Summary
Celoppervlak verklevingen staan centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.
Abstract
Mechanosensitieve celoppervlak adhesie complexen laat cellen om de mechanische eigenschappen van hun omgeving detecteren. Recente studies hebben zowel force sensing moleculen aan adhesieplaatsen en kracht-afhankelijke transcriptiefactoren die lijn genexpressie reguleren en rijden fenotypische uitkomsten van. Echter, de signalering netwerken omzetten van mechanische spanning in biochemische routes bleef ongrijpbaar. Om de signaalwegen betrokken bij mechanische spanning aangebracht op het celoppervlak receptor te verkennen, kan superparamagnetische microkralen worden gebruikt. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van magnetische korrels krachten toepassing celoppervlak adhesie-eiwitten. Met deze aanpak kan men niet alleen kracht-afhankelijke cytoplasmatische signaleringsroutes door verschillende biochemische benaderingen, maar ook adhesie remodellering onderzoeken door magnetische isolatie van adhesie complexen aan de ligand-gecoate kralen. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-coated superparamagnetische delen en de toepassing van vast trekkrachten gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesie triggers hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.
Introduction
In metazoen, mechanische spanning regisseert weefsel ontwikkeling en homeostase door middel van de regulering van een groot aantal cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en overleving 1, 2. Mechanische spanning kan ontstaan uit de extracellulaire matrix of kunnen worden gegenereerd door hechtende cellen, welk monster de extracellulaire omgeving via actomyosine contractiele machinerie die trekt op extracellulaire matrix en sondes zijn stijfheid met spanningsgevoelige moleculen. In reactie op spanning mechanosensitieve adhesieproteïnen ondergaan conformationele veranderingen die complexe signalering cascades activeren. In reactie op deze signaalwegen orkestreren een mechanoresponse omvat proliferatie, differentiatie en overleving dat de cellulaire gedrag de extracellulaire omgeving aanpast. Dergelijke processen kunnen worden geregeld in een korte tijd (seconden tot minuten) om snel terug te voeren op de lus van mecha notransduction door aanpassing van de mechanosensitieve structuren. Bijvoorbeeld integrine-gebaseerde adhesies versterken als reactie op spanning door middel Rho GTPase-gemedieerde cytoskelet remodeling 3, 4, 5. Tegelijkertijd worden ook andere signaleringsroutes geactiveerd via uren en dagen van genetische programma's die uiteindelijk van invloed zijn cel lot 6 beheersen. Dat, hebben vele studies de effecten van Matrix stijfheid op mobiele determinisme en ziekteontwikkeling 1, 2 gemarkeerd, de precieze moleculaire mechanismen van adhesie gemedieerde mechanotransductie nog steeds ongrijpbaar.
Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de effecten van cel optredende krachten of uitwendige krachten op celgedrag, waaronder stroomsystemen, fluorescentie-energieoverdracht (FRET) -tension sensors 7 bestuderenlass = "xref"> 8, compliant substraten 9, magnetische pincet, optisch pincet 10 en atomic force microscopie (AFM) 11. Hier presenteren we een protocol gebruiken superparamagnetische kralen mechanotransductie pathways te karakteriseren als reactie op trekkrachten toegepast op specifieke adhesiereceptoren. Superparamagnetische deeltjes die reversibel magnetiseren wanneer geplaatst in een magnetisch veld. Eenmaal bekleed met een ligand voor een bepaalde receptor, deze kralen een krachtig hulpmiddel om de effecten van extracellulair krachtuitoefening bestuderen. Deze methode is gevalideerd door verscheidene studies 3, 5, 12-17 en brengt het voordeel van biochemische analyse van hechtende cellen grotendeels vergemakkelijken. Met soortgelijk met collageen beklede magnetische korrels gevolgd door biochemische analyse, vroege werk rapporteerde een stijgingeiwittyrosinefosforylatie en RhoA activatie als reactie op spanning 5, 18, 19. De hieronder beschreven methode is ook gebruikt met fibronectine (FN) beklede kralen om de signaalwegen stroomafwaarts karakteriseren van spanning toegepast integrinen 3. In deze studie GUILLUY et al. toonde aan dat de spanning activeert RhoA door de werving van de twee guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs), LARG en GEF-H1, naar integrine adhesie complexen. Sindsdien hebben andere studies aangetoond dat GEF-H1 is aangeworven om adhesie complexen in reactie op cel gegenereerde spanning op verschillende manieren 20, 21, waaruit de robuustheid van de hier beschreven methode. Dientengevolge werd geactiveerd RhoA aangetoond hechting versterking bevorderen door cytoskelet remodeling. Dit systeem werd ook gebruikt om staand spanning wordt toegepast to cel / cel adhesie receptoren. Toepassing van krachten op magnetische bolletjes gecoat met het extracellulaire domein van E-cadherine-geïnduceerde verhoging van vinculin recruitment soortgelijke integrine geassocieerd hechting complexen 12. Collins en collega's opgemerkt dat de toepassing van spanning op PECAM-1 bevordert integrine en RhoA activeren 13. Een andere experimentele aanpak met behulp van magnetische bolletjes is de studie van de spanning toegepast op geïsoleerde kernen. Gebruik parels bekleed met antilichamen tegen nucleaire envelopeiwit nesprin-1 werden kernenvelop complexen gezuiverd aantonen dat zij dynamisch gereguleerd in reactie op mechanische spanning 22. Deze resultaten ondersteunen de almacht van deze methode in de studie van mechanotransductie trajecten. Bovendien, terwijl stroom of trekkracht systemen stimuleren algemene cellulaire processen, magnetische korrels specifiek op een celadhesie receptor met behulp van receptorliganden 13, 15.
Een ander voordeel van deze methode is de isolatie van hechting complexen door een eenvoudige ligandaffiniteit zuiveringsprocedure. Het is algemeen bekend dat toevoeging van ligand-gecoate bolletjes aan cellen bindt adhesie receptoren induceert en de rekrutering van diverse adhesie-eiwitten 23. Verdere toepassing van de strijdkrachten-ligand gecoate magnetische bolletjes blijkt deze adhesie complexen in macromoleculaire platforms dat verschillende spanning-afhankelijke signaalwegen 4 bemiddelt, 24. Cellysis gevolgd door concentratie kraal met een magneet maakt de isolatie van de hechting platforms. Andere methoden toegepast om de hechting complexen zuiveren zijn al gebruikt in hechtende cellen. Zij combineren chemische verknoping eiwit-eiwit interacties behoudenen een cel-lysis stap detergens en schuifkracht of sonificatie 20, 21, 25, 26, 27, 28. De laatste stap is het verzamelen van de resulterende ventrale plasma membranen die de hechting complexen. In tegenstelling tot deze methoden, magnetische bolletjes in een grotere zuivering niveau van cel adhesie complexen door het selectief richt op een specifieke familie van adhesie receptoren. Magnetische korrels zijn reeds toegepast om de hechting complexen zuiveren in niet-hechtende cellen gehecht aan ligand-gecoate microkorrels 29, 30. De methode die hieronder bootst biologische situaties beschreven waarbij kracht wordt uitgeoefend voor een korte aanhoudende periode (seconden tot minuten). Daarom is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire samenstelling van gezuiverde adhesie complexen ende downstream mechanosensitieve-signaalwegen.
Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol voor het gebruik van magnetische korrels aan trekkrachten van toepassing op de hechting oppervlakte-eiwitten. Een permanente neodymium magneet bovenop de kweekschaal oppervlak. Het pooloppervlak van de magneet op een hoogte van 6 mm, zodat de kracht op een 2,8 urn magnetische korrels constant (ongeveer 30-40 pN) 31. De duur van spanning stimulatie wordt bepaald door de operator afhankelijk van het molecuul van belang en de tijdschaal van activatie. Cellen worden gelyseerd slotte, adhesie complexen worden gezuiverd met kralen kleurscheiding met een magneet en biochemische analyses worden verwerkt. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-beklede superparamagnetische delen en de toepassing van spanning door Magneet gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesions induceert hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ligand Conjugatie naar Magnetic Beads
Opmerking: Ligand conjugatie wordt uitgevoerd met behulp superparamagnetische-tosyl geactiveerde kralen met een diameter 2,8 urn (voorraadoplossing concentratie 10 8 kralen / ml, 30 mg kralen / ml). Het volgende protocol is gebaseerd op monsters van ongeveer 2 x 10 5 cellen, die overeenkomen met MRC-5-cellen gekweekt tot 80% confluentie in een 60 mm weefselkweekplaat. Pas het volume van kralen en reagentia dienovereenkomstig bij gebruik van platen van verschillende grootte of cellen op verschillende confluences. Gebruik een hoeveelheid superparamagnetische om 2 korrels per cel. Daarom worden 4 x 10 5 kralen nodig voor een 60 mm plaat.
- Grondig resuspendeer de kralen in de oorspronkelijke flacon door vortexen ten minste 30 s. Aliquot 40 ul van de geresuspendeerde superparamagnetische (overeenkomend met 4 x 10 6 korrels) in 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Plaats de buis op een magnetische separatistand om de magnetische korrels te scheiden van de oplossing. Verwijder het supernatant, verwijdert buis uit het magnetische scheiding stand en resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
- Herhaal wasstap tweemaal met 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
- Combineer 100 ug Bovine fibronectine (FN) of andere celadhesie receptorligand de 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4 bevattende korrels en meng door pipetteren.
- Bovenstaande stappen herhalen door het vervangen FN of andere specifieke ligand met BSA, poly-D-lysine of apo-transferrine voor negatieve controles.
- Optioneel voor gel-analyse, neem een 10 pi hoeveelheid van ligand oplossing voor de analyse van het verknopen van efficiency en meng met een geschikt volume van geconcentreerde Laemmli Sample Buffer.
- Incubeer kralen met het ligand-bevattende oplossing gedurende 12-24 uur bij 37 ° C op een rotor.
- Als kraal aggregaten verschijnen nadat de reactie heeft plaatsgevonden, ultrasone trillingen (continu 39 W vermogen) voor niet meer dan 10-20 s.
- Isoleer de parels middels magnetische scheiding stand, zuigen de overblijvende oplossing en voeg 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6 oplossing. Incubeer gedurende 1 uur op rotor bij 37 ° C.
- Wassen kralen met een magneet tweemaal met 1 mL PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Resuspendeer kralen in 1 mL PBS / 0,2% BSA pH 7,6.
- Sonificeer kralen als aggregaten lijken niet meer dan 20-30 s.
- Optioneel verwijderen van een 10 pi aliquot om koppeling efficiëntie door western blot analyse van (te mengen met een geschikt volume van geconcentreerde Laemmli Sample Buffer).
- Overgaan tot assays of opslag cel kralen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
- Eventueel uitvoeren van een SDS-PAGE gel en vlek met Coomassie blauw naar FN verknoping analyseren om de magnetische korrels.
2. Toepassing van trekkrachten op de ligand-gecoate kralen Bond adhesiereceptoren de DorsaleOppervlak van cellen
- Cultuur hechtende cellen op 60 mm weefselkweekplaat in geschikte groeimedium (DMEM gewoonlijk 4,5 g / l D-glucose gesupplementeerd met FCS 10%) tot aan 80% confluentie.
- Bereid niet-denaturerende niet-ionische lysis buffer (20 mM Tris HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% NP-40) en chill microcentrifugebuizen.
- Pellet de-ligand beklede parels uit paragraaf 1.10 en resuspendeer in 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Voeg 100 ul van de ligand-gecoate parels oplossing voor 5 ml warm kweekmedium en vortex.
- Zuig medium in 60 mm cultuur schotel en voeg 5 ml warm groeimedium aangevuld met kralen.
- Incubeer gedurende 20 minuten onder celcultuur omstandigheden (37 ° C en 5% CO2) om de parels bezinken en zich aan de cellen. Het is cruciaal om niet meer dan 20 min sinds kralen kunnen worden geïnternaliseerd door fagocytose.
- Eventueel, observeren de parels onder een lichtmicroscoop met behulp van een 10X of 20X objective en controleer kraal hechting door lichtjes schudden van de schotel om onderscheid te maken tussen verbonden en drijvende kralen.
- Terwijl het houden van de cultuur schotel in de couveuse, wisselen de normale schaal deksel voor een deksel met een ronde 38 mm neodymium magneet bevestigd aan de bovenzijde. De magneet wordt vastgehouden door twee kleinere 13 mm neodymium magneten gepositioneerd op de onderzijde van het deksel. Omdat de magneten zijn zeer krachtig, manipuleren ze zorgvuldig.
- Incubeer cellen onderworpen aan spanning voor de gewenste punten in celcultuur omstandigheden (37 ° C en 5% CO2).
- Na de behandeling plaatst schotel op ijs en zorgvuldig zuigen het hele medium uit de schotel.
- Voeg 300 pl cellysis buffer en incubeer 10 min op ijs. Verzamel het lysaat met behulp van een celschraper en overbrengen in een voorgekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Pellet de magnetische korrels met behulp van de magnetische scheiding stand en breng de totale cellysaat om een nieuwe pre-chilled 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaar deze fractie bij -20 ° C voor verdere analyse.
- Was de kralen 3 maal met 1 ml ijskoude lysisbuffer. Voeg 50 ul Laemmli monsterbuffer aan de korrel pellet, meng door pipetteren en kookt bij 95 ° C gedurende 5 minuten met een droge blokverwarming. Deze fractie bevat de geïsoleerde hechting complexen. Overgaan tot biochemische analyse of op te slaan bij -20 ° C.
- Van het totale cellysaat verkregen na afscheiding parels (ongeveer 300 ui), verwijderen van een 50 ul aliquot voor western blot analyse.
OPMERKING: De 250 pl linker kan worden gebruikt voor verdere biochemische studies zoals eiwit-eiwit interactie studies (immunoprecipitatie GST pull-down assays) of GTPase activiteit experimenten (verandering van lysis buffer kan, afhankelijk van de GTPase plaats nodig).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema van de techniek wordt geïllustreerd in figuur 1a. Na conjugatie ligand, worden magnetische korrels geïncubeerd met cellen gedurende 20 min, en daarna een permanente magneet wordt gebruikt om trekkrachten toepassing van ongeveer 30-40 pN van verschillende tijdsduur. Figuur 1b toont 2,8 um FN-beklede magnetische korrels gebonden aan MRC5 celadhesie receptoren.
De wasstappen van superparamagnetische na cellysis zijn van cruciaal belang en bepalen de mate van zuivering. Een minimum van drie wassingen aanbevolen. GADPH immunoblots met lange blootstelling kan nuttig zijn om de zuiverheid van adhesie complexen (figuur 2a) testen.
FN-beklede parels werden gebruikt om de mechanotransductie processen op de hechting complexen na verloop van tijd als reactie op spanning te onderzoeken. Na magnetische scheiding van de hechting complex fractie werd het lysaat en de hechting complexe fractie geanalyseerdwestern blot. Zoals verwacht, zagen we talin, vinculin en paxillin, maar niet GAPDH in de hechting complexen fractie ook in afwezigheid van mechanische stimulatie (Figuur 2b). In overeenstemming met eerdere rapporten 32, 33, spanning getriggerd vinculin rekrutering van hechting complexen. Hoewel spanning geen invloed paxillin rekrutering adhesie complexen, werd de fosforylering op tyrosine 31 versterkt in reactie op mechanische spanning zowel in het totale cellysaat en de hechting complex fractie.
Figuur 1. Beschrijving van de methode. (A) Schematische weergave van de techniek. De cellen worden eerst gekweekt in medium kweek tot de gewenste confluentie bereikt. Vervolgens worden superparamagnetische delen toegevoegd gedurende 15-20 min. Trekkrachten ongeveer 30-40 pN zijnvervolgens aangebracht met de gekalibreerde magneet voor verschillende tijdsduur. (B) met fibronectine beklede superparamagnetische binden aan celadhesie receptoren. Cellen worden afgebeeld door fasecontrast met doorvallend-lichtmicroscopie 15 min na toevoeging van de superparamagnetische delen (witte pijl) in medium. (Top image: Schaal bar = 25 pm, image bottom: Schaal bar = 100 micrometer) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Mechanische spanning induceert adhesie rijping. (A) Zuivering van adhesie complexen. GAPDH immunoblotting wordt gebruikt als beladingscontrole voor totale cellysaat en de zuiverheid van hechting complexen controleren. Het nitrocellulosemembraan werd afgebeeld met behulp van een lange blootstelling aan th tonene afwezigheid van signaal in de hechting complex fractie. (B) Tension induceert hechting rijping. Loading control (GAPDH) en kandidaten (vinculin, talin en paxillin) bekend te worden aangeworven of gefosforyleerd op adhesie complexen in reactie op mechanische spanning worden onderworpen aan immunoblotting. Dit experiment werd uitgevoerd op MRC5 cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering van spanning celoppervlak adhesie receptoren brengen en laten hun daaropvolgende zuivering. Sommige stappen zijn essentieel voeren efficiënte hechting zuivering en mogelijke optimalisatie kan afhankelijk van de beoogde hechting receptoren. We presenteren potentiële problemen kan de gebruiker hieronder tegenkomen.
We gebruikten 2,8 urn diameter magnetische korrels maar grotere kralen kunnen worden gebruikt, zoals 4,5 pm diameter. Toch moet pareldiameter beperkt tot 2,5 urn sinds fagocytose sneller gedurende 30-60 minuten incubatie optreden en grotere kralen sterkere hechting zodat verplaatsing van het bolletje zou beperken onder magnetisch veld 34, 35. Daarom is het belangrijk om incubatietijd beperken tot korte perioden en met de juiste korrelgrootte. Het aantal korrels geïncubeerd per cel zal invloed hebben op de hoeveelheid force ervaring van een enkele cel. Terwijl men wil efficiënt cellen met spanning te stimuleren, kan teveel kralen per cel leiden tot activatie van irrelevante signaalroutes. We meestal incubeer gemiddeld twee kralen per cel FN-beklede korrels, maar deze hoeveelheid kan worden aangepast [1-5 korrels per cel] Afhankelijk van het celtype en de celoppervlak receptor. Betreffende de magneet, de hier beschreven werkwijze gebruikt een magneet die de resulterende kracht op een 2,8 urn werd gemeten (ongeveer 30-40 pN door het meten van de verplaatsing van de magnetische korrels in onverdunde glycerol, een Newtonse vloeistof met bekende viscositeit 31, hoewel is mogelijk om grotere magneten gebruiken om grotere hoeveelheid kracht indien nodig. Het is belangrijk op te merken dat deze magneten zijn zeer krachtig en zorgvuldig manipuleren.
Na 12-24 uur incubatie met ECM ligand (stap 1.7) en na 1 uur incubatie (stap 1,9) met PBS / 0,2% BSA pH 7,6 buffer, de magnetic microkralen kunnen aggregaten. Het is dan cruciaal kralen zoveel mogelijk scheiden de verhouding van 2 korrels per cel respecteren. Het is echter nog steeds een aanvaardbaar 5 zijn: 1 ratio. Beads scheiding kan worden bereikt door het mengen en pipetteren of door sonicatie, maar gedurende een korte periode (20-30 s).
Verscheidene eiwitten kunnen worden geconjugeerd aan de korrels, zoals integrine ligand (FN, collageen), recombinante eiwitten of antilichamen gericht op specifieke celoppervlakreceptoren. De bevestiging van ligand-gecoate magnetische korrels aan de dorsale celoppervlak kunnen worden verzwakt door de lage koppelingsefficiëntie van de ligand op de korrels. Het wordt aanbevolen om te controleren op ligandbinding aan de kralen door het verzamelen van een monster van het verdunde ligandoplossing voor het toevoegen aan de kralen en een hoeveelheid van kralen aan het einde van het koppelingsproces. Deze monsters kunnen worden verwerkt met SDS-PAGE-analyse en Coomassie blue kleuring.
Als er geen wijzigingen insignaalwegen of verwachte mechanosensing processen worden ontdekt, is het belangrijk om verschillende mogelijkheden te overwegen. Een manier om het probleem te identificeren is de duur van het experiment met de magneet moduleren. Het is bekend dat de snelheid van cellulaire processen afhankelijk van het gebruikte celtype. Een andere optie zou zijn om bekende spanning-gevoelige moleculen te testen en te controleren op hun post translationele modificaties door Western blotting (bijvoorbeeld paxillin fosforylering of FAK fosforylering kan worden geanalyseerd). De hoeveelheid kracht kan ook kritisch en met een dikkere magneet (dezelfde graad N52) of grotere kralen kan een optie zijn. Bovendien kan ligand / receptorbinding efficiëntie worden onderzocht door het analyseren van adhesie complex en kijk voor celoppervlak receptoren (zoals cadherine of integrine). De cel confluentie kan ook invloed hebben op de cellulaire respons op spanning. Zoals is waargenomen dat cellen / celadhesie kan beïnvloeden celgedrag en cystokeletal voorspanning is important te merken dat de confluentie van de cellulaire respons op spanning kan beïnvloeden. Hoewel aangeraden 80% confluentie voor het aanbrengen van spanning-integrine gebaseerde adhesies, kunnen verschillende omstandigheden worden getest om het experimentele systeem te optimaliseren.
Alhoewel deze methode een krachtig middel om de spanning gevoelige adhesome alsmede de geassocieerde signaaltransductiewegen ontcijferen, het had ook enkele beperkingen. Ten eerste, omdat de belangrijkste zorg die dergelijke geringe omvang magnetische korrels risico hun internalisatie door de cellen, kan deze methode worden gebruikt voor het bestuderen van langdurige mechanosensitieve signalering cellulaire reacties die cel lot modificeren zoals differentiatie en proliferatie. Een andere beperking ligt in de manier hoe krachten op de laag van cellen in de kweekplaat. Inderdaad, aangezien het magnetische veld altijd hoger aan de omtrek van de magneet krachten kunnen aan het oppervlak van de kweekplaat variëren met een afnemende gradiënt van celdie zich uitstrekt van de periferie naar het centrum en zou kunnen leiden tot heterogene cellulaire reacties.
De hier beschreven procedure is een eenvoudige en kosteneffectieve methode waarmee bestuderen mechanosensitieve cellulaire responsen en het onderzoeken van de moleculaire samenstelling van adhesie complexen onderworpen aan spanning. Andere benaderingen, zoals strekinrichting die cyclische belasting bedoeld cellen, leiden tot de toepassing van spanning op alle celoppervlakreceptoren interactie met de extracellulaire matrix. De hier beschreven methode heeft het voordeel dat kracht stimulatie van een specifieke subgroep van celoppervlak receptoren en een grote verscheidenheid van liganden kan worden gebruikt, zoals integrine liganden of antilichamen gericht celoppervlakreceptoren, waardoor de studie van vele verschillende mechanosensitieve systemen. Een ander voordeel van deze methode is dat het leidt tot het zuiveren van de eiwitten complexen die spanning ervaren en te werken aan dragende elemegen waarvan bekend is dat een centrale rol spelen in mechanotransductie 36. De gezuiverde adhesie complex kan ook worden gebruikt voor diverse biochemische benaderingen 14, zoals kinase assays kinaseactiviteit te onderzoeken in reactie op spanning of actine polymerisatie assay. Bovendien kan dit experimentele systeem worden gekoppeld met magnetische pincet om de cellulaire respons mechanische verkennen en deze reactie met het geïdentificeerde signaalpaden correleren. Interessant is dat magnetoplasmonic nanodeeltjes onlangs gebruikt voor het laden Notch en E-cadherine tot mechanisch nauwkeurige controle in tijd en ruimte 37. Deze recente ontwikkeling kan helpen bij het verkennen van mechanosensitieve signaalwegen met verschillende ruimtelijke, temporele en mechanische ingangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
CG wordt ondersteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), uit de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (Marie Curie Career Integration n˚8304162), en van European Research Council (ERC) in het kader van Horizon van de Europese Unie 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma (ERC Starting Grant n˚639300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , San Diego, Calif. (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
