Summary
Celleoverflatevoksninger er sentrale i mechanotransduction, som de overfører mekanisk spenning og iverksette de signalveier involvert i vev homeostase og utvikling. Her presenterer vi en protokoll for å dissekere de biokjemiske mekanismer som aktiveres i respons til spenning, ved hjelp av ligand-belagt magnetiske mikroperler og kraft søknad til vedheft reseptorer.
Abstract
Mechanosensitive celleoverflate adhesjons komplekser tillate cellene å avføle de mekaniske egenskapene til sine omgivelser. Nyere studier har identifisert både kraft-sensing molekyler på vedheft områder, og tvinge avhengig transkripsjonsfaktorer som regulerer avstamning spesifikke genuttrykk og drive fenotypiske utganger. Imidlertid har signalnettverk konvertere mekanisk spenning i biokjemiske mekanismer vært unnvikende. For å utforske de signalveier som driver etter en mekanisk spenning som er påført celleoverflatereseptor, kan superparamagnetiske mikrokuler anvendes. Her presenterer vi en protokoll for å bruke magnetiske kuler for å bruke kreftene til celleoverflate adhesjonsproteiner. Ved hjelp av denne metode, er det mulig å undersøke ikke bare kraftavhengig cytoplasmatiske signalbaner av forskjellige biokjemiske metoder, men også adhesjon remodellering av magnetisk isolasjon av adhesjons komplekser festet til ligand-belagte kuler. Denne protokollen innbefatter fremstilling av ligand-corerte superparamagnetiske perler, og anvendelse av definere strekkrefter fulgt av biokjemiske analyser. I tillegg tilbyr vi et representativt utvalg av data som viser at spenning påføres intebasert heft utløser heft ombygging og endrer protein tyrosin fosforylering.
Introduction
I metazoer, retning og mekanisk spenning vev utvikling og homeostase gjennom regulering av en myriade av cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og overlevelse 1, 2. Mekaniske spenninger kan oppstå fra den ekstracellulære matriks eller kan genereres av adherente celler, som prøve deres ekstracellulære miljø gjennom actomyosin kontraktile maskiner som trekker ut mot ekstracellulær matriks og sonder dens stivhet ved spenningsfølsomme molekyler. Som svar på spenning, mechanosensitive adhesjonsproteiner gjennomgå konformasjonsforandringer endringer som utløser komplekse signalkaskader. I sin tur, disse signalveier orkestrere en mechanoresponse omfatter spredning, differensiering og overlevelse som justerer cellulære atferd til det ekstracellulære miljøet. Slike prosesser kan bli avgjort i en kortsiktig periode (sekunder til minutter) for raskt å mate tilbake på løkken mecha notransduction ved å endre mechanosensitive strukturer. For eksempel, integrinbaserte voksn forsterke som reaksjon på spenning gjennom Rho GTPase-mediert cytoskeletal remodellering 3, 4, 5. Parallelt er andre signalveier aktivert i løpet av timer og dager for å kontrollere genetiske programmer som til slutt påvirker celle skjebne 6. Mens mange studier har fremhevet effekten av matrisen stivhet på celle determinisme og sykdomsutvikling 1, 2, de nøyaktige molekylære mekanismer for vedheft-mediert mechanotransduction fortsatt unnvikende.
Ulike tilnærminger har blitt utviklet for å studere effekter av cellegenerert styrker eller ytre krefter på celle atferd, inkludert flytsystemer, fluorescens resonans energi overføring (FRET) -tension sensorer 7,lass = "xref"> 8, kompatible underlag 9, magnetiske pinsett, optiske pinsetter 10 og atomic force mikroskopi (AFM) 11. Her presenterer vi en protokoll bruker superparamagnetiske perler å karakter mechanotransduction trasé som svar på strekkrefter brukt på bestemte vedheft reseptorer. Superparamagnetiske kuler er partikler som reversibelt magnetize når den plasseres i et magnetisk felt. Når belagt med en ligand for en spesifikk reseptor, disse perlene tilveiebringe et kraftig verktøy for å studere effektene av ekstracellulært kraftpåførings. Denne metoden har blitt validert av flere studier 3, 5, 12 - 17 og presentere fordel å i stor grad legge til rette for biokjemisk analyse på heftende celler. Ved hjelp av tilsvarende kollagen-belagte magnetiske kuler, etterfulgt av biokjemisk analyse, tidlige arbeid rapportert en økning iprotein-tyrosin-fosforylering og aktivering RhoA som reaksjon på spenning 5, 18, 19. Metoden som beskrives nedenfor har også vært brukt med fibronektin (FN) -belagte perler for å karakterisere de signalveier nedstrøms fra spenning påføres integriner 3. I denne studien Guilluy et al. viste at spenningen aktiverer RhoA gjennom rekruttering av de to guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs), Larg og GEF-H1, til integrin vedheft komplekser. Siden det, har andre studier vist at GEF-H1 er rekruttert til vedheft komplekser som svar på celle-generert spenning ved hjelp av ulike metoder 20, 21, demonstrere robustheten til metoden beskrevet her. Som et resultat ble aktivert RhoA vist seg å fremme vedheft forsterkning, gjennom cytoskeletal ombygging. Dette systemet ble også benyttet for å oppdage spenning påført to celle / celle adhesjon reseptorer. Anvendelse av krefter på magnetiske kuler belagt med det ekstracellulære domenet av E-cadherin induserte en økning i vinculin rekrutteringen på samme måte som integrin-assosierte adhesjons komplekser 12. Collins og kolleger observerte at anvendelse av spenning til PECAM-en fremmer inte og RhoA aktivering 13. En annen eksperimentell tilnærming ved hjelp av magnetiske kuler er studiet av spenning tilført til isolerte kjerner. Ved hjelp av kuler belagt med antistoffer mot kjernekapselproteinet nesprin-1, ble atom konvolutt komplekser renses for å vise at de er dynamisk regulert som respons på mekanisk spenning 22. Disse resultatene støtter powerfulness av denne metoden i studiet av mechanotransduction veier. Videre, mens strømnings eller trekkraft systemer stimulere generelle cellulære prosesser, magnetiske kuler spesifikt mot en celle adhesjon reseptor ved hjelp av enten reseptorligander 13, 15.
En annen fordel med denne fremgangsmåte er isoleringen av adhesjons komplekser gjennom en enkel ligand affinitetsrensing prosedyre. Det er velkjent at tilsetning av ligand-belagte kuler til cellene binder adhesjonsreseptorer og induserer rekruttering av flere adhesjonsproteiner 23. Ytterligere påføring av krefter til ligand-belagte magnetiske kuler svinger disse adhesjons komplekser til makromolekylære plattformer som formidler forskjellige spenningsavhengige signalbaner 4, 24. Cellelyse etterfulgt av kule konsentrasjon ved anvendelse av en magnet tillater isolering av adhesjonsegenskapene plattformer. Andre metoder som brukes for å rense adhesjons komplekser har allerede blitt brukt i adherente celler. De kombinerer kjemisk kryssbinding for å spare protein-protein interaksjonerog en cellelyseringstrinn av vaskemiddel og skjærflyt eller ultralydbehandling 20, 21, 25, 26, 27, 28. Det siste trinnet er samlingen av de resulterende ventrale plasmamembraner inneholdende de adhesjons komplekser. I motsetning til disse fremgangsmåter, magnetiske kuler tillate en høyere grad av rensing celle adhesjons komplekser ved selektivt rettet mot en bestemt familie av adhesjonsreseptorer. Magnetiske kuler har allerede blitt brukt for å rense adhesjons komplekser i ikke-adherente celler bundet til ligand-belagte mikrokuler 29, 30. Metoden er beskrevet nedenfor ligner biologiske situasjoner der makt er søkt om en kort vedvarende periode (sekunder til minutter). Derfor gir det et kraftig verktøy for å undersøke både den molekylære sammensetningen av renset vedheft komplekser ognedstrøms mechanosensitive-signalveier.
Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for å bruke magnetiske kuler for å bruke strekkrefter til vedheft overflateproteiner. En permanent neodym-magnet er plassert på toppen av kulturskålen overflate. Den polflate av magneten er plassert ved en høyde på 6 mm, slik at kraften på et enkelt 2,8 pm magnetiske kuler er konstant (omkring 30 til 40 pn) 31. Varigheten av spenning stimulering bestemmes av operatøren avhengig av molekyl av interesse og dens tidsskala for aktivering. Celler blir lysert endelig, adhesjons komplekser blir renset ved hjelp av kuler separasjon ved anvendelse av en magnet og biokjemiske analyser blir behandlet. Denne protokollen innbefatter fremstilling av ligand-belagt superparamagnetiske kuler, og det utøves strekk gjennom magnet etterfulgt av biokjemiske analyser. I tillegg tilbyr vi et representativt utvalg av data som viser at spenning påføres intebaserte adhesions induserer vedheft ombygging og endrer protein tyrosin fosforylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ligand Bøyning til magnetiske kuler
Bemerk: Ligand konjugering utføres ved hjelp av superparamagnetiske tosyl-aktiverte kuler med en 2,8 um diameter (stamoppløsning konsentrasjon 10 8 perler / ml, 30 mg kuler / ml). Den følgende protokollen er basert på prøver av omtrent 2 x 10 5 celler, som tilsvarer MRC-5-celler dyrket til 80% konfluens i en 60 mm vevskulturskål. Juster volumet av perler og reagenser tilsvarende ved bruk plater av forskjellige størrelser eller celler på ulike Confluences. Anvende en mengde av superparamagnetiske kuler for å få 2 perler per celle. Derfor er 4 x 10 5 perler som er nødvendig for en 60 mm plate.
- Grundig resuspendere kulene i originalbeholderen ved å virvle i minst 30 sek. Alikvot 40 ul av de resuspenderte superparamagnetiske kuler (svarende til 4 x 10 6 perler) til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Plasser røret på en magnetisk separatipå stativet, for å separere de magnetiske kuler fra løsningen. Kast supernatanten, fjerne røret fra magnetisk separasjon stativet og resuspender perlene i 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Gjenta vasketrinn to ganger med 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Etter den siste vask, resuspendere kulene opp i 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4.
- Kombiner 100 ug bovin fibronektin (FN), eller en hvilken som helst annen celle adhesjon reseptor-ligand til 1 ml 0,1 M Na-fosfat pH 7,4 inneholdende perler og blandes ved pipettering.
- Gjenta trinnene ovenfor ved å erstatte FN eller hvilken som helst annen spesifikk ligand med BSA, poly-D-lysin eller apo-transferrin for negative kontroller.
- Eventuelt, for gelanalyse, ta en 10 ul alikvot av ligand løsning for analyse av tverrbindingseffektivitet og blandes med et passende volum av konsentrert Laemmli-prøvebuffer.
- Inkuber perler med liganden inneholdende oppløsning i 12-24 timer ved 37 ° C på en rotor.
- Hvis perle aggregater vises etter at reaksjonen har skjedd, sonicate (kontinuerlig 39 W effekt) for ikke mer enn 10-20 s.
- Isolere perlene ved hjelp av magnetisk separasjon stand, aspirere den gjenværende løsningen og tilsett 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 oppløsning. Inkuber i 1 time på rotor ved 37 ° C.
- Vask kulene ved hjelp av en magnet to ganger med 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Resuspender perler i 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6.
- Sonicate perler hvis aggregater vises for ikke mer enn 20-30 s.
- Eventuelt kan fjerne en 10 pl prøve for å analysere koblingsvirkningsgrad ved western blot (blandes med et passende volum av konsentrert Laemmli prøvebuffer).
- Fortsett til celle analyser eller store perler ved 4 ° C i opptil en måned.
- Eventuelt kjøre en SDS-PAGE gel og flekken med Coomassieblå å analysere FN kryssbinding til de magnetiske kuler.
2. Bruk av strekkrefter på ligand-belagt perler bundet til Limingen reseptorer på DorsalOverflaten av cellene
- Kultur adherente celler på 60 mm vevskulturskål i passende vekstmedium (DMEM vanligvis 4,5 g / L D-glukose supplert med FCS 10%) til n 80% sammenflytning.
- Fremstille ikke-denaturerende ikke-ionisk lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% NP-40) og kjøle mikrosentrifugerør.
- Pellet ligand kuler fra § 1.10 og resuspender i 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Tilsett 100 ul av den ligand-belagte kuler løsning på 5 ml varm kulturmedium og virvle.
- Aspirer medium i 60 mm dyrkningsskål og tilsett 5 ml varm vekst mellom supplert med perler.
- Inkuber i 20 minutter under celledyrkningsforhold (37 ° C og 5% CO 2) for å tillate perlene i sedimenter og holder seg til cellene. Det er viktig å ikke overstige 20 min ettersom kulene kan bli internalisert av fagocytose.
- Eventuelt observere perlene under et lysmikroskop ved hjelp av en 10X eller 20X objective og se etter perle adhesjon ved litt risting fatet til å diskriminere mellom festet og flytende perler.
- Samtidig som kulturskålen i inkubatoren, bytter den normale Skål lokk for et lokk med en rund 38 mm neodym-magnet festet på den øvre flate. Magneten holdes på plass av to mindre 13 mm Neodym magneter som er plassert på undersiden av lokket. Siden magnetene er veldig kraftig, manipulere dem nøye.
- Inkuber cellene utsatt for spenning for de ønskede tidspunkter ved celledyrkningsbetingelser (37 ° C og 5% CO2).
- Etter behandling, legg fatet på is og nøye aspirer hele medium fra fatet.
- Tilsett 300 ul av cellelyseringsbuffer, og inkuberes i 10 min på is. Samle lysatet ved hjelp av en celleskrape og overføring til en på forhånd avkjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Pellet magnetiske kuler ved hjelp av magnetisk separasjon stativet og overføre det totale cellelysat til en ny pre-kjøleed 1,5 ml mikrosentrifugerør. Oppbevar denne fraksjonen ved -20 ° C for videre analyse.
- Vask kulene 3 ganger med 1 ml iskald lyseringsbuffer. Tilsett 50 mL Laemmli-prøvebuffer for å vulsten pellet, blandes ved pipettering og koke ved 95 ° C i 5 min ved anvendelse av en tørr blokkvarmer. Denne fraksjonen inneholder de isolerte vedheft komplekser. Fortsett til biokjemisk analyse eller oppbevar ved -20 ° C.
- Fra det totale cellelysat ble oppnådd etter separasjon kuler (ca. 300 ul), fjerne en 50 pl prøve for Western blot-analyse.
MERK: De 250 ul igjen kan brukes til ytterligere biokjemiske studier som protein-protein interaksjonsstudier (immunoprecipitation, GST rullegardin analyser) eller GTPase aktivitet eksperimenter (endrer lysis buffer kan være nødvendig, avhengig av GTPase av interesse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk av den teknikk som er illustrert i figur 1a. Etter ligand konjugasjon, er magnetiske kuler inkubert med cellene i 20 minutter, og deretter en permanent magnet anvendes for å påføre strekkrefter på omtrent 30-40 pN for forskjellige tidsrom. Figur 1b viser 2,8 um FN-belagte magnetiske kuler bundet til MRC5 celle-adhesjonsreseptorer.
Vasketrinnet av superparamagnetiske kuler etter cellelyse er avgjørende, og bestemme graden av rensing. Et minimum av tre vaskinger anbefales. GADPH immunoblot med lange eksponeringer kan være nyttig for å teste renheten av adhesjons komplekser (figur 2a).
FN-belagte perler ble anvendt for å undersøke mechanotransduction prosesser som skjer over tid på adhesjons komplekser som reaksjon på strekk. Etter magnetisk separering av adhesjonen komplekset fraksjonen, ble lysatet og adhesjonen komplekset fraksjon analysert ved hjelpwestern blot. Som forventet, ble det observert Talin, vinculin og paxillin, men ikke GAPDH i adhesjons komplekser fraksjon, selv i fravær av mekanisk stimulering (figur 2b). I samsvar med tidligere rapporter 32, 33, spenning utløst vinculin rekruttering til vedheft komplekser. Mens spenningen ikke påvirker paxillin rekruttering til vedheft komplekser, ble dets fosforylering av tyrosin 31 forsterket som følge av mekaniske spenninger både i den totale cellelysat og i adhesjonen komplekset fraksjon.
Figur 1. Beskrivelse av fremgangsmåten. (A) Skjematisk illustrasjon av teknikken. Cellene blir først dyrket i medium kulturen inntil den ønskede konfluens er nådd. Deretter blir superparamagnetiske kuler tilsatt i 15-20 min. Strekkrefter ca 30-40 pN erså påført ved hjelp av den kalibrerte magnet for forskjellig tid. (B) fibronektin-belagt superparamagnetiske kuler binder seg til celle adhesjonsreseptorer. Cellene er avbildet med fasekontrast i overført-lysmikroskopi 15 minutter etter tilsetting av superparamagnetiske kuler (hvit pil) i medium. (Top image: Scale bar = 25 mikrometer, bunn bilde: Scale bar = 100 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Mekanisk spenning induserer vedheft modning. (A) Rensing av adhesjons komplekser. GAPDH immunoblotting blir brukt som kontroll for lasting totalt cellelysat og for å kontrollere renheten av adhesjons komplekser. Nitrocellulosemembranen har blitt avbildet ved hjelp av en lang eksponering for å demonstrere the fravær av signal i vedheft kompleks brøkdel. (B) Tension induserer vedheft modning. Lasting kontroll (GAPDH) og kandidatene (vinculin, Talin og paxillin) er kjent for å bli rekruttert eller fosforylert ved adhesjons komplekser som respons på mekanisk spenning blir immunoblottet. Dette eksperiment er blitt utført på MRC5 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som er beskrevet her danner en grei måte å påføre spenning til celleoverflate adhesjonsreseptorer og tillate deres påfølgende rensing. Men noen trinn er kritisk for å utføre effektiv adhesjon rensing og eventuell optimering kan gjøres avhengig av den målrettede adhesjonsreseptorer. Vi presenterer potensielle problemer brukeren kan oppstå under.
Vi brukte 2,8 um diameter magnetiske kuler men større perler kan anvendes, slik som 4,5 um diameter. Imidlertid bør kulediameter begrenses til 2-5 um siden fagocytose kan skje raskere i løpet av 30-60 min inkubasjon og større perler ha sterkere adhesjon, slik at vulsten forskyvning ville være begrenset i henhold til magnetfeltet 34, 35. Derfor er det viktig å begrense inkubasjonstid til korte perioder og bruke riktig perlestørrelse. Antallet kuler inkubert per celle vil påvirke mengden av force erfaring av en enkelt celle. Mens man ønsker å effektivt stimulere celler med spenning, kan for mange perler per celle fører til aktivering av irrelevante signalveier. Vi vanligvis inkuberes et gjennomsnitt av to perler per celle for FN-belagte perler, men denne mengden kan justeres [1 til 5 kuler pr celle], avhengig av celletype og celleoverflatereseptoren. Når det gjelder magnet, metoden som er beskrevet her anvendes en magnet for den resulterende kraft på et 2,8 um er blitt målt (ca. 30-40 pN ved å måle forskyvningen av magnetiske kuler i ufortynnet glycerol, en Newtonsk væske med kjent viskositet 31, selv om det så er mulig å bruke større magneter til å anvende større mengde kraft hvis det er nødvendig. Det er viktig å merke seg at disse magneter er svært kraftige, og for å manipulere dem nøye.
Etter 12-24 timers inkubering med ECM-ligand (trinn 1.7), så vel som etter en time inkubering (trinn 1.9) med PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 buffer, de magnetic mikroperler kan danne aggregater. Det er da viktig å separere perlene så mye som mulig for å respektere forholdet 2 perler per celle. Imidlertid er det fremdeles er akseptabel for å ha et 5: 1 forhold. Perler separasjon kan oppnås enten ved å blande og pipettering eller ved hjelp av ultralydbehandling, selv for en kort periode (20-30 s).
Forskjellige proteiner kan konjugeres til kulene, blant annet integrin ligand (FN, kollagen), rekombinante proteiner eller antistoffer rettet mot bestemte celleoverflatereseptorer. Festingen av ligand-belagte magnetiske kuler til den dorsale celleoverflaten kan bli svekket på grunn av den lave koblingsgrad av liganden på perlene. Det anbefales å se etter ligandbinding til kulene ved å samle en prøve av den fortynnede ligand før tilsetning til kulene og en alikvot av kulene ved enden av koblingsprosessen. Disse alikvoter kan behandles for å SDS-PAGE-analyse og Coomassie blå farging.
Hvis ingen endringer isignalveier eller forventede mechanosensing prosesser er oppdaget, er det viktig å vurdere ulike muligheter. En måte å identifisere problemet er å modulere varigheten av eksperimentet med magneten. Det er velkjent at hastigheten for cellulære prosesser varierer avhengig av hvilken celletype som brukes. Et annet alternativ ville være å teste kjente spenningsfølsomme molekyler og se etter sine innlegg translasjonelle modifikasjoner av western blotting (for eksempel paxillin fosforylering eller FAKfosforylering kan analyseres). Mengden av kraft kan også kritisk og ved hjelp av en tykkere magnet (samme grad N52) eller større perler kan være et alternativ. I tillegg kan ligand / reseptor-bindingseffektivitet bli undersøkt ved å analysere adhesjon kompleks og se etter celleoverflatereseptorer (for eksempel cadherin eller integrin). Den cellesammenflytning kan også påvirke den cellulære responsen til spenning. Som det har blitt observert at celle / celle adhesjon kan påvirke celle-adferd og cystokeletal forspenningen, er det important å merke seg at konfluens kan påvirke cellulær respons overfor spenning. Selv om vi anbefale 80% sammenflytning for påføring av strekk til integrinbaserte adhesjon, kan forskjellige betingelser bli testet for å optimalisere den eksperimentelle system.
Selv om denne metoden gir et kraftig verktøy for å dechiffrere spenningen sensitive adhesome samt tilhørende signalveier, det hadde også noen begrensninger. Først, siden den største bekymringen ved anvendelse av slike liten størrelse magnetiske kuler er risikoen for deres internalisering av cellene, kan denne metoden ikke anvendes for å studere langtids mechanosensitive signal cellulære responser som modifiserer celle skjebne slik som differensiering og proliferasjon. En annen begrensning ligger i veien for hvordan kreftene virker på laget av celler i kulturplaten. Faktisk, siden magnetfeltet alltid er høyere ved periferien av magneten, kan variere krefter på overflaten av kulturen plate med en avtagende gradient av cellestrekker seg fra periferien til sentrum og kan føre til heterogene cellulære responser.
Fremgangsmåten beskrevet her utgjør en enkel og kostnadseffektiv metode som gjør det mulig å studere mechanosensitive cellulære veier, så vel som å undersøke den molekylære sammensetning av vedheft komplekser som er utsatt for spenning. Andre tilnærminger, for eksempel strekkinnretning som gjelder syklisk belastning til celler, føre til at det utøves strekk til alle celleoverflatereseptorer som samvirker med den ekstracellulære matriks. Den metode som er beskrevet her har den fordel å muliggjøre kraft stimulering av en spesifikk undergruppe av celleoverflatereseptorer, og et stort utvalg av ligander kan anvendes, slik som integrin-ligander eller antistoffer målrettet mot celleoverflatereseptorer, slik at studie av mange forskjellige mechanosensitive systemer. En annen fordel med denne metoden er at den fører til rensing av proteiner komplekser som oppleves spenning og for å arbeide på bærende elemeNTS som er kjent for å spille en sentral rolle i mechanotransduction 36. Det rensede adhesjon komplekset kan også brukes for forskjellige biokjemiske metoder 14 slik som kinase-analyser for å undersøke kinase-aktivitet som reaksjon på spenning, eller aktin polymerisasjon analysen. I tillegg kan denne eksperimentelle systemet være sammen med magnetiske pinsett for å utforske den cellulære mekanisk respons og å relatere dette svaret med de identifiserte signalveier. Interessant, har magnetoplasmonic nanopartikler blitt brukt nylig til mekanisk belastning Notch og E-cadherin med presis kontroll i tid og rom 37. Det siste utviklingen kan bidra til å utforske mechanosensitive signalveier med forskjellige romlige, tidsmessige og mekaniske innganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
CG er støttet med tilskudd fra Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), fra EU syvende rammeprogram (Marie Curie Career Integration n˚8304162) og fra European Research Council (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
