Summary
여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.
Abstract
간은 전신적인 염증 반응의 조절에 결정적인 역할을한다. 특히 만성 신장 질환, 간은 요독, 산화 스트레스, 내 독소 혈증 및 급성기 반응물의 대량 생산으로 염증성 사이토 카인 순환 감소 간격에 응답하여 반응한다. 염증 및 간세포의 기본 역할 실험 도구 연구는 만성 신장 질환으로 특히 복잡한 설정에서 규제와 간 사이토 카인의 기여 전신 급성 위상 응답 및 연장 염증성 시나리오를 이해하기 중요하다. 생체 내에서 염증의 복잡한 메커니즘을 연구하는 것은 도전 남아 있기 때문에, 리소스를 많이 사용하는 보통 및 형질 전환 동물의 사용을 필요로 차 격리 된 간세포는 간 급성 위상 응답으로 기계적인 통찰력을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 체외 기술은 적당한 비용을 갖추고 있기 때문에, 높은 재생산성 및 일반적인 기술 지식은 주 절연 간세포 쉽게 스크리닝 방법으로 사용될 수있다. 여기, 우리는 기본 쥐의 간세포를 분리하는 효소 기반의 방법을 설명하고, 우리는 ELISA 및 정량 실시간 PCR을 사용하여 이러한 세포에서 염증 반응의 평가에 대해 설명합니다.
Introduction
만성 신장 질환 (CKD)는 급성 및 만성 염증 (1)의 상태로 정의 될 수있다. CKD 환자에서 phosphaturic 호르몬 섬유 아세포 성장 인자 23 (FGF23)의 혈중 농도가 점진적 혈청 인산염이 항상성을 유지하기 위해 증가. 증가 된 혈청 FGF23 수준은 독립적으로 혈액 투석 치료 3, 4를 시작하는 환자 중 심혈 관계 이환율과 사망률과 연관되어 있습니다. 또한, 여러 임상 연구 상승 FGF23 수준 및 C 반응성 단백질 (CRP), 인터루킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) (5), (6)의 혈청 레벨 사이의 강한 상관 관계를 보여 주었다. 또한, 실험 연구에서, 우리는 최근에 FGF23 직접 간세포를 대상으로하고 증가 CRP와 IL-6 페이지에 의한 염증 반응을 일으킬 수 있다는 것을 증명하고있다간 7 roduction. 따라서, FGF23는 CKD에 전신 염증에 기여하는 순환 요인으로 작용할 수 있습니다.
70 년대 초, 차 간세포는 고립되었다 처음으로 8 공부했다. 이후 일차 배양 된 간 세포는 광범위하게, 열 처리는 대사 호르몬 기능 약물 대사 및 독성뿐만 아니라 면역 및 염증 반응을 조사 구하는데 사용되어왔다. 이전 프로토콜은 주로 인간 간 조직 (11) (12)로부터 일차 간세포의 효소 격리 설명 하였다. 우수한 모델이지만,이 복합 간 시그널링 메커니즘뿐만 아니라 자극의 종류에 따라 기능적 결과에 미치는 영향을 연구하는 유전자 조작 능력을 남긴다. 이하에서, 우리는 기본 쥐 간세포의 단리를 설명. 특히, 예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), IL-6와 같은 FGF23 간 급성 단계 반응의 여러 매개체의 효과는 쉽게 빠르고 재현성있는 방법 (13)에 분석 될 수있다.
여기서, 우리는 성체 생쥐에서 간세포의 효소 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 우리는 LPS 및 IL-6과 같은 FGF23 같은 신규 염증성 매개체로서 염증 확립 유도제는 직접 발현 및 분비를 자극 할 수 있음을 입증 이러한 배양 간세포 CRP 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 프로토콜과 실험 절차는 의학의 마이애미 밀러 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 준비
- 데우고 간 관류 미디어 간 37 ℃에서 수욕 미디어 다이제스트.
- 관류 펌프 (30 mL / 분)를 설정합니다. 조심스럽게 간 관류 미디어와 펌프의 배관 시스템을 미리 기입. 시스템의 모든 공기 방울을 피하고 정위 현미경을 준비합니다.
- I 제조사의 프로토콜에 따라 콜라겐 타입을 사용 외투 세포 배양 접시.
2. 간 복구
- 산소 / 흡입 이소 플루 란 (이소 플루 4 % / 2 L / min의 산소)를 이용하여 공여 마우스를 마취.
- 2-2.5 %의 이소 플루 란을 저하 또는 마취제를 주입하여 마취를 유지한다 (100 ㎎ / ㎏ 복강 신체 체중)과 자일 라진 (체중이 10 ㎎ / kg intraperitoneally). 연속 이소 플루 란 마취 케타민 혈압을 낮추고 간독성을 유발할 수 있기 때문에 바람직하다.
- 흡수 패드에 마취 마우스를 놓습니다. 접착 테이프로 마우스의 사지를 고정합니다.
- 면도와 마우스의 복부를 소독하고 선명한 / 무딘 팁 수술 가위를 사용하여 간의 두개골 경계에 치골에서 복부 개복술을 수행합니다. 양측 복벽, 진동판의 꼬리를 절개.
- 심하게 우측으로 부위를 이동하여 하대 정맥 (IVC)을 노출. 조심스럽게 멸균 솜 팁 면봉와 각도 팁 집게를 사용하여 IVC 주변의 지방 조직을 해부하다.
- suprahepatic 다이어프램을 절개하고 선명한 / 날카로운 팁 미세 수술 가위를 사용하여 두 개의 횡 절개하여 흉강을 엽니 다. 흉부 IVC는 수술 실크 (5/0)를 사용하여 결찰.
- 조심스럽게 바늘을 제거, 차폐 정맥 카테터를 사용하여 infrarenal IVC를 Cannulate관류 펌프를 연결하고 간을 관류 시작합니다. 제대로 수행 한 경우, 간은 즉시 희게하고 팽창하기 시작한다.
- 미세 수술 가위를 사용하여 혈액 및 관류 미디어의 적절한 배수를 허용 정 맥 포털을 가로로 쪼개다.
- 간 관류 매체의 약 30 ㎖로 간을 관류하고 용지 (30 ㎖)를 소화 간 전환. 관류 펌프를 끄고 관류가 완료되면 정맥을 제거합니다.
- 부드럽게 간의 중심 영역을 노출하고 간 로브를 연결하는 연결 조직을 찾습니다. 중앙 연결 섬유를 잡고 조심스럽게 자리에 간을 들고 모든 조직을 해부 살짝 간을 제거합니다.
- 즉시 소화 매체 간 15ml를 함유하는 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 간을 옮긴다.
참고 :이 단계에 대한 구체적인 타임 라인이 없습니다. 재관류 후, 간은 무균 세포 배양 후드에 전송을 위해 다이제스트 미디어에 남아 있습니다. 모든이야ubsequent 단계가 무균 환경에서 수행되어야한다.
세포의 3. 분리 및 치료
- 세포 배양 후드 내 멸균 조직 배양 접시에 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 함유 소화 매체 간을 옮긴다.
- 멸균 포셉 사용하여 부드럽게 간의 네 로브 눈물. 제대로 수행 한 경우, 소화 매체 인해 간에서 간세포를 분리에 혼탁이 될 것이다.
- 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 소화 조직 입자 및 세포 파편을 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통해 혼탁 소화 매체 필터.
- 반복 3.2 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 3.3 단계. 이는 간에서 잔류 간세포를 분리하여 지원한다.
- 4 ℃에서 2 분 50 XG에 원심 분리기. 25 mL의 차가운 1X 세포를 다시 일시 중지 부드럽게 초과 세포 파편을 포함 뜨는을 기음과윌리엄스 '중간 E.
- 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 청소기 현탁액을 달성하기 위해 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 새로운 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 재 현탁액을 필터.
- 반복 3.5 및 명확한 세포 현탁액을 얻기 위해 추운 윌리엄스 '중간 E 1X를 사용하여 세 개의 추가 세척 3.6 단계를 반복합니다.
- 최종 세척 단계 후, 흡 상등액 초과 균체 잔사를 제거했다. 다시 일시 중지하고 50 mL의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 새로운 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 25 mL의 따뜻한 윌리엄스 '미디어 E 1 배속에서 필터 세포.
- 혈구를 사용하여 25 ㎖의 세포 현탁액 내의 셀 개수. 성인 간 당 2000 만 셀 - 평균적으로 15을 기대합니다. 트리 판 블루 염색을 사용하여 세포 생존을 결정합니다.
- 콜라겐 코팅 6 잘 가전에 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 2 mL의 '윌리엄스의 미디어 E 1 배속에서 플레이트 세포LL 문화 클러스터 (물론 당 9 × 10 5 세포).
- 4 시간 후, 차 간세포 유지 보수 보충제를 포함 윌리엄스 '미디어 E 1 배속 미디어를 변경합니다.
- 24 시간 후, 혈청 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) 미디어 1 배 6 시간 동안 세포를 굶어.
- 차량 FGF23 (25 NG / ㎖), LPS로 PBS로 세포를 처리 (100 μg의 / ㎖) 또는 무 혈청 배지에서 IL-6 (50 ng의 / ㎖) 및 24 시간 동안 배양한다.
RNA 4. 분리
- 제조업체의 지시에 따라 상용 스핀 컬럼 키트를 사용하여 RNA를 준비한다.
역전사에 의해 고립 된 RNA 5. 생성 된 cDNA
- PCR의 튜브에 고립 된 RNA 샘플의 200 NG를 추가합니다.
- 단계 5.1에서 효소가없는 H 2 O PCR에 튜브 14 μL를 추가합니다.
- 단계 5.1에서 PCR 튜브에 역전사 효소의 4 μL를 추가합니다.
- 혼합물이 균일하게 부드럽게 내용을 다시 중단; 부드럽게 원심 분리기. 열 순환기에 혼합물을 포함하는 PCR 튜브를 놓습니다. 실행 역전사에 대한 열 순환기 : 다음 25 ° C (5 분), 42 ° C (30 분)의 1주기, 85 ° C (5 분)와 4 ° C에서 개최합니다. 최종 제품은 원하는 cDNA를 할 것이다.
6. 정량적 실시간 PCR에 의한 세포의 분석 (qPCR에)
- 96 웰 플레이트를 준비합니다.
- 1 μL의 cDNA, 0.25 μM 정방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머, 5 μL SYBR 녹색, 10 μL의 총 부피 3.5 μL PCR 등급 물 : 얼음에 qPCR에 반응의 모든 구성 요소를 배치합니다. SYBR 녹색을 사용하여, 세중의 모든 샘플을 실행하는 마스터 믹스를 준비합니다.
- 마스터 믹스가 완료되면 소용돌이는 균질 확인합니다. 96 WLL 플레이트의 각 웰에 나누어지는 9 μL qPCR에의 마스터 믹스. 후 신중하게 잘 각각에 cDNA를 1 μL를 추가합니다. 총 반응 부피는 10 μL 될 것입니다.
- 로딩이 완료된 후 광 96 웰 플레이트를 밀봉접착 필름 간단히 원심 분리기 96 웰 플레이트 (1 분 50 XG).
- 리얼 타임 PCR 기기에서 실행 샘플. 실시간-PCR 기기에 밀봉 된 96 웰 플레이트 및 장비 제조업체 권장 사항에 따라 실행 샘플을 놓습니다. 표준 및 빠른 사이클의 예는 아래에 포함되어 있습니다.
- 60 초 동안, 15 초 동안 다음, 120 초 동안 94 ° C에서 60 ° C를 94 ° C의 40주기를 초기 변성 한 다음 선택적으로 4 ° C에서 개최 : 표준 사이클 파라미터를 들어, 다음을 사용합니다.
- 빠른 순환 매개 변수의 경우 : 5 초, 15 초 동안 58 ° C, 10 초 동안 다음 72 ° C에 대해 다음 30 초 동안 95 ° C의 40주기를 94 ° C에서 초기 변성 다음을 사용합니다.
- 데이터를 분석하는 방법에 대한 지침은 장비 설명서를 참조하십시오.
ELISA에 의한 세포 상층 액 7. 분석
참고 : 제조사의 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행합니다.
- 별도의 튜브에 희석제 398 μL를 분배. 398 μL 희석액 튜브에 세포 상층 액 샘플의 피펫 2 μL. 이것은 200의 희석 배를 제공 할 것입니다.
- 각 샘플 단계를 반복 7.1.1 테스트 할 수 있습니다.
- 피펫 100 내지 200 배 희석 한 시료와 μL를 96 웰 플레이트의 웰에 표준.
- 150 rpm에서 마이크로 플레이트 쉐이커상에서 45 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션.
- 우물을 1 배 세척 완충액으로 5 회 반복한다. 마지막으로 세탁이 완료되면, 흡수지 모든 잔여 세척액을 제거한다.
- 각 웰에 HRP-복합 시약 500 μL를 추가합니다.
- 7.2.3 - 반복 7.2.2 단계를 반복합니다.
- 테트라 메틸 벤지딘의 피펫 100 μL (TMB) 96 웰 플레이트의 각 웰에 시약.
- 부드럽게 마이크로 플레이트에서 20 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트 믹스150 rpm에서 진탕. 직접 각 웰에 정지 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 정지하고 부드럽게 혼합한다. 정지 용액을 첨가 한 후에 색깔이 황색 회전한다. 이것은 정지 용액 정확하게 혼합되었음을 알린다.
- 미세 적정 플레이트 판독기를 사용하여, 처음 5 분 이내에 450 nm에서의 광학 밀도를 결정한다.
- 각각의 샘플 및 각 표준에 대한 평균 흡광도 값 (A 450)의 표를 계산합니다.
- NG에 표준 농도에 대한 각 기준의 450 평균 음모를 꾸미고하여 표준 곡선을 조립 / 선형 그래프 mL로. X 축이 농도 및 450의 값을 나타내는 Y 축를 대표 할 수있다.
- (가) 각 희석 된 시료에서 450 의미 이용하여, 표준 곡선으로부터 NG / ㎖에서 목적 단백질의 농도를 결정한다.
- 사실상 희석하여 샘플의 농도를 곱아르 자형. 이것은 세포 상등액 시료 중에 목적 단백질의 실제 농도를 결정하기 위해 허용 할 것이다.
- 선 그래프로 샘플에서 구성된 테이블을 플롯. OD 450 값이 표준 곡선의 밖에있는 경우, 샘플을 적절하게 희석해야하고 다시 테스트.
- 500,000 셀에 결과를 정상화.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
조직학
기본 격리 및 배양 된 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는도 1a에 도시되어있다. 면역 조직 화학적 분석은 절연 간세포 높은 알부민 (적색)뿐만 아니라, 섬유 아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (녹색)을 표현할 수 있음을 보여준다. 핵 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (파란색)로 염색된다. (그림 1B).
정량적 실시간 PCR
주 절연 간세포 FGF23 처리 (25 NG / ㎖) LPS 또는 IL-6, 24 시간 및 CRP 및 IL-6 mRNA의 수준 (50 NG / ㎖) 정량적 실시간 PCR에 의해 분석 하였다 (/ ㎖ 100 μg의) . FGF23, LPS 및 IL-6이 크게 CRP와 IL-6의 발현을 증가했다. (도 2a)
절연 일차 간세포의 세포 배양 상청액 CRP 수준에 대해 ELISA로 분석 하였다. PBS-처리 된 세포에 비해 우리의 정량적 실시간 PCR 분석, LPS와 라인에서, IL-6과 FGF23의 치료는 크게 세포 상층 액에서 CRP 수치를 증가했다. (그림 2B)
그림 1 : 격리 된 쥐의 차 간세포의 (A) 위상 대비 현미경 이미지. 24시간 도금 후, 세포는 육각형 형상을 나타내고, 종종 이중 핵 나타난다. (= 100 μm의 스케일 바); (B) 면역 형광 현미경 분석은 분리 된 세포의 대부분 알부민 (적색), 간세포 특이 적 마커를 표현하는 것을 보여준다. 세포는 매우 FGFR4 (녹색)를 표현한다. DAPI는 핵을 얼룩. 원래 배율 (40)X. (스케일 바 = 50 μm의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 격리 된 쥐 차 간세포의 정량적 실시간 PCR 분석 CRP와 IL-6 발현을 결정합니다. PBS 처리 된 세포와 비교했을 때 (A) LPS는, IL-6, FGF23 치료 크게 CRP의 mRNA 수준을 증가시킨다. (값이 SEM ± 배의 변화로 표현; p <0.01, N = 3 독립적 인 절연 부). PBS 치료에 비해 LPS로 처리 (B) 세포는 IL-6 또는 FGF23 또한 IL-6 mRNA 수준의 상당한 증가를 나타낸다. (값은 ± SEM 배 변화로 표현되고, p <0.001, N = 3 독립 아이솔레이션) CRP 단백질 수준의 (C)에 정량효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 격리 된 쥐의 차 간세포에서 상층 액. PBS 치료에 비해 LPS, IL-6, CRP FGF23 크게 단백질의 수준을 증가시킨다. 값은 50 만 셀 당 밀리그램 / DL에서 CRP 농도를 나타냅니다. (p <0.05, N = 3 독립 아이솔레이션). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
마우스에서 차 간세포를 분리하면 염증 반응 생체를 연구하는 빠르고, 저렴하고 신뢰할 수있는 도구입니다. 정확하게 수행하면 결과가 쉽게 발생하고, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 재생 될 수있다. 다음 사항을 신중 성공적인 차단을 보장하기 위해 평가되어야한다.
수술 절개와 IVC의 삽관은 전신 마취가 아닌 안락사 후 수행해야합니다. 젊은, 경험이 연구자는 쥐의 복부의 해부학 적 특징을 숙지하고 올바른 삽관을 수행하기 위해 처음에 더 많은 시간이 필요합니다. 기증자 동물이 살아 유지 관류 크게 분리 된 세포의 생존을 증가, 시작할 때까지. 그것은 상당히 고립 된 간세포의 수율을 증가하기 때문에 위에-간 IVC의 결찰이 수행되어야한다. 대안 적으로, 마이크로 수술 클램프는 IVC에 배치 될 수있다.그러나, 개흉술 다음, 동물은 몇 분 내에 사망하게 될 것이다. 따라서 모든 후속 단계는 간 관류 개시까지 충분한 혈액 흐름을 유지하도록 신속하게 수행되어야한다. 삽관를 들어, 개폐식 정맥 카테터의 사용은 매우 좋습니다. 하대 정맥을 cannulating 후 카테터 바늘 신중 혈관 천공의 위험을 최소화하는, 후퇴 할 수있다. 마지막 중요 단계는 카테터 관류 시스템에 연결된다. 카테터로부터 바늘을 제거한 후, 혈액 관류 펌프에 연결하기 전에 카테터의 단부로부터 배출한다. 이 단계는 양의 상당한 감소뿐만 아니라 고립 된 셀의 품질을 일으킬 수 공기 색전의 위험을 최소화한다.
관류 개시되면 간 즉시 균일 담황색 적색에서 색을 변경한다. 부품 남아있는 붉은 insuffic을 나타냅니다ient 관류 또는 공기 색전의 존재. 분리 된 세포의 세척 및 필터링 반복적으로 수행해야합니다. 이것은 과도한 세포 파편의 효율적인 제거를 보장한다. 건강한 고립 된 간세포 도금되는 최초의 4 시간 이내에 준수합니다. 따라서, 도금 매체는이 시점에서 유지 매체에 변경할 수있다. 밤새 배양 한 후, 세포는 저명한 핵으로 더 육각형 모양으로 나타납니다. 간세포는 양방향 핵 (그림 1A)를 할 수 있습니다. 과립 또는 세포에 blebbing은 가난한 분리를위한 지표이다. 간세포 연속적 올바르게 부착되지 또는 세포 생존을 낮게 유지하면, 관류에 사용되는 분해 매질의 양을 변경한다. 이 오버 피하거나 간 조직의 underdigestion한다.
세포의 높은 수율이 요구되는 경우, 문맥을 통해 관류 선행 성이 수행 될 수있다. Klaunig 등. 이 특별한 기술은 총 세포 수율을 증가시킬 수 있음을 보여 주었다. Alt 키ernatively의 IVC의 다음 포털 정맥 삽관 간헐적 물림쇠 적용 할 수있다. 이는 주기적으로 분리 된 세포의 수를 증가시킬 수 아마도 또한 관류시의 압력을 증가시킬 것이다. 관류 시간뿐만 아니라 혈류 속도는 14을 조정해야 할 수도 있습니다. 그러나 우리는 다른 관류 프로토콜을 수행하지 않았다.
제 성공적인 차단 후 (예 : 알부민) 간세포 특이 면역은 분리 (도 1B)의 순도를 보장하기 위해 수행되어야한다. 분리 후 24 시간은 간세포 혈청은 4 ~ 8 시간 동안 굶어 후 치료에 사용한다. 급성기 반응을 연구 할 때, 세포는 수신자 같은 수용체 4, NF-κB (15)를 통해 염증 반응을 유도하는 것으로 알려져 LPS로 처리 될 수있다. 이러한 IL-6과 같은 염증성 사이토 카인, 인터루킨 16 수용체를 통해 효과를 매개한다.또한, 우리는 최근에 FGF23가 FGFR4과 PLCγ / 칼시 뉴린 / NFAT 경로를 활성화하고 간 (7), (17)의 염증 반응을 유도 할 수 있음을 증명하고있다. 충분한 전사 및 표적 유전자의 번역을 보장하기 위해 세포는 24 시간 동안 치료를해야합니다. 세포 상등액의 ELISA와 함께 정량적 실시간 PCR을 사용하여 mRNA의 유전자 발현의 연속 분석을 분리하면 쉽게 반복 될 수 강력한 정보를 제공한다. 이 소설 염증성 매개체, 그 간 수용체 및 연속 다운 스트림 신호 메커니즘의 조사를 할 수 있습니다. 이러한 인 HepG2 세포로 Hep3B와 같은 일반 암 세포주에 비해, 특히 트랜스 제닉 동물로부터 분리 된 일차 전지는, 우수한 결과를 제공 할 것이다. 단순하기 때문에,이 방법은 또한 신규 한 약물의 효과를 조사하기 위하여 검사를 위해 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 복잡한 약물 학적 또는 병리 - physiolo 공부학적 메커니즘은 주로 생체 설정에서 추가 확인 용 실험이 필요합니다.
격리 된 간세포가 며칠 내에 탈분화하는 경향이 있기 때문에 우리는 장기 연구를 수행하지 않았습니다. 등 (18)에 의해보고 그러나, 이것은 특별한 세포 배양 기술에 의해 극복 될 수있다. 이러한 콜라겐 이중 젤 구성, 간세포 구 상체, 내피 세포와 공동 배양 및 3T3-J2 섬유 아 세포와 미세 패턴 공동 문화를 포함한다. 함께 차 쥐의 성인 간세포의 분리는 대사 체학, 염증, 면역 및 약물과 독소에 간 반응에 관심이 과학자를위한 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 단순한 가능성, 적당한 비용과 빠른 재현성을 특징으로한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언하는 이익의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (R01HL128714 CF에) 및 (KS에 F31DK10236101)와 미국 심장 협회 (CF와 AG)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
