- en ecosysteemstudies 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .

Lipid klassen worden gecombineerd met deze methode en er kan een verlies van de informatie in die afzonderlijke klassen 22 , 39 zijn , maar het combineren van de lipideclassen kan de kracht versterken om de arbusculaire mycorrhizale schimmels herkenning van de 16: 1 co5c van beide fosfo - en neutrale lipiden 40 . Bovendien, terwijl tHet aantal onbekende vetzuren (die afkomstig is van niet-levend organisch materiaal) kan bij deze methode hoger zijn, het bleek lager te zijn dan MIDI-FA en zorgt voor een vergelijking van de lipidenprofielen van de behandeling bij studies met veel monsters waarbij het monster Doorvoercapaciteit is een zorg 15 . De neutrale fractie wordt meestal geacht hoofdzakelijk afkomstig te zijn van opslaglipiden die door schimmels worden geproduceerd, hoewel er ook een kleinere bijdrage kan leveren uit de bodem fauna 41 . In dit licht kan de hier beschreven werkwijze resultaten opleveren die een grotere bijdrage van de schimmellipiden 18: 2 co 6,9c en 18: 1 co 9c tonen dan PLFA. De andere lipiden die in de neutrale fractie voorkomen zijn enkele van de verzadigde vetzuren, bijv. 16: 0, 18: 0, 20: 0.

Er zijn verschillende manieren waarop lipide data uitgedrukt en geanalyseerd kunnen worden. De meest voorkomende voorstellingen zijn overvloed (nmol g -1 grond), mole fractioN (nmol individuele lipide nmol -1 totale lipide) en molprocent (molfractie * 100). Normaliseerd door de totale lipiden in een monster, molfractie en molprocent zijn maatregelen van de relatieve overvloed van een gegeven lipide. Na een geschikte transformatie, bijvoorbeeld , arcsine vierkantswortel, molefractie is geschikt voor gebruik in analyse door hoofdcomponenten of redundantieanalyse-coördinatie. Overvloed is de absolute hoeveelheid van een gegeven lipide geëxtraheerd per gram grond. Omdat de hoeveelheid lipide per cel redelijk constant is en de lipidextractie zeer efficiënt en uitgebreid is, is totale overvloed een goede schatting van de totale lipiden en het overvloed aan sleutelindicatoren weerspiegelt de biomassa van de ecologische groep die het vertegenwoordigt 17 . Tenslotte is een goede manier om naar de microbiële gemeenschapssamenstelling te kijken, gebruik te maken van multivariate analysemethoden 16 , bijvoorbeeld ordeningsmethoden zoals nonmetrische multidimensionale schaling (NMDS -Die geen data transformatie nodig heeft) of principe componenten analyse (PCA), kan nuttig zijn voor het vergelijken van de relatieve overvloed van alle lipide biomarkers.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd door het DOE Great Lakes Bioenergie Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) en DOE OBP Office of Energy Efficiency and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). De auteurs willen Anders Gurda graag erkennen voor zijn geduldige en bekwame bijdrage aan videografie en editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11, (3), 296-310 (2008).
  2. Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25, (8), 468-478 (2010).
  3. Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36, (2), 137-144 (2013).
  4. Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66, (1), 145-157 (2013).
  6. van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363, (1-2), 1-5 (2013).
  7. Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69, (5), 1412-1421 (2005).
  8. Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81, (1-4), 509-520 (2002).
  9. Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22, (3), 261-264 (1996).
  10. Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43, (8), 1621-1625 (2011).
  11. Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60, (7), 2483-2493 (1994).
  12. Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. Forthcoming (2017).
  16. Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55, (11), 2888-2893 (1989).
  17. Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118, (6), 1251-1263 (2015).
  18. Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
  19. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24, (4), 317-323 (1992).
  20. Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59, (11), 3605-3617 (1993).
  21. Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24, (3), 365-374 (1986).
  22. Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39, (8), 535-541 (1989).
  23. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. 299-488 (1988).
  24. Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37, (3), 601-604 (2005).
  25. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  26. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  27. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64, (5), 1659-1668 (2000).
  28. Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  29. Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  30. Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  31. Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  32. Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43, (10), 2184-2193 (2011).
  33. Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49, (2), 191-205 (2004).
  34. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53, (9), 1689-1699 (2013).
  35. Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9, (2), 119-130 (2011).
  36. Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  37. Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  38. Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  39. Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45, (4), 373-383 (2003).
  40. Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
  41. Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  42. Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  43. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2, (2), 131-137 (2011).
  44. Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9, (12), 1-14 (2014).
  45. Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87, (3), 570-579 (2006).
  46. Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39, (2), 517-525 (2007).
  47. Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284, (1-2), 85-100 (2006).
  48. Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40, (10), 2699-2702 (2008).
  49. Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7, (1), 27-49 (2005).
  50. Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).
Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter