Summary
ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。
Abstract
肝臓は、全身性炎症の調節において決定的な役割を果たしています。特に慢性腎臓病では、肝臓は尿毒症環境、酸化ストレス、内毒素血症および急性期反応物質を大量に製造することにより炎症性サイトカインを循環させる減少クリアランスに応じて反応します。炎症や肝細胞の根本的な役割を研究するための実験的なツールは、特に、慢性腎臓病などの複雑な設定で、全身の急性期応答および長期の炎症誘発性シナリオに肝臓のサイトカインの調節および貢献を理解することが重要です。 生体内で炎症の複雑なメカニズムを研究することは困難なままであるため、通常はリソースを大量に消費するとは、トランスジェニック動物の使用を必要とし、第一の単離肝細胞は、肝臓の急性期反応に機構的洞察を得るための強力なツールを提供しています。このインビトロ技術は、中程度のコストを提供していますので、高い再生産性および技術常識には、一次単離された肝細胞はまた、容易にスクリーニング手法として使用することができます。ここでは、初代マウス肝細胞を単離するために、酵素ベースの方法を記載し、そして我々は、ELISAおよび定量的リアルタイムPCRを用いて、これらの細胞における炎症反応の評価を記述する。
Introduction
慢性腎臓病（CKD）は、急性および慢性炎症1の状態として定義することができます。 CKDを有する患者において、phosphaturicホルモン線維芽細胞増殖因子23（FGF23）の血清レベルは、徐々に、血清リン酸塩のホメオスタシス2を維持するために上昇します。増加した血清FGF23レベルは独立して、血液透析治療3、4を始めている患者の間で心血管疾患の罹患率と死亡率に関連付けられています。さらに、いくつかの臨床研究が上昇FGF23レベルおよびC反応性タンパク質（CRP）、インターロイキン6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNFα）5、6の血清レベルの間に強い相関関係を示しています。また、実験的研究では、我々は、FGF23直接肝細胞を標的とし、CRPおよびIL-6 Pを増加させることにより炎症反応を引き起こすことができることが最近実証されています肝臓7でroduction。したがって、FGF23は、CKDにおける全身性炎症に貢献する循環因子として作用することがあります。
70年代初めには、初代肝細胞を単離し、初めて8のために勉強しました。それ以来、初代培養肝細胞が広範囲に代謝処理、ホルモン機能、薬物代謝および毒性を調べるだけでなく、免疫および炎症反応9、10に使用されてきました。以前のプロトコルは、主に、ヒト肝組織11、12からの一次肝細胞の酵素の単離を記載しています。優れたモデルが、これは複雑な肝臓のシグナル伝達機構と同様に刺激の異なる種類に応じて機能的結果にどのように影響するかを遺伝子操作研究する能力を残します。以下では、我々は、マウス初代肝細胞の単離を記載しています。注目すべきことに、このようなリポ多糖（LPS）、IL-6及びFGF23などの肝臓の急性期反応のいくつかのメディエーターの効果は、簡単、迅速かつ再現可能な方法13で解析することができます。
ここで、我々は、成体マウスからの肝細胞の酵素を単離するためのプロトコルを提示し、我々はそのようなLPSおよびIL-6などの炎症の確立された誘導物質、ならびにFGF23としての新規炎症性メディエーターは、直接の発現および分泌を刺激することができることを実証していますこのような培養肝細胞におけるCRPおよびIL-6などの炎症性サイトカイン、。
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Protocol
全ての動物プロトコルおよび実験手順は、医学のマイアミミラー科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。
1.準備
- 予熱肝臓灌流媒体および肝臓を37℃の水浴中で媒体を消化します。
- 灌流ポンプ（30ミリリットル/分）を設定します。慎重に肝灌流メディアとポンプの配管システムを事前入力。システム内の任意の気泡を避け、定位顕微鏡を準備します。
- 製造業者のプロトコルに従って、コラーゲンタイプIを使用してコート細胞培養皿。
2.肝回復
- 酸素/イソフルラン吸入（イソフルラン4％/ 2 L /分の酸素）を使用して、ドナーマウスを麻酔。
- 2-2.5％のイソフルランを下げることによって、またはケタミンを注射することによって麻酔を維持した（100mg / kg体重の腹腔内量）およびキシラジン（体重の10mg / kgのintraperitoneally）。ケタミンは、血圧を低下させ、肝毒性を引き起こす可能性があるため、連続的なイソフルラン麻酔が好ましいです。
- 吸収パッドに麻酔マウスを置きます。粘着テープでマウスの四肢を修正しました。
- 剃るとマウスの腹部を消毒し、シャープ/鈍ヒントを手術用ハサミを使用して、肝臓の頭蓋国境に恥骨から腹開腹術を行います。 、両面に振動板の尾を腹壁を切開。
- 慎重に右側に腸を動かすことによって、下大静脈（IVC）を公開します。慎重に滅菌綿棒綿棒や角度のついた先端鉗子を使用して、IVCの周りの脂肪組織を解剖。
- 肝上横隔膜を切開し、シャープ/鋭い先端の微細手術用ハサミを使用して、2つの横方向の切開によって胸腔を開きます。外科的な絹（5/0）を使用して胸部IVCを連結。
- 、慎重に針を取り外し、シールド静脈カテーテルを使用して、腎臓下のIVCにカニューレを挿入灌流ポンプを接続し、肝臓を灌流開始。適切に実行した場合、肝臓はすぐに白くやうねりに開始する必要があります。
- 微細手術用はさみを用いて血液と灌流メディアの適切な排水を可能にする静脈ポータルを横断。
- 肝灌流メディアの約30mLで肝臓を灌流し、その後メディア（30ミリリットル）をダイジェスト肝臓に切り替えます。灌流ポンプの電源をオフにして、潅流が完了したら、カニューレを削除します。
- 静かに肝臓の中央領域を露出させ、肝葉を結ぶ接続する組織を検索します。中央の連結糸をつかみ、慎重に所定の位置に肝臓を保持している全ての組織を解剖し、静かに肝臓を削除します。
- 直ちにメディアダイジェスト肝臓の15 mLを含む50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに肝臓を移します。
注：このステップの具体的なタイムラインがありません。灌流後、肝臓は、滅菌細胞培養フードへの輸送のためのダイジェスト培地に残っています。すべてですubsequent手順は無菌環境で行うべきです。
細胞の3単離と治療
- 細胞培養フード内で無菌の組織培養皿に消化培地を含む50mLのポリプロピレン製円錐管から肝臓を移します。
- 滅菌ピンセットを使用して、静かに肝臓の4ローブを引き裂きます。適切に実行した場合、消化培地が原因で肝臓から肝細胞を単離することに濁っておく必要があります。
- 25mLの滅菌ピペットチップを用いて、未消化組織粒子及び細胞破片を除去し、新しい50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに70μmのナイロン細胞ストレーナーを介して混濁消化培地をフィルタ。
- 繰り返しは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3.2と3.3を繰り返します。これは、肝臓から残留肝細胞を除去することを支援します。
- 4°Cで2分間50×gで遠心分離します。 25 mLの冷たい1×で細胞を再懸濁静かに過剰細胞破片を含む上清を吸引し、ウィリアムズの中E.
- 25mLの滅菌ピペットチップを使用して、クリーンな懸濁液を達成するために、50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して再懸濁をフィルタリングします。
- 繰り返しは、より明確な細胞懸濁液を得るために、冷たいウィリアムズE培地1Xを使用して、3つの追加の洗浄のための3.5と3.6を繰り返します。
- 最後の洗浄工程の後、吸引上清を過剰細胞残屑を除去しました。再懸濁し、50mLポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して初代肝細胞融解やメッキサプリメントが含まれている25 mLの暖かいウィリアムズ「メディアE 1倍でフィルタセル。
- 血球計を用いて25 mLの細胞懸濁液内の細胞を数えます。成人肝あたり20万個の細胞 - 平均して15を期待しています。トリパンブルー染色を用いて細胞生存率を決定します。
- プレート初代肝細胞の融解が含まれているウィリアムズのメディアE 1×2mL中の細胞やコラーゲンコートした6ウェルCE上のサプリメントをメッキLL培養クラスター（ウェル当たり9×10 5個の細胞）。
- 4時間後、初代肝細胞の維持サプリメントが含まれているウィリアムズのメディアE 1Xにメディアを変更します。
- 24時間後、血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地で1×6時間、細胞を飢えさせます。
- ビヒクル、FGF23（25ngの/ mL）を、LPSのようにPBSで細胞を処理（100μg/ mLの）または無血清培地中のIL-6（50ng / ml）及び24時間インキュベートします。
RNAの4.絶縁
- 製造業者の指示に従って商用スピンカラムキットを用いてRNAを調製します。
逆転写により単離されたRNAから5.生成するcDNA
- PCRチューブに単離されたRNAサンプルの200 ngのを追加します。
- ステップ5.1からPCRチューブにヌクレアーゼフリーH 2 Oの14μLを追加します。
- ステップ5.1からPCRチューブに逆転写酵素の4μLを追加します。
- 混合物が均質にするために静かに内容を再サスペンド。遠心優しく。 サーモサイクラーに混合物を含むPCRチューブを置きます。実行逆転写のためのサーモサイクラー：次に、25℃（5分）、42℃（30分）を1サイクル、85℃（5分）、4℃で保持します。最終生成物は、所望のcDNAになります。
前記定量的リアルタイムPCRによる細胞の分析（定量PCR）
- 96ウェルプレートを準備します。
- 1μLのcDNA、0.25μMフォワードプライマー、0.25μMリバースプライマー、5μLSYBRグリーン、10μLの総容量に3.5μLのPCRグレードの水：氷の上で定量PCR反応のすべてのコンポーネントを配置します。 SYBRグリーンを使用して、三連ですべてのサンプルを実行するには、マスターミックスを準備します。
- マスターミックスが完了すると、渦は、均質作ります。 96-WLLプレートの各ウェルにアリコート9μL定量PCRのマスターミックス。後、慎重に各ウェルにcDNAの1μLを追加します。総反応容量10μLになるであろう。
- ローディングが完了した後、光を用いて、96ウェルプレートをシール接着フィルム、短時間遠心分離、96ウェルプレート（1分間50×gで）。
- リアルタイム-PCR機器で実行したサンプル。リアルタイム-PCR機器に封入し、96ウェルプレートを置き、機器ごとにメーカーの推奨事項として、サンプルを実行します。標準および高速サイクルの例は、以下に含まれています。
- 60秒間、15秒間、その後、120秒間94℃、60℃を94℃の40サイクルを最初の変性、その後、必要に応じて、4℃で保持する：標準的なサイクリングパラメータは、以下を使用します。
- 高速サイクリングパラメータの場合：5秒、15秒58℃、10秒間、その後72℃、その後、30秒、95℃の40サイクルを94℃での初期変性：以下を使用します。
- データを分析する方法に関するガイダンスについては、機器のマニュアルを参照してください。
ELISAによる細胞上清の7.分析
注：すべての手順は、メーカーのプロトコルに従って行われます。
- 別々のチューブに希釈剤の398μLを分注します。 398μLの希釈剤チューブに細胞上清サンプルのピペット2μL。これは、200の希釈倍数を提供します。
- テストされる各サンプルの手順を繰り返し7.1.1。
- 200倍希釈したサンプルと、96ウェルプレートのウェルに標準100μLを加えます。
- 150rpmでマイクロプレートシェーカー上で45分間、25℃で96ウェルプレートをインキュベートします。
- ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄します。最後の洗浄が完了すると、吸収紙を持つすべての残留洗浄液を除去します。
- 各ウェルにHRPコンジュゲート試薬500μLを追加します。
- 7.2.3 - を繰り返して、7.2.2を繰り返します。
- テトラメチル100μLを加える（TMB）を、96ウェルプレートの各ウェルに試薬。
- 穏やかにマイクロプレート上に20分間、25℃で96ウェルプレートを混ぜます150rpmでシェーカー。直接各ウェルに停止液100μLを加えて反応を停止し、穏やかに混合します。停止液が追加されると色が黄色に変わります。これは、停止液を正しく混合されたことを通知します。
- マイクロタイタープレートリーダーを用いて、最初の5分以内に450 nmでの光学密度を決定します。
- 各サンプルおよび各標準の平均吸光度値（450）の表を計算します。
- 線形グラフにNG / mLの中でその標準濃度に対する各標準のA 450平均値をプロットすることにより標準曲線を組み立てます。 450の値を表すために濃度、y軸を表すx軸を許可します。
- 各希釈サンプルから450の平均利用して、標準曲線からNG / mLの所望のタンパク質の濃度を決定します。
- 事実上の希釈によって試料濃度を掛けrを。これは、細胞上清試料中の所望のタンパク質の実際の濃度を決定することを可能にします。
- 折れ線グラフにサンプルから構成されたテーブルをプロットします。 OD 450の値は、標準曲線の外になった場合、サンプルが適切に希釈されるべきであり、再試験しました。
- 500,000個の細胞に結果を正規化します。
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Representative Results
組織学
一次単離および培養された細胞の代表的な光学顕微鏡像を、 図1Aに示されています。免疫細胞化学分析は、単離された肝細胞は非常アルブミン（赤）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体4（FGFR4）（緑色）を発現することを示しています。核は4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で染色します。 （ 図1B）。
定量的リアルタイムPCR
主要な単離された肝細胞を、定量的リアルタイムPCRによって分析したCRPおよびIL-6の24時間およびmRNAレベルのFGF23（25 ngの/ ml）のLPS（100μg/ mLの）またはIL-6（50ng / ml）で処理しました。 FGF23、LPSおよびIL-6は大幅にCRPおよびIL-6の発現を増加させました。 （ 図2A）
単離された初代肝細胞からの細胞培養上清をCRPレベルについてELISAによって分析しました。 PBS処理細胞と比較した場合、我々の定量的リアルタイムPCR分析に伴い、LPS、IL-6、ならびにFGF23治療は有意に細胞上清中のCRPレベルを増加させました。 （ 図2B）
図1：孤立したマウス初代肝細胞の（A）位相差顕微鏡像。 24時間プレーティングした後、細胞は六角形状を呈し、しばしば二核現れます。 （スケールバー= 100μm）で。 （B）免疫蛍光顕微鏡分析は、単離された細胞の大部分は、アルブミン（赤）、肝細胞特異的マーカーを発現することが明らかになりました。細胞はまた、非常にFGFR4（緑）を発現します。 DAPIは核を染色します。オリジナルの倍率40X.（スケールバー=50μm）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 単離されたマウス初代肝細胞の定量的リアルタイムPCR解析CRPおよびIL-6発現を測定し。 PBS処理細胞と比較した場合（A）LPSは、IL-6及びFGF23処置は有意にCRPのmRNAレベルを増加させます。 （; P <0.01; n = 3の独立したアイソレーション値が±SEMで倍率変化として表現されています）。 PBS処置と比較した場合、LPSで処理した（B）細胞は、IL-6またはFGF23はまた、IL-6のmRNAレベルの有意な増加を示します。 （値は、SEM±倍数変化として表される; p <0.001、n = 3の独立した単離）におけるCRPタンパク質レベルの（C）定量酵素免疫測定法（ELISA）によって単離したマウス初代肝細胞からの上清。 PBS処置と比較した場合、LPS、IL-6およびFGF23を大幅CRPタンパク質レベルを増加させます。値は、500,000個の細胞当たりミリグラム/ dlの中のCRP濃度を表します。 （P <0.05、n = 3の独立した単離）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マウスからの初代肝細胞を分離することにより、ex vivoでの炎症反応を研究するために、高速、安価で信頼性の高いツールです。正しく実行した場合、結果は容易に生成され、タイムリーかつ費用効率的な方法で再生することができます。以下の点を慎重に成功した絶縁を確保するために評価されるべきです。
外科的切開とIVCのカニュレーションは、全身麻酔下ではなく、安楽死の後に行われるべきです。若い、経験の浅い研究者はマウスの腹部の解剖学的特徴に慣れるため、正しいカニュレーションを実行するために初めに多くの時間が必要になります。灌流開始するまで生きてドナー動物を維持、大幅に単離された細胞の生存率を増加します。それが大幅に単離された肝細胞の収量を増加させるため、超肝IVCのライゲーションを行うべきです。代替的に、マイクロ手術用クランプは、IVC上に配置することができます。しかし、開胸以下、動物には数分以内に故人となります。したがって、後続のすべてのステップは、肝臓は灌流の開始までに十分な血流を維持することを確実にするために速やかに実施すべきです。カニュレーションについては、格納式静脈カテーテルの使用を強くお勧めします。 IVCをカニューレ挿入した後、カテーテル針を注意深く血管穿孔の危険性を最小限にする、後退させることができます。最後の重要なステップは、カテーテルの灌流システムの接続です。カテーテルから針を除去した後、血液は、灌流ポンプに接続する前に、カテーテルの端部から排出する必要があります。このステップは、量の大幅な削減だけでなく、単離された細胞の品質を引き起こす可能性があります空気塞栓のリスクを、最小限に抑えることができます。
灌流が開始されると、肝臓は直ちに均一淡い赤色から黄色にその色を変更する必要があります。赤の残りの部分はinsufficを示しますient灌流または空気塞栓の存在。単離された細胞の洗浄およびフィルタリングを繰り返し実行する必要があります。これは、過剰な細胞破片の効率的な除去を確実にします。健康的な単離された肝細胞は、メッキされているの最初の4時間以内に従うことになります。したがって、めっきメディアは、この時点で維持培地に変更することができます。一晩のインキュベーションの後、細胞は、顕著な核を有する複数の六角形状に表示されます。肝細胞はまた、二核（ 図1A）とすることができます。造粒または携帯ブレブ形成が不良分離のための指標です。肝細胞は継続的に正しく準拠していないか、または細胞生存率が低いままであれば、灌流のために使用される消化媒体の量を変更する必要があります。これは、過剰または肝組織のunderdigestionを避けるべきです。
細胞のより高い収量が必要な場合は、門脈を介した順行性灌流を行うことができます。 Klaunigら。この特定の技術は、総細胞収量を増加させることができることを示しています。 Altキーernatively、IVCの次門脈カニュレーション断続的な留めを適用することができます。これは、定期的に単離された細胞の総数を増加させることができるはずまた、灌流中の圧力を増加させます。灌流時間だけでなく、灌流速度は、14を調整することが必要になる場合があります。我々は、しかし、代替灌流プロトコルを実行していません。
最初に成功した分離した後、（アルブミンなどのため）肝細胞特異的免疫染色は、分離（ 図1B）の純度を確保するために実行する必要があります。単離後24時間は、肝細胞は、血清は、4〜8時間飢餓状態にし、その後の治療のために使用されるべきです。急性期応答を研究する際に、細胞は、Toll様受容体4とNF-κB15を介して炎症を誘導することが知られているLPSで処理することができます。このようなIL-6などの炎症性サイトカイン、インターロイキン受容体16を介してその効果を媒介します。さらに、我々は最近、FGF23は、FGFR4およびPLCγ/カルシニューリン/ NFAT経路を活性化し、肝臓7、17における炎症反応を誘導することができることを実証しました。十分な転写および標的遺伝子の翻訳を確実にするために、細胞を24時間処理されるべきです。一緒に細胞上清のELISAを用いて定量的リアルタイムPCRを用いてmRNAおよび遺伝子発現の連続分析を単離することは容易に繰り返すことができる強固な情報を提供します。これは、新規なプロ炎症性メディエーター、その肝受容体とそれらの連続した下流のシグナル伝達機構の調査を可能にします。例えばHepG2およびHep3B細胞細胞などの一般的な癌細胞株と比較した場合、特に、トランスジェニック動物から単離した初代細胞は、優れた結果を提供します。その単純に、このアプローチはまた、新規な薬物の効果を調べるためにスクリーニングするために使用することができます。それにもかかわらず、複雑な薬理学的または病態physioloを研究外科用のメカニズムは、主にin vivoでの設定では、追加の確証実験が必要になります。
分離された肝細胞は数日以内に脱分化する傾向があるので、我々は長期的な研究を行っていません。他18によって報告されたようしかし、これは、特別な細胞培養技術によって克服することができます。これらは、コラーゲンのダブルゲル構成、肝細胞スフェロイド、内皮細胞との共培養、および3T3-J2線維芽細胞とマイクロパターン共培養を含みます。まとめると、初代マウス成人肝細胞の単離は、メタボロミクス、炎症、免疫及び薬物および毒素に対する肝臓の応答に関心のある科学者のための強力なツールを提供します。これは、単純な実行可能性、適度なコストで高速な再現性によって特徴付けられます。
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Disclosures
著者は宣言するために利害の競合を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（R01HL128714 CF）と（KSへF31DK10236101）とアメリカ心臓協会（CFとAG）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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