Summary
Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.
Abstract
De lever speelt een beslissende rol in de regulering van systemische ontsteking. Bij chronische nierziekte in het bijzonder de lever reageert in reactie op de uremische milieu, oxidatieve stress, endotoxemie en verminderde klaring van circulerend proinflammatoire cytokinen door het produceren van een groot aantal acute fase reactanten. Experimentele instrumenten te bestuderen ontsteking en de achterliggende rol van hepatocyten zijn cruciaal voor de regulering en de bijdrage van hepatische cytokinen ze systemisch acute fase respons en langere pro-inflammatoire scenario, vooral in een ingewikkelde omgeving begrijpen zoals chronische nierziekte. Aangezien het bestuderen van complexe mechanismen van een ontsteking in vivo uitdagend blijft, resource-intensieve en meestal vereist het gebruik van transgene dieren, primaire geïsoleerde hepatocyten zorgen voor een robuust hulpmiddel om mechanistische inzicht te krijgen in de lever acutefasereactie. Aangezien dit in vitro techniek beschikt over een matige kosten, hoge reproduceerbaarheid en gemeenschappelijke technische kennis, geïsoleerde primaire hepatocyten kunnen ook gemakkelijk worden gebruikt als een screening aanpak. We beschrijven hier een enzymatische methode gebaseerd op primaire muizen hepatocyten te isoleren en beschrijven we de beoordeling van een ontstekingsreactie in deze cellen middels ELISA en kwantitatieve real-time PCR.
Introduction
Chronische nierziekte (CKD) kan worden gedefinieerd als een toestand van acute en chronische ontsteking 1. Bij patiënten met CKD, serum niveaus van het hormoon phosphaturic fibroblast groeifactor 23 (FGF23) geleidelijk stijgen, om het serum fosfaat homeostase 2 te handhaven. Verhoogde serum niveaus FGF23 onafhankelijk geassocieerd met cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die beginnen hemodialysebehandeling 3, 4. Bovendien hebben verschillende klinische studies aangetoond een sterke correlatie tussen verhoogde niveaus FGF23 en serum niveaus van C-reactief proteïne (CRP), interleukine-6 (IL-6) en tumornecrosefactor α (TNFa) 5, 6. Bovendien is in een experimentele studie werd onlangs aangetoond dat FGF23 direct richten hepatocyten en een ontstekingsreactie door het verhogen CRP en IL-6 p veroorzakenroduction in de lever 7. Daarom FGF23 kan fungeren als een circulerende factor die bijdraagt aan systemische ontsteking in CKD.
In de vroege jaren '70, de primaire hepatocyten werden geïsoleerd en bestudeerd voor de eerste keer 8. Sindsdien primair gekweekte levercellen zijn uitgebreid gebruikt metabolische verwerking, hormonale functie, metabolisme en toxiciteit en immuniteit en ontstekingsreacties 9 onderzoeken 10. Vorige protocollen zijn voornamelijk de enzymatische isolatie van primaire hepatocyten uit menselijk leverweefsel 11, 12. Terwijl een uitstekend model, laat dit uit de mogelijkheid om te onderzoeken hoe genetische manipulatie beïnvloedt complex lever signalering mechanismen evenals functionele gevolgen op verschillende soorten stimuli. Hieronder beschrijven we de isolatie van muizen hepatocyten. Met name kan het effect van verschillende mediatoren van de hepatische acute fase respons, zoals lipopolysaccharide (LPS), IL-6 en FGF23 worden geanalyseerd op een gemakkelijke, snelle en reproduceerbare wijze 13.
Hierin presenteren we een protocol voor de enzymatische isolatie van hepatocyten van volwassen muizen, en we tonen aan dat vastgesteld inductoren van ontsteking, zoals LPS en IL-6, alsook nieuwe ontstekingsmediatoren zoals FGF23 rechtstreeks expressie en uitscheiding van kunnen stimuleren inflammatoire cytokines, zoals CRP en IL-6 in gekweekte hepatocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren protocollen en experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller School of Medicine.
1. Voorbereiding
- Verwarm leverperfusie media en lever verteren media in een waterbad bij 37 ° C.
- Stel een perfusie pomp (30 ml / min). Zorgvuldig Prefill de slang systeem van de pomp met leverperfusie media. Vermijd luchtbellen in het systeem en de voorbereiding van de stereotactische microscoop.
- Coat celcultuurschalen middels collageen type I volgens het protocol van de fabrikant.
2. Lever Recovery
- Verdoven van de donor muis met behulp van zuurstof / isofluraan inhalatie (isofluraan 4% / 2 L / min zuurstof).
- Handhaaf anesthesie door verlaging isofluraan 2-2,5% of door injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal) en xylazine (10 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneally). Continue isofluraan anesthesie voorkeur aangezien ketamine verlaagt de bloeddruk en hepatotoxiciteit veroorzaken.
- Plaats de verdoofde muis op een absorberend kussen. Bevestig de ledematen van de muis met plakband.
- Scheer en desinfecteer de buik van de muis en het uitvoeren van een ventrale laparotomie van het schaambeen naar de craniale rand van de lever met behulp van chirurgische schaar met scherpe / stompe uiteinden. Incise de buikwand aan beide zijden, staart van het middenrif.
- Expose de vena cava inferior (IVC) door voorzichtig het verplaatsen van de darm naar de rechterkant. ontleden zorgvuldig vetweefsel rond de IVC met behulp van steriele wattenstaafje swabs en schuine tip tang.
- Incise de suprahepatic diafragma en open de borstholte door twee laterale incisies met behulp van fijne chirurgische schaar met scherpe / scherpe tips. Afbinden de thoracale IVC met behulp van chirurgische zijde (5/0).
- Canule de infrarenale IVC met behulp van een afgeschermde iv catheter, verwijder voorzichtig de naald,sluit de perfusie pomp en start perfuseren de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de lever onmiddellijk beginnen te blancheren en deining.
- Doorsnijden de poortader zodat geschikte afvoer van bloed en perfusie media met behulp van fijne chirurgische schaar.
- Perfuseren van de lever, waarbij ongeveer 30 ml leverperfusie media, en dan overschakelen naar de lever te verteren media (30 ml). Schakel de perfusie pomp en verwijder de canule eenmaal perfusie is voltooid.
- Voorzichtig bloot de centrale regio van de lever en zoek het bindweefsel tussen de lever lobben. Pak de centrale aansluiten van vezels en zorgvuldig te ontleden alle weefsels die de lever op zijn plaats en verwijder voorzichtig de lever.
- Onmiddellijk over de lever in een 50 ml polypropyleen conische buis met 15 ml lever verteren media.
NB: Er is geen specifieke tijd-lijn voor deze stap. Na perfusie, de lever blijft digest media voor het transport naar een steriele celkweek kap. alle subsequent stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving.
3. Isolatie en behandeling van Cellen
- Binnen een celkweek kap, overdracht van de lever van de 50 ml polypropyleen conische buis met de spijsvertering media in een steriele weefselkweek schotel.
- Met behulp van een steriel pincet voorzichtig scheur de vier lobben van de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de spijsvertering medium troebel worden als gevolg van het isoleren van hepatocyten uit de lever.
- Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het troebele spijsvertering medium door een 70 um nylon cel zeef in een nieuwe 50 ml polypropyleen conische buis om onverteerd weefsel deeltjes en celresten te verwijderen.
- Herhaal de stappen 3,2 en 3,3 met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dit helpt bij het verwijderen van eventueel resterend hepatocyten van de lever.
- Centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant bevattende overmaat celafval en voorzichtig resuspendeer cellen in 25 ml koude 1xWilliams 'Medium E.
- Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het re-suspensie door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis aan een schoner schorsing te bereiken.
- Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor drie extra wassingen met koud Williams 'Medium E 1x tot een duidelijker cel suspensie te verkrijgen.
- Na de laatste wasstap, aspiraat supernatant overtollige celresten te verwijderen. Re-schorten en filter cellen in 25 ml warm Williams 'Media E 1x dat de primaire hepatocyt ontdooien en plating supplementen bevat door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis.
- Aantal cellen in de 25 ml celsuspensie met een hemocytometer. Gemiddeld verwachten 15-20000000 cellen per volwassene lever. Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw kleuring.
- Plaat cellen in 2 ml Williams 'Media E 1x dat primaire hepatocyten ontdooien en uitplaten supplementen op een collageen beklede 6-well ce bevatcultuur cluster II (9 x 10 5 cellen per well).
- Na 4 uur, veranderen media om Williams 'Media E 1x dat de primaire hepatocyten onderhoud supplementen bevat.
- Na 24 uur serum verhongeren cellen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) media 1x gedurende 6 uur.
- Behandel de cellen met PBS als drager, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 ug / ml) of IL-6 (50 ng / ml) in serumvrij medium en incubeer gedurende 24 uur.
4. Isolatie van RNA
- Bereid RNA onder toepassing van een commerciële spin kolom kit volgens instructies van de fabrikant.
5. Het genereren van cDNA uit geïsoleerde RNA door reverse transcriptie
- Voeg 200 ng van geïsoleerde RNA-monster van een PCR-buis.
- Voeg 14 ul van endonuclease-vrij H2O tot PCR-buis van stap 5,1.
- Voeg 4 pi van reverse transcriptase PCR-buis van stap 5,1.
- Re-schorten inhoud zachtjes om mengsel homogeen te maken; centrifuge voorzichtig. Plaats PCR buis met het mengsel in een thermocycler. Run thermocycler voor reverse transcriptie: 1 cyclus van 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) en houdt bij 4 ° C. Het eindproduct zal het gewenste cDNA zijn.
6. Analyse van de cellen door kwantitatieve real-time PCR (qPCR)
- Bereid de 96-well plaat.
- Plaats alle componenten van qPCR reactie op ijs: 1 pi cDNA, 0,25 pM forward primer, 0,25 uM reverse primer, 5 pi SYBR Green, 3,5 pl PCR kwaliteit water tot een totaal volume van 10 pi. Met behulp van SYBR Green, voor te bereiden master mix aan alle monsters lopen in drievoud.
- Zodra de master mix is voltooid, vortex homogene maken. Aliquot 9 pi van qPCR master mix in elk putje van een 96-wll plaat. Na voorzichtig voeg 1 pi van cDNA in elk putje. Totaal reactievolume wordt 10 ul worden.
- Na het laden is voltooid, sluit 96-well plaat met optischekleeffolie en kort centrifugeer 96 putjes (50 x g gedurende 1 min).
- Run monsters in een Real Time-PCR-instrument. Plaats verzegelde 96-well plaat in Real Time-PCR-instrument en lopen monsters per instrument aanbevelingen van de fabrikant. Voorbeelden van standaard en snelle cycli zijn hieronder opgenomen.
- Voor standaard cyclusparameters Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 120 s, vervolgens 40 cycli van 94 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, en vervolgens eventueel houden op 4 ° C.
- Voor snelle cyclusparameters: Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s, 58 ° C gedurende 15 s, en vervolgens 72 ° C gedurende 10 s.
- Raadpleeg instrument handleiding voor aanwijzingen over hoe om gegevens te analyseren.
7. Analyse van celsupernatanten met ELISA
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.
- Verdeel 398 ul verdunningsmiddel in afzonderlijke buisjes. Pipetteer 2 pi van de cel supernatant monster in de buis 398 pi verdunningsmiddel. Dit zal een verdunning van 200 maal verschaffen.
- Herhaal stap 7.1.1 voor elk te testen monster.
- Pipetteer 100 ul van 200-voudig verdunde monster en standaard in de putjes van een 96-wells plaat.
- Incubeer de 96-well plaat bij 25 ° C gedurende 45 min op een microplaat schudinrichting bij 150 rpm.
- Was de putjes 5 keer met 1x wasbuffer oplossing. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, verwijdert u alle resten van het wassen oplossing met absorberend papier.
- Voeg 500 ul HRP-conjugaat reagens in elk putje.
- Herhaal stap 7.2.2 - 7.2.3.
- Pipetteer 100 ul van tetramethylbenzidine (TMB) reagens aan elke well van 96-well plaat.
- Meng 96-puts plaat bij 25 ° C gedurende 20 min op een microplaatschudinrichting bij 150 rpm. Stop de reactie door het direct toevoegen van 100 pl stopoplossing aan elk putje en meng voorzichtig. Zodra de stopoplossing toegevoegd moet de kleur geel. Dit meldt dat de stop oplossing correct is gemengd.
- Met behulp van een microtiter plaatlezer, de extinctie bij 450 nm in de eerste 5 minuten.
- Berekenen een tabel van de gemiddelde absorptiewaarden (A 450) voor elk monster en elke standaard.
- Monteer een standaard kromme door het uitzetten van de gemiddelde A450 van elke standaard tegen de standaardconcentratie in ng / mL op een lineaire grafiek. Laat de x-as de concentratie en de y-as A 450 waarden vertegenwoordigen vertegenwoordigen.
- Gebruik makend van de gemiddelde A450 van elk verdund monster, het gehalte aan het gewenste eiwit in mg / ml van de standaard curve.
- Vermenigvuldig het monster concentratie door de verdunning factor. Dit maakt de bepaling van de werkelijke concentratie van het gewenste eiwit in de cel supernatant monster.
- Plot de geconstrueerde tafel uit monsters in een lijngrafiek. Als OD 450-waarden buiten de standaardkromme vallen, moeten de monsters op geschikte wijze worden verdund en opnieuw getest.
- Normaliseren resultaten 500.000 cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
histologie
Vertegenwoordiger lichtmicroscopie beelden van primaire geïsoleerde en gekweekte cellen zijn weergegeven in figuur 1A. Immunocytochemische analyse toont dat afzonderlijke hepatocyten sterk tot expressie albumine (rood) en fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) (groen). Kernen zijn gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). (Figuur 1B).
Kwantitatieve real-time PCR
Primaire geïsoleerde hepatocyten werden behandeld met FGF23 (25 ng / ml) LPS (100 ug / ml) of IL-6 (50 ng / ml) gedurende 24 uur en mRNA niveaus van CRP en IL-6 werden geanalyseerd door kwantitatieve real-time PCR . FGF23, LPS en IL-6 significant verhoogde expressie van CRP en IL-6. (Figuur 2A)
Celkweek supernatanten van geïsoleerde primaire hepatocyten werden geanalyseerd met behulp van ELISA voor CRP niveaus. Overeenkomstig onze kwantitatieve real-time PCR-analyse, LPS, IL-6 en FGF23 behandelingen aanzienlijk toegenomen CRP niveaus in celsupernatanten in vergelijking met PBS-behandelde cellen. (Figuur 2B)
Figuur 1: (A) Fase contrast microscopische beeld van de geïsoleerde muizen primaire hepatocyten. 24 uur na plating, cellen vertonen een zeshoek-achtige vorm en lijken vaak bi-gekiemd. (Schaal bar = 100 micrometer); (B) Immunofluorescentie microscopische analyse blijkt dat het merendeel van geïsoleerde cellen brengen albumine (rood), een hepatocyt-specifieke marker. Cellen ook zeer te uiten FGFR4 (groen). DAPI kleurt kernen. Original vergroting 40X. (Schaal bar = 50 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve real time PCR analyse van geïsoleerde muizen hepatocyten CRP en IL-6 expressie bepalen. (A) LPS, IL-6 en FGF23 behandelingen aanzienlijk vergroten mRNA niveaus van CRP in vergelijking met PBS-behandelde cellen. (Waarden worden uitgedrukt als fold change ± SEM; p <0,01; n = 3 onafhankelijke isolaties). (B) cellen behandeld met LPS, IL-6 of FGF23 tonen ook een aanzienlijke toename van mRNA-niveaus van IL-6 in vergelijking met PBS behandelingen. (waarden worden uitgedrukt als fold change ± SEM; p <0,001; n = 3 onafhankelijke isolaten) (C) Kwantificering van CRP eiwit niveaussupernatanten van geïsoleerde muizen hepatocyten door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). LPS, IL-6 en FGF23 aanzienlijk toenemen CRP eiwitniveaus in vergelijking met PBS behandelingen. De waarden geven CRP concentraties in mg / dl per 500.000 cellen. (P <0,05, n = 3 onafhankelijke isolaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het isoleren van primaire hepatocyten van muizen is een snel, goedkoop en betrouwbaar hulpmiddel om ontstekingsreacties ex vivo te bestuderen. Indien correct uitgevoerd, kunnen de resultaten eenvoudig worden gegenereerd en gereproduceerd op een tijdige en kostenefficiënte manier. De volgende punten moet zorgvuldig worden beoordeeld met het oog op een succesvolle isolatie te waarborgen.
De chirurgische incisie en de canule van het IVC moet worden uitgevoerd onder algemene verdoving en niet na euthanasie. Een jonge, onervaren onderzoeker zal meer tijd nodig hebben in het begin om vertrouwd te raken met de anatomische kenmerken van de muizen buik te worden en om een correcte infusen verrichten. Houden van de donor dier in leven totdat de perfusie begint, zal de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen aanzienlijk toenemen. Ligatie van de supra-hepatische IVC moet worden uitgevoerd omdat het aanzienlijk de opbrengst van geïsoleerde hepatocyten toenemen. Als alternatief kan een micro-chirurgische klem op de IVC geplaatst.Echter, na thoracotomie, het dier overleden binnen enkele minuten worden. Dus alle volgende stappen moet onmiddellijk worden uitgevoerd om te waarborgen dat de lever houdt voldoende bloedstroom tot de start van de perfusie. Voor de canule, is het gebruik van een intrekbare intraveneuze katheter sterk aanbevolen. Na cannuleren de IVC, kan de katheter naald voorzichtig teruggetrokken, waardoor het risico van perforatie vat minimaliseert. De laatste cruciale stap is de verbinding van het perfusie systeem de katheter. Na verwijdering van de naald uit de katheter moet bloed wegtrekken uit het uiteinde van de katheter voordat aansluit op een perfusiepomp. Deze stap minimaliseert het risico van lucht-emboli, die een aanzienlijke vermindering van de hoeveelheid en de kwaliteit van geïsoleerde cellen kunnen veroorzaken.
Zodra de perfusie wordt gestart, moet de lever onmiddellijk homogeen van kleur veranderen van rood naar een lichtgele. Parts resterende rode zal insuffic aangevenseerde perfusie of de aanwezigheid van lucht-embolie. Wassen en filtering van geïsoleerde cellen moeten herhaaldelijk worden uitgevoerd. Dit garandeert efficiënte verwijdering van overtollige celafval. Geïsoleerd gezond hepatocyten zal zich houden binnen de eerste 4 uur worden verzilverd. Derhalve kan uitplaatmedia worden veranderd onderhoudsmedium op dit tijdstip. Na overnacht incubatie worden cellen blijken in een hexagonale vorm met een prominente nucleus. Hepatocyten kan ook bi-nucleair (Figuur 1A) zijn. Granuleren of cellulaire blebbing is een indicatie voor een slechte isolatie. Als hepatocyten continu niet goed hechten of de levensvatbaarheid van de cellen blijft laag, dient het bedrag van de spijsvertering media gebruikt voor perfusie worden gewijzigd. Dit moet voorkomen dat over- of underdigestion van leverweefsel.
Als een hogere opbrengst aan cellen vereist, kan een anterograde perfusie via de poortader worden uitgevoerd. Klaunig et al. hebben aangetoond dat deze bijzondere techniek kan toenemen totale opbrengst cel. alternatively, kan volgende poortader canule intermitterende clasping van het IVC worden toegepast. Dit zal periodiek de druk te verhogen tijdens de perfusie en vermoedelijk ook het totale aantal geïsoleerde cellen te verhogen. Perfusie tijd en perfusiesnelheid zou moeten worden aangepast 14. We hebben echter niet uitgevoerd alternatieve perfusie protocollen.
Na een eerste succesvolle isolatie moeten een hepatocyt-specifieke immunokleuring (bijvoorbeeld voor albumine) worden uitgevoerd om de zuiverheid van de isolatie (figuur 1B) te waarborgen. 24 uur na isolatie moet hepatocyten serum uitgehongerd gedurende 4-8 uur en vervolgens voor behandelingen. Bij het bestuderen van de acute fase respons, kunnen cellen worden behandeld met LPS, waarvan bekend is dat ontsteking induceren via Toll-like receptor 4 en NF-KB-15. Pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6, mediëren hun effecten bij interleukine receptoren 16.Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat FGF23 FGFR4 en PLCy / calcineurine / NFAT route kan activeren en veroorzaken een ontstekingsreactie in de lever 7, 17. Om voldoende transcriptie en translatie van doelwitgenen te waarborgen, moeten de cellen behandeld gedurende 24 uur. Isoleren van mRNA en opeenvolgende analyse van genexpressie met behulp van kwantitatieve real-time PCR met ELISA van supernatanten biedt krachtige informatie die gemakkelijk kunnen worden herhaald. Dit maakt het onderzoek naar nieuwe pro-inflammatoire mediatoren, de lever receptoren en hun opeenvolgende stroomafwaartse signaleringsmechanismen. Geïsoleerde primaire cellen, in het bijzonder transgene dieren betere resultaten opleveren in vergelijking met generieke kankercellijnen zoals HepG2 en Hep3B cellen. Vanwege zijn eenvoud kan deze benadering worden gebruikt voor screenings om het effect van nieuwe geneesmiddelen te onderzoeken. Niettemin, het bestuderen van complexe farmacologische of patho-physiologische mechanismen extra bevestigende experimenten vereist, vooral in een in vivo omgeving.
We zijn nog niet uitgevoerd op lange termijn studies sinds geïsoleerde levercellen neiging om dedifferentiate binnen een paar dagen. Dit kan echter worden ondervangen door speciale celcultuur technieken, zoals gerapporteerd door anderen 18. Deze omvatten een collageen double-gel configuratie, levercel bolletjes, co-cultuur met endotheelcellen en micropatterned co-kweken met 3T3-J2 fibroblasten. Bij elkaar genomen, het isoleren van primaire muizen volwassen hepatocyten biedt een robuust hulpmiddel voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in metabolomics, ontsteking, immuniteit en de lever reactie op drugs en giftige stoffen. Het wordt gekenmerkt door eenvoudige haalbaarheid, matige kosten en snel reproduceerbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH (R01HL128714 CF) en (F31DK10236101 KS) en de American Heart Association (CF AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
