Summary
הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.
Abstract
מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.
Introduction
בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות 1, 2. מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר טווח (שניות עד דקות) להאכיל בחזרה במהירות אל הלולאה של מכה notransduction ידי שינוי מבני mechanosensitive. למשל, הידבקויות מבוססי integrin לחזק בתגובה מתח דרך שיפוץ cytoskeletal בתיווך GTPase Rho 3, 4, 5. במקביל, מסלולי איתות אחרים מופעלים על שעות וימים לשלוט תכנות גנטי כי בסופו של דבר להשפיע תא גורל 6. בעוד מחקרים רבים הדגישו את השפעת נוקשות מטריקס על דטרמיניזם תא ומחלות פיתוח 1, 2, המנגנונים המולקולריים המדויקים של mechanotransduction בתיווך ההידבקות עדיין להישאר חמקמקים.
גישות שונות פותחו כדי לחקור את ההשפעות של כוחות שנוצר תא או כוחות חיצוניים על התנהגות תא, כוללים מערכות זרימה, העברת אנרגית תהודת קרינת חיישני -tension (סריג) 7,ילדה = "Xref"> 8, תואם מצעים 9, פינצטה המגנטית, פינצטה אופטית 10 ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 11. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזי פאראמגנטי לאפיין מסלולי mechanotransduction בתגובת כוחות tensional להחיל קולטנים הידבקות ספציפיים. חרוזי פאראמגנטי הם חלקיקים כי הפיך למגנט כאשר הניחו שדה מגנטי. לאחר מצופה ליגנד עבור קולטן מסוים, חרוזים אלה מספקים כלים רבים עצמה כדי לחקור את ההשפעות של יישום כוח תאי. שיטה זו תאומת על ידי מספר מחקרים 3, 5, 12 - 17 מציגה את היתרון כדי להקל על ניתוח ביוכימיים בעיקר על תאים חסידים. באמצעות חרוזים מגנטיים דומים מצופה קולגן ואחריו ניתוח ביוכימיים, עבודה מוקדמת דיווחה על עלייהזירחון החלבון טירוזין ו RhoA ההפעלה בתגובה מתח 5, 18, 19. השיטה המתוארת להלן שמשה גם עם פיברונקטין (FN) חרוזים מצופים לאפיין את מסלולי האיתות במורד זרם המתח להחיל integrins 3. במחקר זה, Guilluy et al. המתח עולה כי מפעיל RhoA באמצעות גיוס של הגורמים החליפין נוקלאוטיד שני גואנין (GEFs), LARG ואת GEF-H1, לקומפלקסים הידבקות integrin. מאז, מחקרים אחרים הראו כי GEF-H1 מגויסת לקומפלקסים דבקים בתגובת מתח תא שנוצר באמצעות שיטות שונות 20, 21, הוכחת את החוסן של המתודולוגיה המתוארת כאן. כתוצאה מכך, מופעל RhoA הוצגה לקדם חיזוק הידבקות, דרך שיפוץ cytoskeletal. מערכת זו גם שמשה לחקור מיושם מתח to קולטנים הידבקות תא / תא. יישום של כוחות על חרוזים מגנטיים צופה עם התחום התאי של E-cadherin שהגדיל גיוס vinculin בדומה מתחמי ההידבקות קשור integrin 12. קולינס ועמיתיו ציינו כי יישום של מתח PECAM-1 מקדם integrin ו RhoA הפעלת 13. גישה נוספת ניסיוני באמצעות חרוזים מגנטיים היא חקר מתח להחיל גרעינים בודדים. באמצעות חרוזים מצופים עם נוגדנים כנגד חלבון מעטפת הגרעין nesprin-1, מתחמי מעטפת הגרעין היו מטוהרים כדי להראות שהם מוסדרים באופן דינמי בתגובה מתח מכני 22. תוצאות אלו תומכות האדירות של שיטה זו בחקר מסלולי mechanotransduction. יתר על כן, בעוד מערכות זרימה או כוח המתיחה לעורר תהליכים תאיים כלליים, חרוזים מגנטיים שמתמקדים קולטן הידבקות תא באמצעות אחת הליגנדים קולטן 13, 15.
יתרון נוסף של שיטה זו הוא הבידוד של מתחמי הידבקות באמצעות הליך טיהור זיקה ליגנד פשוט. עובדה ידועה היא כי תוספת של חרוזים מצופים ליגנד לתאים נקשר לקולטנים הידבקות ומשרה את הגיוס של חלבונים הידבקות מספר 23. בקשה נוספת של כוחות כדי חרוזים מגנטיים צופה ליגנד הופכת מתחמי הידבקות אלה לתוך פלטפורמות macromolecular שמתווכים מסלולי איתות מתח תלוי שונים 4, 24. Cell תמוגה ואחריו ריכוז חרוז באמצעות מגנט מתיר את בידודה של פלטפורמות הידבקות. שיטות אחרות להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות כבר שימשו תאים חסיד. הם משלבים crosslinking כימי כדי לחסוך אינטראקציות בין חלבוניםו צעד תמוגה התא על ידי חומר ניקוי ותזרים גזירה או sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28. השלב האחרון הוא האוסף של ממברנות פלזמת גחון וכתוצאה המכילות את מתחמי ההידבקות. בניגוד לשיטות אלה, חרוזים מגנטיים לאפשר רמת טיהור גדולה של מתחמי הידבקות תא על ידי מיקוד סלקטיבי מש' מסוימת של קולטנים הידבקות. חרוזים מגנטיים כבר להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות תאים שאינם חסיד המצורפת microbeads מצופה ליגנד 29, 30. השיטה המתוארת להלן מחק מצבים ביולוגיים שבו כוח מוחל לתקופה ממושכת קצרה (שניות עד דקות). לכן, זה מספק כלי רב עצמה על החקירה היא את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות מטוהריםמסלולי mechanosensitive-איתות במורד הזרם.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות tensional לחלבוני משטח דבק. מגנט ניאודימיום קבע מושם על גבי משטח תרבות הצלחת. פן המוט של המגנט הוא ממוקם בגובה של 6 מ"מ כך שהכח על חרוז מגנטי יחיד 2.8 מיקרומטר הוא קבועים (כ 30-40 pN) 31. משך גירוי מתח נקבע על ידי המפעיל בהתאם המולקולה של ריבית בקנה המידה בעת ההפעלה שלה. תאים הם סוף סוף lysed, מתחמי הידבקות הם מטוהרים על ידי פרדת חרוזים באמצעות מגנט וניתוחי ביוכימיים מעובדים. פרוטוקול זה כולל הכנת חרוזים פאראמגנטי מצופה ליגנד, ואת היישום של מתח באמצעות מגנט ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח להחיל ADH מבוסס integrinesions גורם שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ליגנד הצמידה כדי חרוזים מגנטיים
הערה: נטיה ליגנד מתבצע באמצעות חרוזים פאראמגנטי המופעל Tosyl עם 2.8 מיקרומטר קוטר (ריכוז פתרון המניות 10 8 חרוזים / מ"ל, 30 חרוזים מ"ג / מ"ל). הפרוטוקול הבא מבוסס על דגימות של כ 2 x 10 5 תאים, אשר מתאימות MRC-5 תאים שגודלו 80% confluency בצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ. כוון את עוצמת הקול של חרוזים ריאגנטים בהתאם אם באמצעות צלחות בגדלים או תאים שונים בהתלכדויות שונות. השתמש בסכום של חרוזי פאראמגנטי כדי שיהיו 2 חרוזים לכל תא. לכן, 4 x 10 5 חרוזים נדרשים על צלחת 60 מ"מ.
- ביסודיות resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing לפחות 30 שניות. Aliquot 40 μL של חרוזים פאראמגנטי מושעים (המקביל ל 4 x 10 6 חרוזים) כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- מניחים את הצינור על separati מגנטיעל דוכן על מנת להפריד החרוזים המגנטיים מהפתרון. בטל supernatant, להסיר את צינורית מדוכן הפרדה מגנטי ו resuspend את החרוזים ב 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
- השלב לשטוף וחזור פעמיים עם 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
- לאחר שטיפה של דבר, resuspend את החרוזים ב 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
- מערבבים 100 מיקרוגרם שור פיברונקטין (FN) או כל ליגנד רצפטור הידבקות תאים אחרים אל pH 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט 7.4 המכילה חרוזים ומערבבים ידי pipetting.
- חזור על שלבים קודמים על ידי החלפת FN או כל ליגנד ספציפי אחר עם BSA, פולי- D- ליזין או apo-transferrin עבור פקדים שליליים.
- לחלופין, לניתוח ג'ל, לקחת aliquot 10 μL של פתרון ליגנד עבור ניתוח יעילות crosslinking ומערבבים עם נפח מתאים של חיץ מדגם Laemmli מרוכז.
- דגירה חרוזים עם תמיסה המכילה ליגנד 12-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על הרוטור.
- אם מצרף חרוזים להופיע לאחר התגובה התרחשה, sonicate (חשמל רציף 39 W) לכל היותר 10-20 s.
- לבודד את החרוזים באמצעות עמדת פרדה מגנטית, לשאוב את הפתרון הנותרים ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS / 0.2% BSA pH 7.6 פתרון. דגירה של 1 ש 'על הרוטור על 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף חרוזים באמצעות פעמיים מגנט עם 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6.
- חרוזים Sonicate אם אגרגטים להופיע לכל היותר 20-30 s.
- לחלופין, להסיר aliquot 10 μL בניתוח היעילות צימוד ידי כתם המערבי (לערבב עם נפח מתאים של חיץ מדגם מרוכז Laemmli).
- המשך לתא מבחנים או חרוזי חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
- לחלופין, להפעיל ג'ל SDS-PAGE ו כתם כחול Coomassie לנתח crosslinking FN כדי חרוזים מגנטיים.
2. יישום של כוחות Tensional על חרוזים מצופים ליגנד Bound הידבקות קולטנים על הגבפני השטח של תאים
- תאי חסיד תרבות על צלחת תרבות 60 מ"מ רקמה במדיום גידול מתאים (בדרך כלל DMEM 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז בתוספת FCS 10%) עד שמגיע 80% confluency.
- הכן חיץ תמוגה הלא denaturing הלא יוניים (20 מ"מ טריס HCl 7.6 pH, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 0.1% NP-40) וצינורות צמרמורת microcentrifuge.
- גלולה חרוזים מצופים ליגנד ממדור 1.10 ו resuspend ב 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. הוספת 100 μL של פתרון חרוזים מצופים ליגנד עד 5 מ"ל של מדיום מערבולת תרבות חמים.
- לשאוב בינוני בצלחת תרבות 60 מ"מ ולהוסיף 5 מ"ל מדיום הגידול חם בתוספת חרוזים.
- דגירה של 20 דקות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר החרוזים משקעים לדבוק תאים. זה חיוני כדי לא יעלה על 20 דקות מאז חרוזים ניתן הפנימו ידי phagocytosis.
- לחלופין, להתבונן החרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות obje 10X או 20Xctive ולבדוק הידבקות חרוז ידי טלטול צלחת להפלות בין מצורף צף חרוזים מעט.
- תוך שמירה על תרבות הצלחת בחממה, להחליף את מכסת הצלחת הנורמלית מכסה עם מגנט ניאודימיום עגול 38 מ"מ המצורפת על הפנים העליון. המגנט מוחזק במקום על ידי שני מגנטי ניאודימיום קטנים 13 מ"מ ממוקמים בחלק התחתון של הפנים של המכסה. מאז המגנטים הם מאוד חזקים, לתפעל אותם בקפידה.
- דגירת תאים נתונים מתח עבור נקודות הזמן הרצויות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- לאחר הטיפול, מניחים צלחת על הקרח ובזהירות לשאוב את המדיום כולו מצלחת.
- הוספת 300 μL של חיץ תמוגה התא, דגירה במשך 10 דקות על הקרח. אסוף את lysate באמצעות תא מגרד והעברת צינור microcentrifuge מראש צונן 1.5 מ"ל.
- גלולת החרוזים המגנטיים באמצעות דוכן ההפרדה המגנטי ולהעביר את lysate התא הכולל עד צמרמורת מראש חדשהאד צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. אחסן חלק זה ב -20 ° C לניתוח נוסף.
- שטפו את החרוזים 3 פעמים עם חיץ 1 תמוגה קר כקרח מ"ל. הוסף 50 μL Laemmli מדגם חיץ גלולה חרוז, ומערבבים על ידי pipetting ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמצעות תנור לחסום יבש. חלק זה מכיל את מתחמי הידבקות המבודדים. המשך ניתוח או חנות ביוכימיים ב -20 ° C.
- מן lysate התא הכולל המתקבל לאחר ההפרדה חרוזים (כ -300 μL), להסיר aliquot 50 μL לניתוח כתם המערבי.
הערה: 250 μL עזב יכול לשמש מחקרים ביוכימיים נוספים כגון מחקרי אינטראקציה בין חלבונים (immunoprecipitation, מבחני נפתח GST) או ניסויי פעילות GTPase (שינוי למאגר תמוגה עשוי להיות נחוץ תלוי GTPase של עניין).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטית של הטכניקה מודגמת באיור 1 א. בעקבות נטייה ליגנד, חרוזים מגנטיים מודגרת עם תאים במשך 20 דקות, ולאחר מכן מגנט קבוע משמש כדי להחיל כוחות מתיחים של כ 30-40 pN עבור כמות זמן שונה. 1b איור מראה 2.8 מיקרומטר חרוזים מגנטיים מצופה FN כבול קולטנים הידבקות התא MRC5.
השלבים לשטוף חרוזים פאראמגנטי לאחר תמוגה התא הם קריטיים ולקבוע את מידת טיהור. מינימום של שלושה שוטף מומלץ. Immunoblots GADPH עם חשיפות ארוכות יכול להיות שימושי כדי לבחון את טוהר מתחמי הידבקות (איור 2 א).
FN מצופה חרוזים שימשו לחקור את תהליכי mechanotransduction המתרחשות לאורך זמן על מתחמי הידבקות בתגובה למתח. לאחר פרדה מגנטית של השבר המורכב ההידבקות, lysate ואת שבר ההידבקות המורכב נותחו על ידיכתם מערבי. כצפוי, צפינו תלין, vinculin ו paxillin, אבל לא GAPDH בשבריר מתחמי הידבקות גם במקרים שאין בהם גירוי מכני (איור 2b). עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 32, 33, מתח מופעל גיוס vinculin לקומפלקסי הידבקות. בעוד מתח לא השפיע גיוס paxillin לקומפלקסי הידבקות, זירחון על טירוזין 31 שופר בתגובת מתח מכאני הן lysate התא סכה בשבריר ההידבקות המורכב.
איור 1. תיאור של השיטה. (א) איור סכמטי של הטכניקה. תאים הם ראשית בתרבית תרבות בינונית עד confluency הרצוי הוא הגיע. לאחר מכן, חרוזים פאראמגנטי מתווספים במשך 15-20 דקות. כוחות Tensional על 30-40 pN הםאז מיושם באמצעות המגנט מכויל עבור משך הזמן שונה. (ב) חרוזים פאראמגנטי מצופה פיברונקטין להיקשר לקולטנים הידבקות התא. תאים הם צילמו ידי בניגוד שלב ב משודר-אור מיקרוסקופיה 15 דקות לאחר הוספת חרוזים פאראמגנטי (חץ לבן) בינוני. (תמונה למעלה: בר סולם = 25 מיקרומטר, תמונה תחתונה: סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מתח מכני גורם התבגרות הידבקות. (א) טיהור של מתחמי הידבקות. immunoblotting GAPDH משמש טעינה מלאה עבור lysate התא הכולל וכדי לבדוק את טוהר מתחמי הידבקות. קרום nitrocellulose כבר צילמו באמצעות חשיפה ארוכה להפגין הבהיעדר דואר של אות בשבריר מורכב הידבקות. (ב) מתח גורם התבגרות הידבקות. טעינה מלאה (GAPDH) ומועמדים (vinculin, תלין ו paxillin) ידוע יגויסו או פוספורילציה ב מתחמי הידבקות בתגובה למתח מכני immunoblotted. ניסוי זה בוצע על MRC5 תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בהמשך.
השתמשנו חרוזים מגנטיים 2.8 מיקרומטר בקוטר אבל חרוזים גדולים יותר יכולים לשמש כגון 4.5 מיקרומטר קוטר. עם זאת, קוטר חרוז צריך להיות מוגבל 2-5 מיקרומטר מאז phagocytosis עלול להתרחש מהר יותר במהלך 30-60 דגירה דקה וחרוזים גדולים יש הידבקות חזקה כך עקירה חרוזה תוגבל תחת שדה מגנטי 34, 35. לכן, חשוב להגביל זמן דגירה לתקופות קצרות להשתמש בגודל חרוז הראוי. מספר החרוזים מודגרות לכל תא ישפיע על הכמות של fניסיון orce ידי תא בודד. בעוד אחד לא רוצה לעורר תאים ביעילות עם מתח, יותר מדי חרוזים לכל תא יכולים להוביל הפעלה של מסלולי איתות רלוונטיים. אנחנו בדרך כלל דגירה בממוצע שני חרוזים לכל תא עבור חרוזי מצופי FN, אבל כמות זו יכולה להיות מותאמת [1 עד 5 חרוזים לכל תא] בהתאם לסוג התא לבין הקולטן פני התא. לגבי המגנט, השיטה המתוארת כאן המשמשת אבן שואבת אשר הכח וכתוצאה מכך על 2.8 מיקרומטר כבר נמדד (כ 30-40 pN ידי מדידת התזוזה של חרוזים מגנטיים גליצרול חי, נוזל ניוטוני עם צמיגות ידועה 31, למרות שזה ניתן להשתמש מגנטים גדולים להחיל כמות הכוח גדול במידת הצורך. חשוב לציין כי מגנטים אלה הם חזקים מאוד לתמרן אותם בקפידה.
לאחר 12-24 הדגירה h עם ליגנד ECM (שלב 1.7), כמו גם לאחר 1 הדגירה h (שלב 1.9) עם PBS / 0.2% BSA pH 7.6 חיץ, מ 'microbeads agnetic עלול ליצור אגרגטים. זהו אז קריטי להפריד חרוזים ככל האפשר לכבד את היחס של 2 חרוזים לכל תא. עם זאת, עד היום מקובל להיות 5: 1 יחס. חרוזים הפרדה ניתן להשיג גם על ידי ערבוב pipetting או באמצעות sonication, למרות לתקופה קצרה (20-30 שניות).
חלבונים שונים ניתן מצומדות כדי חרוזים, כולל ליגנד integrin (FN, קולגן), חלבונים רקומביננטיים או נוגדנים מיקוד קולטנים בתא השטח המבוקש. הקובץ המצורף של חרוזים מגנטיים צופה ליגנד אל פני תא הגב עלול להתערער על ידי יעילויות צימוד הנמוכות של ליגנד על החרוזים. מומלץ לבדוק ליגנד מחייב את החרוזים על ידי איסוף aliquot של פתרון ליגנד המדולל לפני הוספת החרוזים aliquot של חרוזים בסוף תהליך הצימוד. aliquots אלה יכולים להיות מעובד לניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים כחול.
אם אין שינוייםמסלולי איתות או תהליכי mechanosensing צפויים מזוהים, חשוב לשקול את אפשרויות שונות. דרך אחת לזהות את הבעיה הוא לווסת את תקופת הניסוי עם מגנט. עובדה ידועה היא כי מהירות של תהליכים תאיים משתנה בהתאם לסוג התא בשימוש. אפשרות נוספת תהיה לבחון מולקולות מתח רגיש ידוע ובדוק שינויים translational פוסט שלהם באמצעות המערבי סופג (זירחון paxillin למשל או זרחון FAK ניתן לנתח). כמות הכח יכולה להיות גם ביקורתית באמצעות מגנט עבה (באותה הכיתה N52) או חרוזים גדולים יותר יכולה להיות אופציה. בנוסף, ליגנד / קולטן יעילות מחייב יכול להיחקר על ידי מורכבות הידבקות ניתוח ולחפש קולטנים בתא השטח (כגון cadherin או integrin). התא confluency יכול גם להשפיע על התגובה התאית למתיחות. כפי נצפה כי תא / תאי הידבקות יכולה להשפיע על התנהגות תא cystokeletal prestress, זה important לציין כי confluency עשוי להשפיע על התגובה התאית למתיחות. למרות שאנחנו ממליצים 80% confluency להשמת מתח הידבקויות מבוססים integrin, תנאים שונים עשויים להיבדק על מנת לייעל את המערכת הניסיונית.
אמנם שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לפענח את adhesome המתח הרגיש כמו גם מסלולי האיתות הקשורות, זה גם היה מספר מגבלות. ראשית, מאז הדאגה העיקרית באמצעות חרוזים מגנטיים קטן גודל כזה הוא הסיכון של הפנמה שלהם על ידי התאים, שיטה זו לא ניתן להשתמש ללימוד לטווח ארוך mechanosensitive איתות התגובות הסלולר שמשנים גורל התא כגון בידול ושגשוגם. מגבלה נוספת טמונה בדרך של איך כוחות מוחלים על שכבה של תאים בצלחת התרבות. ואכן, מאז השדה המגנטי הוא תמיד גבוה יותר בפריפריה של המגנט, כוחות יכולים להשתנות על פני השטח של צלחת התרבות עם שיפוע יורד של תאמתיחה מהפריפריה למרכז ועשוי להוביל תגובות הסלולר הטרוגנית.
ההליך המתואר כאן מהווה שיטה יעילה פשוטה ועלות המאפשרת ללמוד מסלולים הסלולר mechanosensitive וכן חוקר את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות נתונים במתח. בניגוד לגישות אחרים, כגון מתיחת מכשיר החלים זן מחזורי לתאים, להוביל לנקיטה של מתח לכל קולטנים בתא שטח אינטראקציה עם תאי מטריקס. השיטה המתוארת כאן יש את היתרון של מה שמאפשר גירוי כוח של תת-סדרה ספציפית של קולטנים בתא שטח ועוד מגוון גדול של הליגנדים יכול לשמש, כגון integrin הליגנדים או נוגדני מיקוד קולטנים בתא שטח, המאפשרים ללמוד על מערכות mechanosensitive רבות ברורות. יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי היא מובילה בטיהור מתחמי החלבונים אשר חוותה מתח לעבוד על loadbearing elements אשר ידועים לשחק תפקיד מרכזי mechanotransduction 36. מתחם ההידבקות המטוהר יכול לשמש גם עבור גישות ביוכימיים שונות 14, כגון מבחני קינאז לחקור פעילות קינאז בתגובת מתח, או assay פילמור יקטין. בנוסף, מערכת ניסיונית זו ניתנת בשילוב עם פינצטה המגנטי לחקור את התגובה המכנה הסלולר לתאם את התגובה הזאת עם מסלולי איתות המזוהים. מעניין לציין, כי חלקיקים magnetoplasmonic שימשו לאחרונה מכנית Notch עומס ו- E-cadherin עם שליטה מדויקת בזמן ובמרחב 37. התפתחות אחרונה זה עשויה לעזור לחקור מסלולי איתות mechanosensitive עם תשומות מרחבית, זמניות מכאניות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
CG נתמך על ידי תרומות של סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR-13-JSV1-0008), מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (n˚8304162 אינטגרציה מארי קירי קריירה) ומן המועצה האירופית למחקר (ERC) תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר תוכנית חדשנות (n˚639300 גרנט המוצא ERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al.
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J.
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
