Summary
彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。
Abstract
機械受容細胞表面接着複合体は、細胞がその周囲の機械的特性を感知することを可能にします。最近の研究では、接着部位での力感知分子、および系統特異的遺伝子の発現を調節し、表現型出力を駆動力依存性転写因子の両方を同定しました。しかし、生化学的経路に機械的張力を変換するシグナル伝達ネットワークは、とらえどころのないままです。細胞表面受容体に適用される機械的張力の際に係合したシグナル伝達経路を探索するために、超常磁性マイクロビーズを使用することができます。ここでは、細胞表面接着タンパク質に力を適用するために磁気ビーズを使用するためのプロトコルを提示します。このアプローチを使用して、様々な生化学的アプローチによってのみならず力依存性細胞質のシグナル伝達経路を調査することが可能であるが、リガンドでコーティングされたビーズに付着した接着複合体の磁気分離によってリモデリングを接着します。このプロトコルは、リガンド - コの準備を含んでいます超常磁性ビーズをated、と定義する引張力の適用は、生化学的分析が続きます。さらに、我々はインテグリンベースの接着に適用し、そのテンションを実証するデータの代表的なサンプルを提供する接着改造をトリガし、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。
Introduction
後生動物では、機械的張力は、増殖、分化および生存1、2などの細胞プロセスの無数の調節を介して組織発達および恒常性を指示します。機械的張力は、細胞外マトリックスから生じ得るか、接着性細胞、サンプル細胞外マトリックス上に引っ張ると緊張に敏感な分子を介してその剛性をプローブアクトミオシン収縮機構を介して、それらの細胞外環境を生成することができます。張力に応じて、機械受容接着タンパク質は、複雑なシグナル伝達カスケードを誘発する立体配座の変化を受けます。次に、これらのシグナル伝達経路は、細胞外環境への細胞の挙動を調節、増殖、分化および生存を包含するmechanoresponseを調整します。このようなプロセスはすぐにメカのループにフィードバックするために短期的な期間（数秒から数分）で決済することができます機械受容の構造を変更することによってnotransduction。例えば、インテグリンベースの接着は、Rho GTPアーゼによって媒介される細胞骨格リモデリング3、4、5を介して張力に応じて強化します。並行して、他のシグナル伝達経路は、最終的に細胞の運命6に影響を与える遺伝的プログラムを制御するための時間と日にわたって活性化されます。 、多くの研究は、細胞の決定論と病気の発症1、2上にマトリックス剛性の効果を強調しているのに対し、接着媒介メカノの正確な分子メカニズムはまだとらえどころのないまま。
様々なアプローチは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-tensionセンサ7、流れシステムを含む細胞挙動に対する細胞発生力又は外力の影響を研究するために開発されていますLASS = "外部参照"> 8、コンプライアント基板9、磁気ピンセット、光ピンセット10と、原子間力顕微鏡（AFM）11。ここでは、特定の接着レセプターに適用引張力に応答してメカノ経路を特徴付けるために超常磁性ビーズを使用してプロトコルを提示します。超常磁性ビーズを磁場中に置かれたときに可逆的に磁化粒子です。いったん特定の受容体のリガンドでコーティングされ、これらのビーズは、細胞外加力の影響を研究するための強力なツールを提供します。 17、大部分は接着細胞の生化学的解析を容易にするための利点を提示する-この方法は、いくつかの研究3、5、12により確認されています。生化学分析に続いて同様のコラーゲンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、初期の作品は、の増加を報告しましたテンション5、18、19に応答して、タンパク質チロシンリン酸化およびRhoAの活性化。以下に記載される方法はまた、インテグリン3の張力から下流のシグナル伝達経路を特徴づけるために、フィブロネクチン（FN）でコーティングされたビーズを使用されています。本研究では、Guilluyら。テンションがインテグリン接着複合体への2つのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、LARGとGEF-H1の募集を通じてのRhoAを活性化することを示しました。それ以来、他の研究は、GEF-H1は、ここに記載の方法のロバスト性を実証し、異なる方法20,21を用いて、細胞生じる張力に応じて接着複合体に動員されることを示しました。その結果、活性化されたRhoAは、細胞骨格の再構築を介して、接着強化を促進することが示されました。このシステムはまた、Tの張力を探索するために使用されました細胞/細胞接着レセプターO。インテグリン関連する接着複合体12と同様にビンキュリン募集の増加を誘導したE-カドヘリンの細胞外ドメインで被覆した磁気ビーズ上に力を加えます。コリンズらは、PECAM-1に張力のアプリケーションは、インテグリンとRhoAの活性化13を促進することを観察しました。磁気ビーズを使用して、別の実験的なアプローチは、単離された核の張力の研究です。 nesprin-1核エンベロープタンパク質に対する抗体でコーティングされたビーズを使用して、核エンベロープ複合体は、それらが動的機械的張力22に応答して調節されることを示すために精製しました。これらの結果は、メカノ経路の研究では、このメソッドの力強さをサポートしています。フローまたは牽引力システムは、一般的な細胞プロセスを刺激しながら、さらに、磁気ビーズは、具体的には、受容体リガンドのいずれかを使用して、細胞接着受容体を標的と
この方法の別の利点は、簡単なリガンドアフィニティ精製手順を介して接着複合体の単離であります。よく、細胞に対するリガンドでコーティングされたビーズの添加は接着受容体に結合し、いくつかの接着タンパク質23の動員を誘発することが知られています。リガンドでコーティングされた磁気ビーズへの力のさらなる適用は、さまざまなテンション依存性シグナル伝達経路4、24を仲介する巨大分子のプラットフォームにこれらの接着複合体をオンにします。磁石を用いてビーズ濃度に続く細胞溶解は、接着プラットフォームの単離を可能にします。接着複合体を精製するために使用される他の方法は、既に付着細胞に使用されてきました。それらは、タンパク質 - タンパク質相互作用を節約するために化学的架橋を組み合わせます洗剤および剪断流または超音波処理20、21、25、26、27、28による細胞溶解ステップ。最後のステップは、接着複合体を含む得られた腹側形質膜のコレクションです。これらの方法とは異なり、磁気ビーズを選択的接着受容体の特定のファミリーを標的とすることにより、細胞接着複合体の高い精製度を可能にします。磁気ビーズは、既にリガンドでコーティングされたマイクロビーズ29、30に取り付けられた非付着性細胞内接着複合体を精製するために使用されてきました。力は、短い持続時間（分秒）に適用される模倣生物学的状況下に記載の方法。したがって、精製された接着複合体の分子組成の両方を調査するための強力なツールを提供し下流の機械受容シグナル伝達経路。
ここでは、接着表面タンパク質に引張力を適用するために磁気ビーズを使用するための詳細な実験プロトコルを提示します。永久ネオジム磁石は、培養皿の表面の上に配置されます。シングル2.8μmの磁気ビーズ上の力は一定（約30〜40 PN）31となるように、磁石の磁極面は6ミリメートルの高さに配置されています。張力刺激の持続時間は、対象の分子と活性化のその時間スケールに応じてオペレータによって決定されます。細胞は、最終的に接着複合体は、磁石を用いてビーズ分離によって精製され、生化学分析が処理され、溶解されます。このプロトコルは、リガンドでコーティングされた超常磁性ビーズの準備、および生化学的分析に続いて、磁石を通して緊張のアプリケーションが含まれています。さらに、当社は、張力がインテグリンベースのADHに適用されることを実証するデータの代表的なサンプルを提供しますesions接着リモデリングを誘導し、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。
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Protocol
磁気ビーズに1リガンド抱合
注：リガンド結合は、2.8μmの直径（原液濃度が10 8ビーズ/ mLで、30mgのビーズ/ mL）で超常磁性トシル活性化ビーズを使用して実行されます。以下のプロトコルを、60 mm組織培養プレートにおいて80％コンフルエンシーまで増殖させたMRC-5細胞に相当する約2×10 5細胞のサンプルに基づいています。それに応じて異なる合流で異なるサイズまたは細胞のプレートを使用している場合は、ビーズおよび試薬の音量を調整します。セル当たり2ビーズを持っているために、超常磁性ビーズの量を使用してください。したがって、4×10 5ビーズを60mmプレートに必要とされます。
- 徹底的に少なくとも30秒をボルテックスすることにより、元のバイアル中のビーズを再懸濁します。 1.5 mLのマイクロチューブに小分けし再懸濁し、超常磁性ビーズ（4×10 6ビーズに相当）の40μLを。
- 磁気separatiにチューブを置きます溶液から磁気ビーズを分離するためにスタンドに。 、上清を捨て磁気分離スタンドからチューブを取り外し、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。
- 1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウム（pH7.4）で二回繰り返して洗浄ステップ。
- 最終洗浄後、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。
- ビーズを含有する1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4に100μgのウシフィブロネクチン（FN）、または任意の他の細胞接着受容体リガンドを結合し、ピペッティングにより混合します。
- FNまたは陰性対照のためのBSA、ポリ-D-リジンまたはアポトランスフェリンと他の特異的リガンドを置換することによって、前の手順を繰り返します。
- 必要に応じて、ゲル分析のために、架橋効率の分析のためのリガンド溶液の10μLのアリコートを取り、濃縮Laemmliサンプルバッファーの適切な量と混合。
- ロータに37℃で12〜24時間のためのソリューションを含むリガンドとビーズをインキュベートします。
- 反応はせいぜい10から20秒間、超音波処理（連続39 Wの電力）を発生した後、ビーズ凝集体が現れた場合。
- 磁気分離スタンドを用いてビーズを分離し、残りの溶液を吸引し、1mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6ソリューションを追加します。 37℃でローター上で1時間インキュベートします。
- 1mLのPBS / 0.2％BSAをpHが7.6で二回磁石を用いた洗浄ビーズ。 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6で再懸濁ビーズ。
- 超音波処理ビーズは、凝集物はせいぜい20〜30秒間表示されます。
- 必要に応じて、（濃縮されたLaemmliサンプルバッファーの適切な量と混合）ウエスタンブロットによって結合効率を分析するために、10μLのアリコートを削除します。
- 1ヶ月まで4℃で細胞アッセイまたはストアビーズに進みます。
- 必要に応じて、磁気ビーズにFN架橋を分析するためにクーマシーブルーでSDS-PAGEゲルおよび染色を実行します。
背に接着受容体に結合したリガンドでコーティングされたビーズ上の張力軍の適用に関する事項細胞の表面
- 適切な成長培地（10％FCSを補充したDMEM通常4.5グラム/ LのD-グルコース）、60ミリメートルの組織培養皿上で培養接着細胞が80％コンフルエントに達するまで。
- 調製非変性非イオン性溶解緩衝液（20mMのトリスHCl pH7.6の、150mMのNaCl、2mMのMgCl 2を、0.1％NP-40）及びチルマイクロチューブ。
- 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6でセクション1.10を再懸濁からリガンドでコーティングしたビーズをペレット化。暖かい培地と渦の5ミリリットルへのリガンドでコーティングしたビーズ溶液100μLを加えます。
- 60mm培養皿中の培地を吸引し、5mLにビーズを補充した暖かい増殖培地を追加します。
- ビーズが沈降し、細胞に接着することを可能にする細胞培養条件（37℃、5％CO 2）下で20分間インキュベートします。ビーズは、食作用によって内在化することができるので、20分を超えないことが重要です。
- 必要に応じて、10倍または20倍オブジェを使用して光学顕微鏡でビーズを観察ctiveと少し取り付け、フローティングビーズとを区別するための皿を振とうすることにより、ビーズの付着を確認してください。
- インキュベーター内で培養皿を維持しながら、上面に取り付けられたラウンド38ミリメートルのネオジム磁石と蓋のための通常の皿のふたを交換します。磁石は、蓋の下面に配置された2つの小さい13ミリメートルネオジム磁石によって適所に保持されます。磁石は非常に強力であるため、慎重に操作します。
- 細胞培養条件で所望の時間ポイントの張力（37℃、5％CO 2）に供した細胞をインキュベートします。
- 処理後、氷の上に皿を置き、慎重に皿から媒体全体を吸引。
- 細胞溶解緩衝液の300μLを追加し、氷上で10分間インキュベートします。予め冷却し1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞スクレーパーと転送を使用して、溶解物を収集します。
- 磁気分離スタンドを用いた磁気ビーズをペレット化し、新しいプレチルに、全細胞溶解物を転送1.5 mLのマイクロ遠心チューブを編。さらなる分析のために-20℃でこの画分を保管してください。
- 1mLの氷冷溶解緩衝液でビーズを3回洗浄。 、ビーズペレットに50μLのLaemmliサンプルバッファーを追加し、乾燥ブロックヒーターを使用して、95℃で5分間ピペッティングし、沸騰によって混ぜます。この画分は、単離された接着複合体が含まれています。 -20℃での生化学的解析や店舗に進みます。
- ビーズ分離（約300μL）後に得られた全細胞溶解物から、ウェスタンブロット分析のために、50μLのアリコートを削除します。
注：そのようなタンパク質 - タンパク質相互作用の研究（免疫沈降、GSTプルダウンアッセイ）またはGTPアーゼ活性実験などのさらなる生化学的研究のために使用することができる左250μL（溶解緩衝液を変更は、関心のGTPアーゼに応じて必要であり得ます）。
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Representative Results
技術の概略は 、 図1Aに示されています。リガンド結合後、磁気ビーズを20分間、細胞と共にインキュベートされ、その後、永久磁石は、時間の様々な量を約30〜40 pNでの引張力を適用するために使用されます。 図1bは、MRC5細胞接着受容体に結合した2.8μmのFNで被覆した磁気ビーズを示します。
細胞溶解後の超常磁性ビーズの洗浄ステップは非常に重要であり、精製度を決定します。 3回の洗浄の最小値が推奨されます。長時間露光でGADPHのイムノブロットは、接着複合体（図2a）の純度をテストすることが有用であり得ます。
FNでコーティングされたビーズは、張力に応じて接着複合体において経時的に起こるメカノプロセスを研究するために使用されました。接着複合体画分の磁気分離した後、溶解液および接着複合体画分をすることによって分析しましたウエスタンブロット。予想されたように、私たちも、機械的刺激（図2b）の非存在下での接着複合体画分でタリン、ビンキュリンとパキシリンではなく、GAPDHを観察しました。以前の報告32、33と一致して、張力が接着複合体にビンキュリンの募集を引き起こしました。張力が接着複合体にパキシリン募集に影響を及ぼさなかったが、チロシン31上のそのリン酸化は、全細胞溶解物中および接着複合体画分の両方の機械的張力に応じて拡張されました。
方法の1の説明図。 （A）技術の模式図。所望の集密度に達するまで、細胞を最初に培地中で培養されます。その後、超常磁性ビーズは、15〜20分間追加されます。引張力は、約30〜40 pNでありますその後、時間の異なる量に対して較正磁石を使用して適用しました。 （B）フィブロネクチンでコーティングした超常磁性ビーズは、細胞接着受容体に結合します。細胞は、培地中に超常磁性ビーズ（白矢印）を添加した後、透過光顕微鏡15分で位相差によって撮像されます。 （トップ画像：スケールバー=25μmで、底画像：スケールバー= 100μm）で、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.機械的張力は、接着の成熟を誘導します。接着複合体（A）の精製。 GAPDHの免疫ブロット法は全細胞溶解物のためのローディングコントロールとして使用され、接着複合体の純度を確認します。ニトロセルロース膜は番目を示すために長時間露光を用いて撮像されました接着複合体画分における信号の電子不在。 （B）張力は接着の成熟を誘導します。ローディングコントロール（GAPDH）と機械的張力に応じて募集または接着複合体でリン酸化されることが知られている候補（ビンキュリン、タリンおよびパキシリン）がイムノブロットしています。この実験は、MRC5細胞上で行われました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する方法は、細胞表面接着受容体に張力を適用し、それらのその後の精製を可能にする簡単な方法を構成しています。しかし、いくつかのステップは、効率的な接着精製および潜在的な最適化を行うことが重要である標的接着受容体に依存して行うことができます。私たちは、ユーザーが以下の発生する可能性のある潜在的な問題を提示します。
我々は、2.8μmの直径磁気ビーズを使用するが、より大きなビーズは、4.5μmの直径として使用することができます。食作用は、30〜60分間のインキュベーションと、より大きなビーズの間に、より迅速に発生する可能性があるので、ビーズ径は、ビーズの変位が磁場34、35の下に制限されるように、強い接着性を有する2-5ミクロンに制限する必要があります。したがって、短時間にインキュベーション時間を制限し、適切なビーズサイズを使用することが重要です。セル当たりのインキュベートビーズの数がfの量に影響を与えます単一細胞によるORCE体験。 1を効率的張力で細胞を刺激したいと考えているが、セル当たりあまりにも多くのビーズは無関係なシグナル伝達経路の活性化につながることができます。細胞型および細胞表面受容体に依存して[セル当たり1〜5のビーズ]我々は、通常、FNでコーティングされたビーズの細胞当たり2つのビーズの平均をインキュベートするが、この量を調整することができます。磁石に関しては、ここで説明する方法は、それが、希釈されていないグリセロール、既知の粘度31とニュートン液体中の磁気ビーズの変位を測定することにより、2.8μmの上に得られた力は（約30〜40 pNで測定された磁石を使用しました必要に応じて力をより多く適用する大きな磁石を使用することが可能である。これらの磁石は非常に強力であることに注意し、慎重に操作することが重要です。
ECMリガンド（ステップ1.7）を持つだけでなく、PBS / 0.2％BSA pH7.6の緩衝液、mは1時間のインキュベーション（ステップ1.9）後12〜24時間のインキュベーション後agneticマイクロビーズは、凝集体を形成する可能性があります。セル当たり2ビーズの比率を尊重するために、できるだけ多くのビーズを分離するために、次に重要です。 ：1の比が、それでも5を有することが許容されます。ビーズの分離は、短期間（20-30秒）のためにも、混合し、ピペッティングにより、または超音波処理を使用してのいずれかによって達成することができます。
種々のタンパク質は、インテグリンリガンド（FN、コラーゲン）、特定の細胞表面受容体を標的とする組換えタンパク質又は抗体を含むビーズにコンジュゲートすることができます。背側細胞表面へのリガンドでコーティングされた磁気ビーズの結合はビーズ上にリガンドの低いカップリング効率によって弱体化される可能性があります。カップリングプロセスの終わりに、ビーズ、ビーズのアリコートに添加する前に希釈リガンド溶液のアリコートを収集することにより、ビーズに結合するリガンドをチェックすることをお勧めします。これらのアリコートをSDS-PAGE分析およびクマシーブルー染色に加工することができます。
変更なしであればシグナル伝達経路または予想mechanosensingプロセスが検出され、異なる可能性を考慮することが重要です。問題を特定するための一つの方法は、磁石を、実験の持続時間を調節することです。十分に細胞プロセスの速度は、使用される細胞タイプに依存して変化することが知られています。別のオプションは、既知の緊張に敏感な分子をテストし、ウェスタンブロッティングによってそれらの翻訳後修飾をチェックすることであろう（インスタンスパキシリンのリン酸化またはFAKリン酸化について分析することができます）。力の量も重要であり得る厚い磁石（同じグレードN52）以上のビーズを使用して選択することができます。さらに、リガンド/受容体結合効率は、接着複合体を分析することによって探索し、（例えば、カドヘリンまたはインテグリンなど）、細胞表面受容体を探しすることができます。細胞集密度も緊張に対する細胞応答に影響を与えることができます。それは、細胞/細胞接着は、細胞の挙動とcystokeletalプレストレスに影響を与えることができることが観察されているように、importanありますtは密集度は、張力に対する細胞応答に影響を与える可能性があることに注意します。我々はインテグリンベースの接着に張力を適用するための80％の密集度をお勧めていても、異なる条件で実験系を最適化するために試験することができます。
この方法は緊張に敏感adhesomeだけでなく、関連するシグナル伝達経路を解読するための強力なツールを提供していますが、それはまた、いくつかの制限がありました。このような小さなサイズの磁気ビーズを使用して、主な関心事は、細胞によるそれらの内在化の危険性があるので、まず、この方法では、このような分化や増殖などの細胞運命を変更し、長期的機械受容シグナル伝達細胞応答を研究するために使用することはできません。別の制限は、力が培養プレートに細胞の層に適用される方法のような方法です。磁場は、磁石の周囲に常に高いので実際、力は、細胞の減少勾配を用いて培養プレートの表面に変えることができます中央に周囲からストレッチや異種の細胞応答につながる可能性があります。
ここで説明する手順は、機械受容細胞経路を研究するだけでなく、張力が加わって接着複合体の分子組成を調査することができます簡単かつ費用効果的な方法を構成しています。そのような細胞に環状の歪みを適用する装置の延伸などの他のアプローチは、細胞外マトリックスと相互作用するすべての細胞表面受容体への張力の適用をもたらします。ここで説明する方法は、例えば、リガンドまたは細胞表面受容体を標的とする抗体インテグリン多くの異なる機械受容系の検討を可能にするように、使用することができる細胞表面受容体の特定のサブセットおよびリガンドの多様な力の刺激を可能にするという利点を有します。この方法の別の利点は、それが緊張を経験しelemeの耐荷重で動作するタンパク質複合体の精製をもたらすことですメカノ36において中心的な役割を果たしていることが知られているNTS。精製された接着複合体はまた、張力、またはアクチン重合アッセイに応じて、キナーゼ活性を調べるために、このようなキナーゼアッセイなどの様々な生化学的アプローチ14に使用することができます。また、この実験系は、細胞の機械的応答を探索し、識別されたシグナル伝達経路とこの応答を相関させる磁気ピンセットを用いて結合させることができます。興味深いことに、magnetoplasmonicナノ粒子は、時間と空間37に正確な制御と負荷NotchおよびE-カドヘリンを機械的に最近使用されてきました。この最近の開発は異なる、空間的、時間的および機械的な入力を備えた機械受容シグナル伝達経路を探索に役立つことがあります。
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Disclosures
著者には、競合する金融利益を宣言しません。
Acknowledgments
CGは、欧州連合（EU）の地平線の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（マリー・キュリーのキャリアの統合n˚8304162）からと欧州研究評議会（ERC）から、アジャンス国立デラRECHERCHE（ANR-13-JSV1-0008）からの助成金によってサポートされています2020年の研究と技術革新プログラム（ERC開始グラントn˚639300）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
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