Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En lipidekstraktions- og analysemetode til karakterisering af jordmikrober i forsøg med mange prøver

doi: 10.3791/55310 Published: July 16, 2017

Summary

Artiklen beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse ved karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver.

Abstract

Mikrobielle samfund er vigtige drivere og regulatorer af økosystemprocesser. For at forstå, hvordan forvaltningen af ​​økosystemer kan påvirke mikrobielle samfund, er en relativt præcis, men indsatsintensiv teknik til at analysere mikrobiell samfundsammensætning, phospholipidfedtsyre (PLFA) analyse. PLFA blev udviklet til analyse af fosfolipidbiomarkører, som kan bruges som indikatorer for mikrobiell biomasse og sammensætningen af ​​brede funktionelle grupper af svampe og bakterier. Det har almindeligvis været brugt til at sammenligne jordarter under alternative plantesamfund, økologi og forvaltningsregimer. PLFA-metoden har vist sig at være følsom overfor detektering af forskydninger i mikrobielle fællesskabssammensætninger.

En alternativ metode, udvinding og analyse af fedtsyremethylester (MIDI-FA) blev udviklet til hurtig udvinding af totale lipider uden separation af phospholipidfraktionen fra rene kulturer som en mikrobiel identifikationsteknik. Denne metode erHurtig, men er mindre egnet til jordprøver, fordi den mangler et indledende trin, der adskiller jordpartikler og begynder i stedet med en forsæbningsreaktion, der sandsynligvis producerer artefakter fra baggrunden organisk stof i jorden.

Denne artikel beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse til karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver. Metoden kombinerer nøjagtigheden opnået ved PLFA profilering ved at ekstrahere og koncentrere jordlipider som et første trin og en reduktion i indsatsen ved at forsæbe det organiske materiale ekstraheret og behandle med MIDI-FA-metoden som et andet trin.

Introduction

I lyset af mikroorganismernes nøglerolle i næringscyklus 1 , modifikation af plantesammensætning 2 , regulering af planteproduktivitet 3 og nedbrydning af organisk materiale 4 er forståelse af jordmiljøsamfundene afgørende for at forstå jordbaserede økosystemer.

På grund af deres relativt store overflod i jorden og deres kemiske signatur kan lipidbiomarkører anvendes til profilering af de dominerende økologiske grupper omfattende jordmikrobielle samfund 5 . Ved at kvantificere lipidbiomarkører, som er karakteristiske for forskellige mikrobielle grupper, kan vi estimere totale lipider og derefter adskille disse lipider i økologisk relevante grupper, såsom Gram-positive (Gm +) og Gram-negative (Gm) bakterier, arbuscular mycorrhizal (AM) og saprotrofe Svampe og actinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Der er mange metoder til at karakterisere aspekter af mikrobielle samfund. PLFA-metoden er en almindeligvis brugt til at forstå grundlæggende mikrobielle samfundsstruktur. Det er en effektiv måde at vurdere den relative overflod af mikrobielle grupper samt total mikrobiell biomasse. På grund af den hurtige lipidomsætning giver PLFA-profilering også relativt hurtig detektion af ændringer i jordmikrobiell samfund og giver information, der muliggør sammenligning af økosystemfunktionen, f.eks. Svampe: bakterieforhold for at bedømme satsen for næringscyklus 1 , 9 , 10 . Selvom PLFA-ekstraktionsmetoden er hædret og respekteret, er den imidlertid også tidskrævende og lænner sig ikke godt til økosystemskalaundersøgelser, der kræver et stort antal prøver fra feltskalaereplikaterF "> 11 , 12 .

I modsætning hertil har fedtsyre-methylesterekstraktionsmetoden (MIDI-FA) potentialet til at muliggøre hurtig gennemstrømning. I denne metode forsegles prøverne, konverteres til FAME'er, ekstraheres og analyseres derefter. MIDI-FA-metoden er hurtig, men mindre diskriminerende end PLFA, som kombinerer ekstraktion af lipider med adskillelse af forskellige lipidklasser 13 (fosfolipider, neutrale lipider og glycolipider).

I denne protokol beskriver vi en metode, der kombinerer elementer af både PLFA og MIDI-FA lipid profilering. Den anvender ekstraktion af lipider under anvendelse af de oprindelige chloroformekstraktionstrin af den modificerede Bligh og Dyer-metode og derefter forsæbning og omdannelse til FAME'er. Dette giver en robust måde at registrere mikrobiel samfundsstruktur, mens der udelukkes meget af baggrundsstøj fra ikke-mikrobielt materiale 5 , 14 15 . Ved at udføre den oprindelige udvinding og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA, og udførelse af dette med et oprensningstrin, giver protokollen en balance mellem hastighed og præcision.

Protocol

BEMÆRK: Brug altid passende personlige værnemidler (PPE) under hele proceduren. For at undgå potentiel prøveforurening må du ikke røre glasvarer med bare hænder. Brug egnede handsker, når du kører protokolstrin, der kræver håndtering af chloroform.

1. Forberedelser (2 dage for ~ 40 prøver)

  1. Saml jord i sterile poser og transporter fra feltet i en køler indeholdende is. Hvis det ikke er muligt at sive frisk jord og fryse tørre straks, opbevar prøverne i en fryser på -80 ° C, indtil de er klar til at starte analysen.
  2. Forbered jorden ved homogenisering. Fjern rødder og sten og knæk klumper ved grov sigtning ( f.eks. 2 mm).
  3. Forbered dig på frysetørring ved at sætte delprøver i en passende beholder efter instruktioner fra frysetørrerens håndbog og frys så hurtigt som muligt. Når jord er frysetørret, opbevares i en lukket beholder med tørremiddel til ekstraktion. Det er bedst at sRevet frysetørret jord i mindst -20 ° C, men fortrinsvis ved -80 ° C.
  4. Som forberedelse til ekstraktion fjernes frysetørrede jordarter fra opbevaring og slibes til en mellignende konsistens. Metoder til slibning omfatter kuglemølle, kuglerør, morter og pistle. Opbevar i en fryser efter slipning (se 1.3).
    BEMÆRK: Mængden af ​​prøve anvendt til udvinding afhænger af indholdet af organisk stof. En generel retningslinje er at anvende 0,5 til 1 g af en jord, der er 12 til 18 vægtprocent kulstof og 3 til 5 g for en jord 1 til 3 vægtprocent kulstof.
  5. Skyl 30 ml centrifugerør med hexan. Tilsæt ca. 2 til 3 ml hexan til rør og hvirvel i 5 sek. Dekanter hexan til et andet rør og hvirvel. Hexan (2 til 3 ml) kan anvendes til seriel skylning af seks rør. Opbevar hexanskylede rør, der er omvendt i spændhætten, og kassér brugt hexan i en passende affaldsbeholder.
  6. Wrap glasvarer i 2 til 3 lag aluminiumsfolie og placere i muffelovnen. Bage(Muffle) glasvarer ved 450 ° C i 4,5 timer.
  7. Forbered reagenser.
    1. For jordbunden anvendte mængde tilsættes kemikalier i en 0,8: 1: 2 volumenforhold for phosphat-puffer (P-puffer): CHCl3: MeOH.
    2. Forbered P-bufferopløsning: Fosfatbuffer: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Tilsæt 61 ml 1M K 2 HPO 4 lager, steril (kemikalie skal være ACS-certificeret klasse eller bedre). Tilsæt 39 ml 1 M KH 2 PO 4 lager, steril (kemikalie skal være ACS-certificeret eller bedre). Fyld til 1000 ml med type 1 vand. Juster pH til 7,0 med NaOH eller HCI. Opbevar ubrugt opløsning i op til 7 d ved omgivelsestemperatur eller 30 dage i køleskab.
      2. Alternativt afvejes 10,62 g K 2 HPO 4 og 5,31 g KH 2PO 4; Fortyndes til 1 liter med type 1 vand. Kontroller pH, juster om nødvendigt.
    3. Forbered reagens 1, forsæbningsreagens.
      1. Dispense 300 ml Type 1 vand.Tilsæt 300 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller højere). Tilsæt 90,00 g NaOH (certificeret ACS eller bedre). Tilsæt NaOH pellets til opløsningen under omrøring. Rør til pellets opløses. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d.
    4. Fremstillingsreagens 2, methyleringsreagens.
      1. Dispensere 275 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller højere). Tilsæt 325 ml certificeret 6,00 N HCL under omrøring. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d.
    5. Forberede Reagens 3, Ekstraktionsreagens: 50% C 6 H 14 (hexan), 50% C5H 12 O (MTBE).
      1. I dampdækslet kombineres 200 ml C 6 H 14 (HPLC-kvalitet eller højere) og 200 ml C 5 H 12 O (HPLC-kvalitet eller højere). Bland godt Hætte tæt. Opbevares i brændeovnsskabsskab eller dampkåle i højst 1 år.
    6. Klargør reagens 4, basiskvas reagens.
      1. Dispense 900Ml Type 1-vand til bægerglas. Tilsæt 10,80 g NaOH (Certified ACS eller bedre) under omrøring. Rør til pellets opløses. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d.
    7. Forbered stamopløsning af intern standard.
      1. Udvej 100 mg 19: 0 EE standard. Tilsæt til 50 ml hexanskylet volumetrisk kolbe. Tilsæt ~ 15 ml hexan-MTBE-opløsning (reagens 3) til kolben, hvirvel til opløsning. Top til 50 ml med Hexane-MTBE-opløsning (reagens 3). Hætte og hvirvel til at blande. Overfør til hexanskylede glasrør med PTFE-liner og opbevar ved -20 ° C.

2. DAG 1 - Ekstraktion af fedtsyrer fra jord (4 til 5 timer for ~ 40 prøver)

  1. Tilbered tre 5 til 10 ml dispenseringspipetter til P-buffer, chloroform og methanol.
    BEMÆRK: Mindre farlige alternativer til chloroform er blevet foreslået som ekstraktionsmidler. Disse kan resultere i ækvivalente lipidudvindingshastigheder 16 , 17 , men evalueres ikke i denne protokol.
  2. Vægfrysetørret jord i 30 ml centrifugerør og optag jordmasse.
  3. Lav to emner og inkludere en checkstandard (en jord, der tidligere er blevet ekstraheret).
  4. I stinkskabet, tilføje reagenserne til jorden, i centrifugeglasset i følgende rækkefølge: P-buffer, CHCl3 og MeOH (tabel 1). Tillade jordbund tid til at væde efter P-buffer tilsætning før tilsætning af CHCl3. Cap centrifugerørene tæt og dæksel for at beskytte mod lys.
  5. Placer dem på rysteren vandret og sørg for at de er godt sikrede. Med hastighedsindstillingen på 280 omdr./min., Rystes i 1 time 18 .
  6. Forberede to 16 mm x 150 mm glasrør for hver prøve som følger: Etiket røret og tilføje det samme volumen CHCl3 og et lige volumen af P-buffer.
  7. Fjern centrifugerørene fra rysteren og centrifuger i 10 minutter ved 1.430Xg og 25 ° C. Faseseparation skal være synlig i glasrøret.
  8. I stekskabet dekanteres supernatanten fra centrifugerøret til et af rørene fremstillet i trin 2.6. Gentag trin 2.4 til 2.5 og dekanter supernatanten i det andet rør.
  9. Sikkert tag alle 16 mm × 150 mm glasrør med PTFE-liner og omvendt 10 x til at blande.
  10. Tillad prøverne at stå uforstyrret natten over for at afslutte adskillelsen af ​​de to faser. For at gøre dette skal du holde prøverne i et mørkt skab / rum eller dækket af aluminiumsfolie ved stuetemperatur. Det er acceptabelt at tillade ekstrakterne at udskille i weekenden.
    1. Alternativt, hvis man ønsker at flytte direkte til næste trin, eller hvis prøver bliver forstyrret næste dag, centrifuger prøver i 10 minutter ved 1.000 xg og 25 ° C.
      BEMÆRK: Underkast alle prøver i en sammenligningsgruppe til den samme faseseparationstid.

3. DAG2 - Isolering af lipider (3 til 4 timer for ~ 40 prøver)

  1. Tænd fordamperapparat og opløsningsmiddelfælde. Indstil fordampningsapparat til 33 ° C og forvarme.
  2. Anbring en vakuumsuger i emhætten: en sidearmkolbe forbundet til en vakuumpumpe, en længde af høj renhedsrør og en glaspipet.
  3. Aspirer toplaget og grænsefladen (ca. 2/3 af vejen ned) af de to glasrør, og hold det vandige lag. Gentag processen ved hjælp af en ren pipette til hver prøve.
  4. Kombiner de vandige lag af ekstrakt fra det andet rør med det i det første rør ved omhyggeligt dekantering. Sørg for, at røret skal dekanteres, er fri for ridser eller revner.
  5. Når CHCl 3 ekstrakterne er kombineret, skal du kontrollere væsken - det skal være klart. Hvis ikke tilsættes MeOH indtil klar.
  6. Tør alle prøverne tørre ved hjælp af vakuuminddampningsapparatet. Start med indstillinger af temperatur 33 ° C, hvirvelhastighed 26% og tryk 400 mbar.
  7. PBlonder prøverne i fordampningssystemet og efter 10 min sænker trykket langsomt til 350 mbar.
  8. Overvåg fremskridtet, og når væskeniveauet i røret har nået niveauet af varmeblokken, sænk trykket til 300 mbar.
  9. Fortsæt med at overvåge højden af ​​den resterende væske, og når den er ca. 1 cm i dybden, sænk trykket til 200 mbar.
  10. Efter prøver har tørret, fjern prøver og kør pumpen i 10 ekstra minutter for at fjerne dampe.
  11. Tæt rørene tæt og opbevar lipiderne i en fryser ved -80 ° C.
  12. Bortskaf væsken i overensstemmelse med gældende kemiske sikkerhedsforskrifter.

4. DAG 3 - Forsæbning og methylering (6 til 7 timer for ~ 40 prøver)

  1. Tænd vandbadene. Indstil bad 1 til 95 ° C og bad 2 til 80 ° C.
  2. Indstil pipetternes dispensere og sørg for, at de udleverer det korrekte volumen.
    Reagens 1: 1 ml pr. Prøve
    Reagens 2: 2 ml pr. Prøve
    Reagens 3: 1,25 ml pr. Prøve
    Reagens 4: 3 ml pr. Prøve
    BEMÆRK: Opvarmningen vil skabe tryk i røret. Brug ikke ridsede, revnede eller skårne rør.
  3. Brug en pipette dispenser tilsæt 1,0 ml reagens 1 til de tørrede lipider. Hætte tæt, hvirvel i 5 s og læg i et stativ.
  4. Placer stativprøverørene i 95 ° C vandbad i 5 minutter. Fjern stativrørene fra badet og kontroller rørene for lækager, der er angivet med bobler, der stiger i røret. Ret ud eller udskift hætten på lækkende rør, og kontroller igen for revner eller chips. Fortsæt opvarmning af rørene i vandbadet i yderligere 10 minutter.
  5. Fjern prøver fra bad 1 og anbring i bad 2 (80 ° C) og fortsæt inkubationen i yderligere 15 min.
  6. Fjern rørene og afkølet prøverne ved at placere stativet i en pande med ledningsvand til afkøling.
  7. Tilsæt 2 ml reagens 2 til hver prøve. Cap tæt og hvirvel i 5 til 10s. Anbring stativet i 80 ° C vandbad og inkuber i 10 minutter.
  8. Fjern stativrørene fra vandbadet og sat i en pande af ledningsvand til afkøling. Ryst rørene for at accelerere køleprocessen.
    BEMÆRK: Overgå ikke tid og temperatur. For meget opvarmning kan nedbryde FAMEs.
  9. Ved anvendelse af pipette-dispenseren tilsættes 1,25 ml reagens 3 til hvert prøverør for at ekstrahere fedtsyremethylesterne. Hætte tæt på og læg rørene på rysteren i 10 minutter.
  10. Efter rystning, lad rørstativet sidde i 10 minutter, så faserne kan adskilles. Overfør den organiske fase (øverste lag) til et 16 mm x 100 mm glasrør med en glaspipette.
  11. Gentag ekstraktionen ved igen at tilføje reagens 3, rystes, så faser adskilles og overførsel af topfasen.
    BEMÆRK Overfør ikke nogen af ​​bundfasen. Det er fint at efterlade en lille smule topfase i røret.
  12. Brug pipette dispenser, tilsæt 3 ml reagens 4 til thE 16 mm x 100 mm rør.
  13. Tæt rørene tæt og hvirvel i 20-30 s.
  14. Efter vortexing, centrifuger i 3 minutter ved 1000 × g.
  15. Ved hjælp af en ren glaspipette, aspirere den øverste organiske fase og overfør til et 4 ml amber hætteglas.
  16. Tænd fordamperapparat og opløsningsmiddelfælde. Indstil fordampningsapparat til 30 ° C, hvirvelhastigheden til 26%, vakuumet til 200 mbar og tryk forvarmning.
  17. Overvåg fremskridtene. Efter prøver har tørret, fjern prøver og kør pumpen i 10 ekstra minutter for at fjerne dampe.
  18. Fjern pipetten fra reagensflaskerne 1 og 4 og pump gennem en fortyndet syre ( fx 1% HCI) efterfulgt af DI-vand. Skyl pipetten, der anvendes til reagens 2, ved at pumpe gennem DI vand. I emhætten drænes opløsningsmidlet fra pipetten, der anvendes til reagens 3, i en passende beholder og opbevares i hætten, indtil opløsningsmiddelresterne er fordampet.
  19. Opbevar pipetterne omvendt, med stifterne fjernet for at forhindre klæbningG af kontrolventilerne.
  20. Brug glaspiperne en gang og kast derefter i en passende beholder.
  21. I emhætten skal opløsningsmiddelrester på glasvarer inddampes.
  22. Skyl glasvarer med rent vand og vaskemiddelopløsning.

5. DAG 4 - Forberedelse af arbejdsløsningen og overførsel af FAMEs til GC-hætteglasene (2-3 timer for ~ 40 prøver)

  1. Saml materialer: 4 ml gule hætteglas med tørrede prøver; Gule 2 ml GC hætteglas; 400 μL fladbundne glasindsatser og hætter; 500 μL glas sprøjte; 50 ml volumetrisk kolbe; Stamopløsning - Ethyl-nonadecanoat (19: 0 EE intern standard) i 50/50 hexan / MTBE (reagens 3).
  2. Ved hjælp af glassprøjten tilsættes 500 μl ethyl nonadecanoat (19: 0 EE) stamopløsning til en 50 ml volumenkolbe.
  3. Fyld kolben til volumetrisk score med reagens 3.
  4. Cap kolbe og inverter 5x for at blande.
  5. Overfør 3 ml til et rent 4 ml hætteglas til et arbejdsløsningsreservoir.
  6. Brug af thE glas sprøjte, tilsættes 300 μL af arbejdsløsningen til hver af de 4 ml hætteglas indeholdende de tørrede fedtsyremethylestere og hætte.
  7. Vortex prøven i 15 s og sæt til side for at stå i 15 min.
  8. Brug en glas Pasteur pipette, overfør forsigtigt de suspenderede fedtsyre methylestere til et 2 ml GC hætteglas indeholdende 400 μL indsatsen.
  9. Opbevar forseglede GC-hætteglas i en -20 ° C fryser forud for analyse.
  10. Indsend prøver til GC analyse.
    BEMÆRK: Analysen skal udføres ved hjælp af en specifik GC-søjle og betingelser, der er beskrevet i Supplerende fil S1 . Det er bedst at GC-analysen udføres inden for 2 uger efter methylering.

Representative Results

Datatabellerne fra rapporterne kan samles i et regneark eller en database. Efter justering for responsfaktor (en korrektionsfaktor, der normaliserer svaret for forskellige kædelængder) kan topområder sammenlignes med toppunktet for eksterne eller interne standarder for at nå frem til en koncentration i ekstraktet. Ved at dividere gennem massen af ​​udvundet jord, kan dataene udtrykkes som masse FAME pr. Gram jord eller ved at anvende molekylvægten af ​​hver FAME den mere almindeligt rapporterede nmol pr. Gram jord. Summen af ​​mikrobielle FAMEs er indikativ for total mikrobiell biomasse og kan sammenlignes mellem behandlinger ( Figur 1 ). Visse FAME'er kan også være forbundet med bestemte mikrobielle grupper såsom Gram-positive eller Gram-negative bakterier, actinomycetes, arbuscular mycorrhizal svampe og saprotrofe svampe 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . Forholdet mellem massen af ​​specifikke biomarkører kan afspejle den relative overflod af disse grupper ( figur 2 ). Overordnede FAME overflodmønstre skaber fingeraftryk på fællesskabsniveau, hvilket muliggør sammenligning af mikrobiell samfundsforskellighed gennem multivariate teknikker som ordinering ( figur 3 ). I modsætning til de fleste DNA-baserede fremgangsmåder kan lipiddata på lokalt niveau analyseres enten som relative eller absolutte overflod. Hvis den samlede biomasse afviger væsentligt blandt prøver, vil disse to fremgangsmåder give meget forskellige resultater; De økologiske spørgsmål, der ligger til grund for eksperimentet, bør bestemme hvilken tilgang der anvendes.

figur 1
F Igure 1 : Total FAME biomasse. Sammenligning af total FAME biomarkørbiomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig majs, befrugtet prairie og upræget prairie. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2 : FAME biomasse af bakterier og svampe. Behandling sammenligning af bakteriel og fungal FAME biomarkør biomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig majs, befrugtede prairie og unfertilized prairie.Fungal og bakteriemasse fra absolut overflod. Gennemsnitlig (sum f / sum b). Klik her for at se en større version af denne figur.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3 : Ikke-metrisk dimensional skalering af FAME lipidbiomarkører. Sammenligning af det overordnede mikrobielle samfund ved brug af absolutte overflodprofiler af alle mikrobielle FAME lipidbiomarkører. I dette eksempel adskilles kontinuerlige majs- og ubefrugtede prairie-fællesskaber og er meget langt fra hinanden, mens nogle befrugtede prairieprøver har mikrobielle samfund, der ligner dem fra majs, og andre ligner de ikke-præparerede prærie. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1
Tabel 1: Th e l elv t typen, stå i ti s tilsat g -1 jord, en d t h EIR Orde r o f tilføje iti o n. Dette er vigtigt for korrekt udvinding og adskillelse af de organiske og vandige faser.

Discussion

Til undersøgelse af flere prøver fra eksperimenter med mange replikater og / eller eksperimentelle enheder kan forskere finde fosfolipid fedtsyreanalyse (PLFA) for at være uoverkommelige hvad angår tid og materialer 25 . Ved PLFA-metoden ekstraheres cellemembranfosfolipiderne, oprenses og identificeres ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26 -faser med to fase vandig organisk ekstraktion. Dette efterfølges af fastfase silicakromatografi til separering af lipider ved polaritet og en alkalisk methylering af phospholipid fedtsyrer i fedtsyremethylestere. I PLFA kan profilering lipidudbytte være lavt, men af ​​meget høj renhed. Microbial ID introducerede en alternativ metode, fedtsyremethylesterproceduren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden er alle lipider ekstraheret direkte fra rene kulturer eller jord / sedimentprøver 11 , 12 , 27 til og medforsæbning. Denne metode har lavere lipidtab og er hurtig, fordi den ikke har nogen af ​​koncentrations- eller oprensningstrinnene i PLFA-metoden. Selvom MIDI-FA-metoden er hurtig og billigere, fordi den oprindelig var designet til at identificere organismer i ren kultur, er der ingen indledende ekstraktions- eller oprensningstrin. Det kan således indbefatte lipidlignende forbindelser co-ekstraheret fra organisk stof i jorden, der forvrider fællesskabsunderskriften 27 , 28 , 29 . Fordi denne inddragelse også kan fordreje biomasseforanstaltninger, har MIDI-FA typisk kun været brugt til groft kvalitativt at beskrive jordlipider 13 .

Fremgangsmåden, som vi beskriver her, kombinerer det bedste fra de to separate ekstraktionsprocedurer: 1) en ekstraktion og koncentration af lipider ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26- metode og 2) fedtsyremethylesterenPonificerings-, methylerings-, ekstraktions- og basisvaskprocedure udviklet kommercielt. Denne metode blev udviklet for at opnå fordelene ved begge disse protokoller, samtidig med at ulemperne 15 minimeres. Ved at udføre den oprindelige ekstraktion og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA og afslutte dette med et oprensningstrin, giver denne protokol en balance mellem hastighed og præcision. Selv om denne metode måske ikke er egnet, når der kræves høj renhed ( dvs. til 13 C PLFA analyse) eller ved analyse af phospholipider og neutrale lipider separat, muliggør det i mange tilfælde detektion af mikrobielle samfundsmæssige reaktioner på miljøforhold med større følsomhed end DNA-baseret Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider nedbrydes hurtigt efter celledød, der tillader dem atAfspejle det levende mikrobielle samfund på tidspunktet for prøveudtagning 5 , 7 i modsætning til miljø-DNA, hvor meget af informationen kommer fra døde eller inaktive organismer 34 . På grund af den høje dormitetsgrad, der observeres blandt jordmikroorganismer 35 , kan karakteriseringen af ​​levende biomasse anvendes til at forstå tidsmæssige plante-mikrobe-interaktioner i en relativt fin temporal skala, og lipidbiomarkører kan anvendes til at analysere mikrobielle samfunds fysiologiske status 7 . Det har vist sig, at høje gennemløbsmetoder er nødvendige for at vurdere mikrobiel respons i store feltindstillinger 25 , og mens den metode, vi foreslår her, ikke replikerer nøjagtigheden af ​​PLFA-biomarkørprofilering, øges gennemstrømningen, samtidig med at variabiliteten realiseres med MIDI-FA procedure. Metoden har vist sig at være et effektivt redskab til adresseringSpørgsmål relateret til mikrobiell samfundsdynamik på en bred vifte af jordbund i store landbrugs- og økosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .

Lipid klasser kombineres med denne metode, og der kan være tab af informationen indeholdt i disse separate klasser 22 , 39 , men at kombinere lipidklasserne kan styrke kraften til at detektere arbuscular mycorrhizal svampes oprindelse af 16: 1 co5c fra begge phospho - og neutrale lipider 40 . Hertil kommer, at mens tAntallet af ukendte fedtsyrer (som kan stamme fra ikke-levende organisk stof) kan være højere ved denne metode. Det viste sig at være lavere end MIDI-FA og muliggør sammenligning af lipidprofiler fra forsøg med undersøgelser med mange prøver, hvor prøve Gennemstrømningskapacitet er en bekymring 15 . Den neutrale fraktion antages generelt at stamme primært fra opbevaringslipider produceret af svampe, selv om der også kan være noget mindre bidrag fra jordfauna 41 . I lyset heraf kan fremgangsmåden beskrevet her give resultater, som viser et større bidrag fra svampepipideme 18: 2ω 6,9c og 18: 1ω 9c end PLFA. De andre lipider, der har tendens til at dukke op i den neutrale fraktion, omfatter nogle af de mættede fedtsyrer, fx 16: 0, 18: 0, 20: 0.

Der er forskellige måder, hvorpå lipiddata kan udtrykkes og analyseres. De mest almindelige repræsentationer er overflod (nmol g -1 jord), mol fractioN (nmol individuelt lipid nmol -1 total lipid) og molprocent (molfraktion * 100). Normaliseret af de totale lipider i en prøve er molfraktion og molprocent foranstaltninger af den relative overflade af et givet lipid. Efter en hensigtsmæssig transformation er fx arcsin kvadratroden, molefraktion hensigtsmæssig til anvendelse ved analyse ved hjælp af hovedkomponenter eller redundansanalysekoordinering. Overflod er den absolutte mængde af et givet lipid ekstraheret pr. Gram jord. Fordi mængden af ​​lipid pr. Celle er rimelig konstant, og lipidekstraktionen er yderst effektiv og omfattende, er den samlede overflod et godt skøn for de samlede lipider, og overfladen af ​​nøgleindikatorer afspejler biomassen af ​​den økologiske gruppe, den repræsenterer 17 . Endelig er en god måde at se på mikrobielle fællesskabssammensætninger at anvende multivariate analysemetoder 16 , fx ordinationsmetoder som ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS -Som ikke behøver datatransformation) eller hovedkomponentanalyse (PCA), kan være nyttig til sammenligning af den relative overflod af alle lipidbiomarkører.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist finansieret af DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) og DOE OBP Office for energieffektivitet og vedvarende energi (DE-AC05-76RL01830). Forfatterne vil gerne anerkende Anders Gurda for hans tålmodige og dygtige bidrag til videografi og redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11, (3), 296-310 (2008).
  2. Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25, (8), 468-478 (2010).
  3. Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36, (2), 137-144 (2013).
  4. Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66, (1), 145-157 (2013).
  6. van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363, (1-2), 1-5 (2013).
  7. Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69, (5), 1412-1421 (2005).
  8. Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81, (1-4), 509-520 (2002).
  9. Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22, (3), 261-264 (1996).
  10. Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43, (8), 1621-1625 (2011).
  11. Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60, (7), 2483-2493 (1994).
  12. Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. Forthcoming (2017).
  16. Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55, (11), 2888-2893 (1989).
  17. Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118, (6), 1251-1263 (2015).
  18. Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
  19. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24, (4), 317-323 (1992).
  20. Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59, (11), 3605-3617 (1993).
  21. Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24, (3), 365-374 (1986).
  22. Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39, (8), 535-541 (1989).
  23. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. 299-488 (1988).
  24. Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37, (3), 601-604 (2005).
  25. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  26. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  27. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64, (5), 1659-1668 (2000).
  28. Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  29. Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  30. Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  31. Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  32. Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43, (10), 2184-2193 (2011).
  33. Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49, (2), 191-205 (2004).
  34. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53, (9), 1689-1699 (2013).
  35. Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9, (2), 119-130 (2011).
  36. Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  37. Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  38. Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  39. Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45, (4), 373-383 (2003).
  40. Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
  41. Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  42. Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  43. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2, (2), 131-137 (2011).
  44. Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9, (12), 1-14 (2014).
  45. Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87, (3), 570-579 (2006).
  46. Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39, (2), 517-525 (2007).
  47. Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284, (1-2), 85-100 (2006).
  48. Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40, (10), 2699-2702 (2008).
  49. Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7, (1), 27-49 (2005).
  50. Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).
En lipidekstraktions- og analysemetode til karakterisering af jordmikrober i forsøg med mange prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter