Summary
这里，我们表明酶促方法来原代肝细胞从成年小鼠隔离，我们描述了使用ELISA和实时PCR的炎症反应的量化。
Abstract
肝脏在全身性炎症的调节决定性的作用。特别是在慢性肾脏疾病，肝脏响应于尿毒症环境，氧化应激，内毒素血症和通过产生大量的急性期反应物的循环促炎性细胞因子的清除率降低反应。实验工具来研究炎症和肝细胞的基本作用是理解的调节和肝细胞因子的贡献全身急性期反应和延长的促炎症的情况下，尤其是在复杂的环境至关重要如慢性肾脏疾病。自体内研究炎症的复杂的机制仍然是具有挑战性的，耗费资源的，通常需要转基因动物的使用，一次分离的肝细胞提供一个强大的工具来获得机械分析上市肝急性期反应。由于这种体外技术特点适中成本，高重可生产和技术常识，一次分离的肝细胞也可以很容易地用作筛选方法。这里，我们描述一个基于酶促法以分离原代鼠肝细胞，和我们描述在使用ELISA和定量实时PCR这些细胞的炎症反应的评估。
Introduction
慢性肾病（CKD）可以被定义为急性和慢性炎症1的状态。在慢性肾脏病患者中，phosphaturic激素成纤维细胞生长因子23（FGF23）的血清水平逐步上升，以维持血清磷酸盐稳态2。提高血清FGF23水平分别与心血管发病率和死亡率谁开始血液透析治疗3，4患者有关。此外，一些临床研究表明升高的FGF23水平与C-反应蛋白（CRP），白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）5,6的血清水平之间存在很强的相关性。另外，在实验研究中，我们最近表明，FGF23可以直接靶向肝细胞，并导致增加的CRP和IL-6 P的炎症反应roduction在肝脏7。因此，FGF23可能充当有助于全身炎症反应在CKD循环因素。
在70年代初，原代肝细胞分离并研究首次8。自那时以来，原代培养的肝细胞已被广泛用来研究代谢加工，激素功能，药物代谢和毒性，以及免疫和炎症反应9,10。先前协议已经主要描述原代肝细胞的酶活隔离从人肝脏组织11，12。虽然一个很好的模式，这留下了研究操纵基因是如何影响肝脏复杂的信号机制，以及在不同类型的刺激功能的后果的能力。在下面，我们描述了小鼠原代肝细胞的分离。值得注意的是，肝急性期反应的几种介质，如脂多糖（LPS），IL-6和FGF23的效果可在简单，快速和可重复的方式13进行分析。
在此，我们提出了从成年小鼠肝细胞的酶促隔离的协议，并且我们表明，炎症的建立诱导，如LPS和IL-6，以及新颖的炎症介质如FGF23，可直接刺激的表达和分泌炎性细胞因子，如在培养的肝细胞的CRP和IL-6。
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Protocol
所有动物方案和实验过程由医学迈阿密大学米勒医学院大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1.准备
- 预热肝灌注介质和肝脏，在37℃消化介质中的水浴中。
- 设置一个灌注泵（30毫升/分钟）。仔细预填肝灌注介质泵的管道系统。避免在系统中的任何气泡，并准备立体显微镜。
- 使用根据制造商的协议我型胶原涂层细胞培养皿。
2.肝恢复
- 麻醉用氧气/异氟醚（异氟烷4％/ 2升/分钟氧气）供体小鼠。
- 通过降低异氟烷以2-2.5％或通过注射氯胺酮维持麻醉（100mg / kg的体重腹膜内）和赛拉嗪（10毫克/公斤体重的intraperitoneally）。连续异氟烷麻醉优选自氯胺酮降低血压，并可能导致肝毒性。
- 放置麻醉小鼠上的吸收垫。用胶带固定鼠标的四肢。
- 刮脸和消毒鼠标的腹部，并从耻骨进行剖腹探查腹用手术剪刀锋利/钝头肝脏的颅边框。切开腹壁向两侧，膜片的尾部。
- 经肠道仔细移动到右侧暴露下腔静脉（IVC）。用消毒棉签拭子和角度的尖镊子仔细解剖周围的IVC脂肪组织。
- 切开肝上下隔膜，并用细手术剪刀锋利/锋利的尖端两侧切口打开胸腔。使用胸外科IVC丝（5/0）结扎。
- 使用屏蔽静脉导管导管插入下腹IVC，小心地取出针头，连接灌注泵，开始灌注肝脏。如果执行得当，肝应立即开始发白和膨胀。
- 横切门静脉使血液和灌注媒体适当的排水用细手术剪。
- 灌注用约30毫升肝灌注介质的肝脏，然后切换到肝脏消化介质（30毫升）中。关闭灌注泵并取出插管灌注一次完成。
- 轻轻暴露肝脏的中央区域并定位在连接组织联的肝叶。抓住中央连接光纤，仔细剖析控股肝脏全部到位组织和轻轻取出肝脏。
- 紧接在肝脏转移到含有15毫升的50mL聚丙烯锥形管肝脏消化介质。
注：有没有具体的时间线的这一步。灌注后，肝脏保持在消化介质输送到无菌细胞培养罩。所有Subsequent步骤应在无菌环境中进行。
细胞3.隔离治疗
- 在细胞培养罩，转移从50毫升聚丙烯锥形管含有消化媒体肝脏进入无菌组织培养皿。
- 使用无菌镊子轻轻撕肝脏的四个叶片。如果正确执行，消化中应该由于从肝脏分离肝细胞变浑浊。
- 用25毫升无菌枪头，通过70微米尼龙细胞过滤混浊消化介质过滤到一个新的50毫升聚丙烯锥形管以除去未消化的组织颗粒和细胞碎片。
- 重复步骤3.2和3.3，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）。这有助于从肝驱除残存肝细胞。
- 离心机在50×g离心在4℃下2分钟。吸出上清液含有过量的细胞碎片，轻轻地再暂停25毫升冷的1×细胞威廉姆斯的中E.
- 用25毫升无菌枪头，通过一个新的70微米尼龙细胞过滤器过滤再悬浮到50mL聚丙烯锥形管以实现清洁悬浮液。
- 重复步骤3.5和3.6使用冷威廉姆斯中等E 1X，以获得更清晰的细胞悬液三个额外的洗涤。
- 最后洗涤步骤后，吸去上清液，以除去过量的细胞碎片。重悬和过滤器的细胞在25mL暖Williams的媒体E 1X包含原代肝细胞的解冻和电镀补充剂通过一个新的70微米尼龙细胞过滤到50mL聚丙烯锥形管中。
- 算使用血球25毫升细胞悬浮液中的细胞。平均预期15 - 每位成人肝20000000细胞。使用台盼蓝染色测定细胞生存力。
- 板块细胞威廉姆斯的2毫升媒体E 1X包含原代肝细胞解冻和电镀添加剂在胶原包被的6孔策LL培养簇（每孔9×10 5个细胞）。
- 4小时后，介质改为威廉姆斯的媒体E 1X包含原代肝细胞的维护补充剂。
- 24小时后，血清饥饿用Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）培养基1×6小时的细胞。
- 用PBS处理细胞作为溶媒，FGF23（25毫微克/毫升），脂多糖（100微克/毫升），或在无血清培养基中的IL-6（50毫微克/毫升），并培育24小时。
4.隔离的RNA
- 使用根据制造商的说明在商业自旋柱试剂盒制备的RNA。
5.生成的cDNA通过逆转录RNA分离
- 添加200毫微克分离的RNA样品以PCR管。
- 从步骤5.1添加核酸内切酶游离H 2 O至PCR管的14微升。
- 从步骤5.1添加4微升反转录酶对PCR管。
- 轻轻重悬内容，以混合均匀;离心平缓。 放置装有该混合物成热循环PCR管。用于逆转录运行热循环：1个循环的25℃（5分钟），42℃（30分钟），85℃（5分钟），然后保持在4℃。最终产品将是所需cDNA。
6.实时定量PCR细胞分析（定量PCR）
- 准备96孔板。
- 放置在冰上的qPCR反应的所有成分：1μL的cDNA，0.25微米的正向引物，0.25μM反向引物，5μL的SYBR绿，3.5微升的PCR级水，以10μL的总体积。使用的SYBR Green，准备预混一式三份运行的所有样本。
- 一旦主结构完成后，旋涡，使均匀。等分试样9的qPCR的微升主混合物到96-WLL板的各孔中。后，小心加cDNA的1微升到每口井。反应总量将成为10微升。
- 加载完成后，密封用光学96孔平板粘合膜和短暂离心96孔板（50×g离心1分钟）。
- 运行样品在实时PCR仪。处密封保存96孔板为实时PCR仪和运行样品按照仪器制造商的建议。标准和快速循环的例子包括在下面。
- 对于标准循环参数，使用以下命令：预变性94℃120秒，然后94℃40个循环15秒，60℃60秒，然后有选择地在4℃举行。
- 对于快速循环参数：使用以下命令：94℃预变性30秒，然后95℃40个循环5秒，58℃15秒，然后72℃10秒。
- 参考仪器手册，了解有关如何分析数据的指导。
7.通过ELISA细胞上清液的分析
注：根据制造商的协议执行的所有步骤。
- 稀释分装398微升到单独的试管。吸取2μL细胞上清液样品放入398微升稀释剂管。这将提供为200的稀释倍数。
- 对每个样品重复步骤7.1.1进行测试。
- 吸取100μL的200倍稀释的样品和标准于96孔板的孔中。
- 孵育96孔板在25℃下用在以150rpm微孔板摇床上45分钟。
- 洗孔5次用1×洗涤缓冲液。一旦最后一次洗涤完成后，取出用吸水纸全部残留洗涤液。
- 加入酶标试剂500微升到每口井。
- 重复步骤7.2.2 - 7.2.3。
- 吸取100μL的四甲基联苯胺（TMB）试剂到96孔板的每个孔中。
- 轻轻在25℃的微量混合96孔板20分钟摇床在150rpm。通过直接加入100微升的终止溶液以每孔停止反应，并轻轻混合。一旦停止溶液的颜色应该变黄。这个通知的终止溶液已正确混合。
- 使用微量滴定板读数器，确定第一个5分钟内450nm处的光密度。
- 计算每个样本和每个标准平均吸光度值（A 450）的表。
- 在NG密谋反对它的标准浓度每个标准的A 450平均组装的标准曲线/毫升的线性图。允许x轴表示的浓度和y轴来表示A 450值。
- 利用意味着从每个稀释样品A 450，从标准曲线确定毫微克/毫升所需蛋白的浓度。
- 通过稀释事实上乘以样品浓度河这将允许用于确定细胞上清液样品中的所希望的蛋白质的实际浓度。
- 绘制从样本构建表成线图。如果OD 450值在标准曲线的外部，样品应适当地稀释并重新测试。
- 结果归为500,000个细胞。
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Representative Results
组织学
一次分离和培养的细胞的代表性光显微镜图像在图1A中描绘。免疫细胞化学分析表明，分离的肝细胞中高度表达白蛋白（红色），以及成纤维细胞生长因子受体-4（FGFR4）（绿色）。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）。 （ 图1B）。
定量实时PCR
一次分离肝细胞与FGF23治疗（25毫微克/毫升）的LPS（100微克/毫升）或IL-6（50毫微克/毫升）24小时，CRP和IL-6的mRNA表达水平通过定量实时PCR进行分析。 FGF23，LPS和IL-6的显著增加的CRP和IL-6的表达。 （ 图2A）
从分离的原代肝细胞的细胞培养上清液通过ELISA CRP水平进行分析。与我们的定量实时PCR分析，脂多糖线，IL-6以及FGF23治疗相比PBS处理的细胞时显著增加在细胞上清液CRP水平。 （ 图2B）
图1：隔离小鼠原代肝细胞的（A）相衬显微图像。电镀后24小时，细胞表现出一个六边形状，经常出现双核的。 （比例尺= 100微米）; （B）免疫荧光显微镜分析表明，大部分分离的细胞的表达白蛋白（红色），一个肝细胞特异性标记。细胞也高表达FGFR4（绿色）。 DAPI染色细胞核。原来的40倍X.（比例尺= 50微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 隔离小鼠原代肝细胞的实时定量PCR分析，以确定CRP和IL-6的表达。 （A）中的LPS相比，PBS处理的细胞时的IL-6和FGF23治疗显著增加的CRP的mRNA水平。 （值表示为倍数变化±SEM，P <0.01; n = 3的独立隔离）。用LPS处理（B）的细胞，IL-6或与PBS相比治疗时FGF23还显示了IL-6的mRNA表达水平显著增加。 （值表示为倍数变化±SEM，P <0.001; n = 3的独立隔离）（℃）的CRP的蛋白质水平的定量通过酶联免疫吸附测定（ELISA）从分离的鼠原代肝细胞的上清液。与PBS相比治疗时脂多糖，IL-6和FGF23显著增加的CRP的蛋白质水平。值代表在每500,000个细胞毫克/分升CRP浓度。 （P <0.05，N = 3个独立的隔离）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
从小鼠中分离原代肝细胞是一种快速，廉价和可靠的工具来研究炎症反应体外。如果正确执行，结果可以很容易地生成并及时和具有成本效益的方式再现。以下几点应仔细评估，以确保成功隔离。
手术切口和下腔静脉的插管应在全身麻醉下，不安乐死之后进行。一个年轻的，缺乏经验的调查员将需要更多的时间在一开始就熟悉小鼠腹部的解剖学特征，并进行正确的插管。保持供体动物存活直到灌注开始时，将显著增加分离的细胞的活力。应执行的超肝腔静脉结扎，因为它会显著增加分离的肝细胞的产率。可替代地，微外科夹具可被放置在腔静脉。然而，随着开胸，动物会变成一两分钟内死亡。因此所有的后续步骤应迅速进行，以确保在肝维持充足的血流到灌注开始。为插管，强烈建议一个可伸缩的静脉内导管的用法。 cannulating下腔静脉后，导管针可以仔细缩回，其中血管穿孔的风险降至最低。最后关键步骤是灌注系统的到导管的连接。从导管中除去针后，血液应当将其连接到一个灌注泵之前，从导管的端部排出。这一步骤减少了空气栓子的风险，这可能会导致在量的显著减少以及分离的细胞的质量。
一旦灌注开始后，肝脏应立即和均匀改变从红色其颜色为浅黄色。其余部分将红色表示insufficient灌注或空气栓子的存在。应反复进行分离的细胞的洗涤和过滤。这将确保高效去除多余细胞碎片。健康分离肝细胞将被镀的前4小时内附着。因此，电镀介质可以在该时间点被改变为维持培养基。过夜温育后，将细胞中会出现一个更六边形形状与突出的髓核。肝细胞也可以是双向的核（ 图1A）。造粒或细胞出泡是一个贫穷的隔离的指标。如果肝连续未正确粘附或细胞存活率仍然很低，消化媒体的用于灌注量应改变。这应该避免过度或肝组织underdigestion。
如果需要的细胞的产率提高，能够进行通过门静脉的顺行灌注。 Klaunig等。已经表明，这种特殊的技术可以增加总细胞产量。 Alt键ernatively，下面门静脉插管下腔静脉的间歇抱茎均可适用。这将定期增加压力的灌注过程中，也应该还可以提高分离的细胞的总数。灌注时间以及灌注速率可能不得不进行调整14。但是，我们还没有进行替代灌注协议。
第一次成功分离后，应该进行肝细胞特异性免疫染色（ 如白蛋白），以确保隔离（ 图1B）的纯度。隔离24小时后，肝细胞应血清饥饿4至8小时，然后用于治疗。当研究急性期反应，细胞可以用LPS，这是已知经由Toll样受体4和NF-κB15以诱导炎症进行治疗。促炎细胞因子，如IL-6，通过白介素受体16介导其作用。此外，我们最近证明了FGF23可以激活FGFR4和PLCγ/钙调/ NFAT途径并诱导在肝7,17炎症反应。以确保足够的转录和靶基因的翻译，细胞应为24小时进行治疗。一起使用定量实时PCR与ELISA细胞上清液中分离mRNA和基因表达分析，连续提供，可方便地重复健壮的信息。这允许新的促炎介质，其肝受体和它们连续的下游信号机制的研究。相比普通癌细胞系如HepG2和Hep3B细胞时分离的原代细胞，特别是从转基因动物将提供优异的结果。由于其简单，这种方法也可用于筛检以调查的新颖的药物的效果。尽管如此，研究复杂的药理或病理physiological机制将需要额外的验证性实验，主要是在体内设置。
因为孤立的肝细胞往往一两天内去分化我们还没有进行长期研究。然而，这可以通过特殊的细胞培养技术来克服，如由其他人18报告。这些包括胶原双凝胶结构，肝细胞的球状体，共培养的内皮细胞，和微图案化共培养与3T3-J2成纤维细胞。综合起来，主要的成年小鼠肝细胞的分离为有兴趣在代谢，炎症，免疫及药物和毒素肝响应科学家强大的工具。它的特点是简单可行，适中的成本和快速的再现。
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Disclosures
作者有没有利益冲突申报。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（R01HL128714到CF）和（F31DK10236101到KS）和美国心脏协会（CF和AG）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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