Summary
Эта статья описывает экспериментальную модель гемостаза, которая одновременно измеряет функцию тромбоцитов и коагуляции. Тромбоцитами и фибрином измеряют флуоресценцию в режиме реального времени, и скорость адгезии тромбоцитов, скорость коагуляции, а начало коагуляции определяются. Модель используется для определения свойств тромбоцитов прокоагулянтную при потоке в концентратах для переливания.
Abstract
Микрожидком модели гемостаза оценки функции тромбоцитов в условиях гидродинамического сдвига, но в присутствии антикоагулянтов, этот анализ ограничивается только тромбоцитами осаждения. Сложные отношения между Ca 2+ -зависимые коагуляции и тромбоцитов функции требует тщательного и контролируемого рекальцификации крови перед анализом. Наша установка использует Y-образное смесительный канал, который поставляет концентрированный Ca 2+ / Mg 2+ буфер протекающей крови непосредственно перед перфузией, что позволяет быстро рекальцификацию без образца стазу. разница Десятикратное в скорости потока между двумя резервуарами минимизирует разбавление. Рекальцифицированной кровь затем перфузию в камере анализа коллагена покрытием, и дифференциальная маркировка позволяет в режиме реального времени изображений как тромбоцитов и фибрина осаждения с помощью флуоресцентной микроскопии видео. Система использует коммерчески доступные только инструменты, увеличивая шансы стандартизации. Воссоздание Thrombocytopenic крови с тромбоцитами из накренился концентратов, кроме того моделям переливание тромбоцитов, доказывая его использование в данном исследовании области. Примерные данные показали, что начало коагуляции и осаждения фибрин были линейно зависит от концентрации тромбоцитов, подтверждая связь между первичной и вторичной гемостаза в нашей модели. В сроки от 16 перфузионной мин, активация контакта не произошло, несмотря на рекальцификации к нормальному Са 2+ и Mg 2+ уровней. Когда фактор свертывания крови XIIa подавлялась ингибитором трипсина кукурузы, на этот раз кадр был даже больше, что указывает на значительный динамический диапазон, в котором можно оценить изменения в прокоагулянтной характере тромбоцитов. Co-иммобилизация тканевого фактора с коллагена значительно снижается время начала коагуляции, но не его скорость. Опция для изучения тканевого фактора и / или контактный путь повышает универсальность и полезность анализа.
Introduction
Первичный и вторичный гемостаз были первоначально задумана как два относительно выделяемой биохимических процессов. Первичный гемостаз рассматривается как важный вклад в условиях артериального кровотока, с ключевой ролью тромбоцитов, в то время как вторичный гемостаз был замечен доминировать коагуляции при венозного кровотока, что позволяет каскадом протеазы с образованием нерастворимого фибрина. За последние несколько десятилетий изменили эту традиционную точку зрения, по существу, признав, что активация тромбоцитов и свертывания взаимосвязаны и являются одинаково важными процессами во время физиологического и патологического гемостаза у всех (не экстремальных) гидродинамических кругах. Эта точка зрения была переведена в клинику, где все чаще используются анализы , разработанные для комплексного измерения коагуляции цельной крови, хотя и с большим количеством оставшихся вопросов , касающихся актуальности, применимости и полезности 1.
Недавно мы опубликовали функциональный анализ тромбоцитовКонцентраты с использованием микрожидкостных проточных камер , покрытых фибриллярного коллагена в модели ин витро переливании 2, с образцами , содержащими нормальное количество эритроцитов, плазмы и тромбоцитов. Этот метод использует гепарин или гирудин не кровь с антикоагулянтом, что подразумевает отсутствие или ограниченное участие вторичного гемостаза, который зависит от образования тромбина и ионизированного кальция (Ca 2+). Для того, чтобы поддержать образование тромбина и , таким образом , чтобы охватить все аспекты гемостаза при микрожидком потока, мы разработали дополнительный метод на той же технической платформе, в настоящее время , включая бесплатный Ca 2+. Таким образом, осаждение тромбоцитов и образование фибрина могут быть изучены, снова в модели трансфузии тромбоцитов, с целью оценки качества тромбоцитов концентрата.
В этом методе, тромбоциты и фибриноген помечены флуорофоров, которые полностью разделенных эмиссионных спектров. Двойной цвет, видео в реальном времени микроскопии затем позволяет анализироватьпервичной адгезии тромбоцитов, а также инициирование коагуляция и осаждение фибрина. Важной переменной в этом типе анализа является рекальцификации, поскольку добавление Ca 2+ в застывшей крови, перед перфузией, неизбежно вызовет контакт инициированное коагуляции в контейнере. Это будет начало смещения считывание из-за засорения труб и биочипов бухтах до перфузии. Таким образом, в нашем методе, цитрат антикоагулянтом крови и -содержащие буфер Ca 2+ закачивают отдельно через верхние ножки в Y-образной впускной камеры. Компоненты перемешивают в течение перфузией перед входом в камеру анализа, покрытый одним или в сочетании с рекомбинантным человеческим фактором ткани (rhTF) коллагена. Путем адаптации скорости потока отдельных насосов и концентрацию Ca 2+ в буфере, 10% разбавление конечного образца крови происходит.
Используя этот расширенный протокол, мы демонстрируем вклад Coagulaфициентом XII (FXII) и концентрация тромбоцитов в контакт инициации пути коагуляции в потоке. Наши данные также показывают, что путем покрытия rhTF наряду коллаген, фактор пути тканевого может быть измерено одновременно.
Protocol
Этот протокол следует институциональные этические принципы для исследования образцов человека, и информированное согласие было получено от всех участвующих доноров. Утверждение для экспериментов, описанных здесь, была получена из этическими комитетами Университетской больницы Антверпена (номер разрешения 16/10/120).
Примечание: показания температуры всегда при комнатной температуре, если не указано.
Установка 1. Микрофлюидикс
- Подготовка микрожидкостных проточной камеры каналы, трубы и соединительные штифты
- Ресуспендируют коллагена запаса пузырек вихревым перемешиванием, а затем разбавленным в растворе изотоническом глюкозы, предоставленного производителем до конечной концентрации 50 мкг / мл.
Примечание: Использование конского сухожилия коллаген, в основном состоят из фибрилл I типа. Лошадиного коллагена типа I часто называют "Horm" коллагена и является золотым стандартом для данного типа анализа, как для исторических ибиологические причины. Человеческого типа III коллагена также могут быть использованы, но эти фибриллы пальто менее хорошо, и реакция тромбоцитов не так сильна. Другие поверхности покрытия также могут быть использованы, например , как фактор фон Виллебранда, фибриноген, фибронектин, ламинин, витронектина, тромбоспондин-1, или комбинации этих 3. - Возьмите новый одноразовый микрофлюидальный биочипа с восемью прямыми, параллельными каналами и размеры, в мм, от 0,4 Вт х 0,1 х 20 Н Л. пипеткой 0,8 мкл коллагена в канал (ы) биочипа на одном конце и маркировать это как выпускное отверстие. Заполните только 5/6 от длины канала таким образом, что фибриллы коллагена не покрыты на входе в канал, так как это может привести к засорению, что препятствует эффективной перфузию.
- Выдержите биочипа при температуре 4 ° С в течение не менее 4 ч в увлажненной и запечатанном контейнере.
- Для изучения тканевой фактор (внешний) -опосредованного коагуляции в сочетании с контактным пути (внутренние), пальто каналы с Collaген и рекомбинантный фактор ткани человека (rhTF).
- Развести rhTF в 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) -buffered физиологический раствор (HBS, 0,9% (вес / объем) NaCl, рН 7,4, 1: 3000, концентрация на складе: 4,5 нМ).
- Удаления раствора коллагена покрытия через выпускное отверстие. Пипеткой 0,8 мкл rhTF в HBS (разведение 1/500 концентрации запасов, конечная концентрация 9 Pm) в выходе из канала, заполнение 5/6 длины канала, аналогичной стратегии коллаген-покрытия.
- Выдержите биочипа в течение еще 30 мин в увлажненном и запечатанном контейнере.
- Заполните каналы покрыты блокирующим буфером (1,0% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина и 0,1% (вес / объем) глюкозы в HBS), начиная с другого конца (обозначено, как входное отверстие). Заполните равное число Y-образных каналов с тем же блокирующим буфером, в смесительной биочипа.
- Убедитесь, что все каналы и руки канала полностью заполнены блокирующим буфером. Выдержите как биочипs, по крайней мере, 1 ч в увлажненной и герметичном контейнере.
- Для каждого используемого канала, подготовить две трубки 8 см длиной, длинный 2 см, и длинный 46 см. Поместите штифт в одном конце трех меньших труб и в обоих концах длинной трубки.
- Ресуспендируют коллагена запаса пузырек вихревым перемешиванием, а затем разбавленным в растворе изотоническом глюкозы, предоставленного производителем до конечной концентрации 50 мкг / мл.
- Подготовьте ополаскивания насос
- Промыть все Флюидика насос и подключенную трубку с дистиллированной водой.
- Жировые отливку биочип с точностью пыли протирать и денатурированным спиртом, чтобы удалить отпечатки и пыль.
- Заполните все трубки с блокирующим буфером перед подключением их к биочипов.
- Закрепите биочип с покрытием на автоматизированном столике микроскопа. Закрепить смесительную биочипа на той же высоте, что и предметный столик микроскопа, используя разъем лабораторный ножницеобразный.
- Подключите биочип с покрытием со смесительной биочипа с помощью длинной трубки, длинные 46 см. Убедитесь, что оба биочипов находятся на расстоянии так, чтобы трубка образует гибкую, но прямую линию. Присоединить разъем шприца штифт в Luer-совместимой трубки из промывочного насоса. Подключите его к свободному концу 2-сантиметровой трубки и закрепить другой конец к выходному отверстию биочипа с покрытием.
- Закрепить два 8-см трубку к смесительной входе биочипов с использованием своих контактов. Поместите свободный конец каждой трубки в пузырек HBS. Промойте все трубки и все каналы с 1 мл HBS.
Примечание: HBS течет из флакона через 8-см трубки к смесительной чипа и через 46 см трубки к микросхеме с покрытием (стекающая с непокрытыми к части с покрытием) в связи с тяговым усилием промывочного насоса. Этот шаг удаляет блокирующий буфер и плохо приклеенный коллаген (или rhTF в двойных покрытых биочипов).
- Подготовьте перфузионные насосы
- Откройте программное обеспечение драйвера перфузионной насосов. Проинициализируем насосы двойным щелчком по иконке шприцов в программном обеспечении.
- Выбор типа шприца, который будет использоваться: 1 мл шприцы для коагуляции бuffer и 2 мл шприцы для водостойких крови.
- Подключите шприцы к конструкции биочипов
- Отключите промывочный насос и все трубы, для одного, соединяющей два биочипов, за исключением. Отсоединен трубка повторно используется в следующих шагах.
- Подключение 2-см трубку с разъемом шприца штифтом к замку Люэра насосно-компрессорной трубы толстостенные отходов. Заполните толстостенную трубу со стандартным раствором пепсина с помощью шприца.
Примечание: Добавление пепсина к шлангу отходов и ингибирует лизирует после перфузионного свертываемость и, следовательно, предотвращает забивание системы на заднем конце. - Закрепите открытый конец толстостенной трубы с зажимом Кохера. Поместите подходящий контейнер для отходов с отбеливателем внизу, чтобы собрать проточные.
- Закрепить трубку с его булавкой к выходу биочипа с покрытием.
2. Подготовка проб крови
- Собрать кровь от здорового добровольца и его отдельных компонентов 4
- Собрать кровь в контейнере эвакуировали этилендиамин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Используйте этот пример только для выполнения полного анализа крови (CBC) с использованием автоматического гематологического анализатора.
- Собрать кровь в эвакуированных цитрат натрия контейнеров. 5 мл крови требуется для каждого канала.
- Поместите образец (ы) на горизонтальной ротатора в ожидании восстановления крови.
Примечание: Анализ должен быть завершен в течение 3 ч после кровопускания. Тромбоциты концентрата и цельной крови образцы ABO / RhD группы крови совпадают. - Центрифуга в течение 13 мин при 250 мкг для приготовления плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP). Не используйте центрифугу тормоз для предотвращения нарушения неплотно упакованных гранул.
- Перенести PRP в свежую коническую центрифужную пробирку. Центрифуга в течение 10 мин при 4500 х г (с тормозом), чтобы осадить тромбоциты и подготовить бедной тромбоцитами плазму (БТП). Откажитесь от PlatЭлет осадок. Выдержите PPP в водяной бане при 37 ° С.
- Передача уплотненных красных клеток крови в свежую коническую трубку путем прокалывания нижней части исходной с иглой 21 G.
Примечание: Остаточное количество тромбоцитов в уплотненных красных клеток фракции составляет 11 ± 4 х 10 3 за мкл (среднее ± стандартное отклонение, n = 10).
- Развести крови
- Определение гематокрита уплотненных красных кровяных клеток, полученных на этапе 2.1.6 с использованием автоматического гематологического анализатора.
- Определить концентрацию тромбоцитов концентрата тромбоцитов, который будет использоваться для анализа с помощью автоматизированного гематологического анализатора.
- Вычислить объем уплотненных красных кровяных телец, концентрата тромбоцитов и ППС , который будет давать 40% гематокрита и 250 × 10 3 тромбоцитов / мкл в конечном объеме 2,5 мл. Смешайте их, чтобы подготовить водостойких крови и выполнить CBC.
Примечание: Другие целевые титр клеток могут быть использованы, в зависимости от гое вопрос исследования. - Подготовить "пустой" контрольный образец , в котором объем тромбоцитов концентрата заменяется тот же объем физиологического раствора , чтобы определить концентрацию «эндогенные» тромбоцитов (т.е. не для банка крови Тромбоциты).
- Добавьте водостойких кровь для тромбоцитов и фибриногена
- Пипеткой 13 мкл 10,7 мг / мл раствора Alexa Fluor 405-меченого фибриногена (70 мкг / мл конечной концентрации) в пробирку и добавляют 1 мл разведенной крови.
Примечание: Фибриноген метили с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. - Смешайте еще 1 мл восстановленного крови в пробирку , содержащую 2 мкл 1 мМ DiOC 6 (1 мкМ конечной концентрации) , или содержащего 2 мкл 5 мМ кальцеина AM (5 мкМ конечная концентрация). Добавьте в пробирку, содержащую кровь с фибриногеном, давая конечного объема 2 мл и тромбоцитами фибриногена-sтойчивое крови.
Примечание: Выбор красителя может зависеть от исследования вопроса или предпочтений исследователя 5. Имейте в виду, что возбуждение любого красителя может вызвать фотохимические артефакты. - Аккуратно взболтайте. Инкубируйте образца в течение 10 мин при 37 ° С.
- Пипеткой 13 мкл 10,7 мг / мл раствора Alexa Fluor 405-меченого фибриногена (70 мкг / мл конечной концентрации) в пробирку и добавляют 1 мл разведенной крови.
- Подготовьте буфер коагуляции
- Готовят буфер коагуляции , содержащего 10 мМ CaCl 2 и 3,75 мМ MgCl 2 в HBS. Готовят 1 мл буфера коагуляции для одного канала.
- Фильтр-стерилизовать буфер коагуляции через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Предварительно нагреть это до 37 ° С.
3. Анализ Перфузия
- Фокус оптики микроскопа к коллагеновых волокон, прилипших к дну канала. Использование фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста (DIC). Выберите "Установить текущий Z для выбранных областей плитки" в программном обеспечении эксперимента в цифровом зафиксировать выбранный фокус.
- Определить области интереса (ROI) в выбранном канале с использованием программного обеспечения приобретения микроскопа.
Примечание: ROI может быть любая площадь поверхности произвольно выбранный в пределах канала перфузионного. Рекомендуется не анализировать образование тромба и генерацию фибрина близко к входным и выходным отверстием для того, чтобы избежать получения изображений неравномерно распределенных тромбов. Площадь поверхности ROI должна содержать значительное количество тромбов, чтобы позволить нивелирования вариабельности сигнала на отдельные пластинки. Расположение ROI в плоскости ху канала всегда фиксирована и определяется до перфузии. При необходимости, непокрытую часть канала может быть включено в анализ, чтобы определить, является ли тромбоциты связываются неспецифически с биочипа пластика. - Подготовка образцов для перфузией
- Установите шприц 1 мл раствора, содержащего 1 мл подогретого буфера коагуляции в перфузионной насоса.
- Смешайте подогретого водостойких кровь, аккуратно перевернув и нагрузка 2 мL в 2 мл шприц.
- Убедитесь в том, что весь воздух удален из обоих шприцев и подключить каждый к 8-см трубки с помощью соединителя шприца штифт.
- Prime соединители и трубки из обоих шприцев на высокой скорости (400 мкл / мин) и останавливается, когда все заполнено буфером свертывания крови или крови.
Примечание: При заливка трубки, буфер коагуляции и восстанавливали в крови будет немедленно смешивают в У-образный канал для смешивания биочипа при начале эксперимента, избегая введения воздуха к перфузионных камерах.
- С помощью булавки, закрепить другой конец обеих труб к расколу ног Y-образного канала в смесительном биочипа. Нижняя нога используется для перфузии буфера коагуляции и верхней части ноги для водостойких крови.
- Начало эксперимента, инициируя перфузию 4,4 мкл / мин для буфера коагуляции и 44 мкл / мин для водостойких крови. Снимите зажим Кохера на выходе из трубы отходов, чтобы позволить perfuSion.
Примечание: Скорость потока может быть изменен в зависимости от исследования вопроса. Начните секундомер для определения времени между началом эксперимента и началом захвата изображения в режиме реального времени. - Запись изображений каждые 10 с в течение 30 мин в режиме реального времени с помощью сбора и эксперимента программное обеспечение микроскопа. Начать запись, когда смесь разведенной крови и буфера коагуляции входит биочипа с покрытием, установленный на предметный столик микроскопа.
Примечание: Другие временные ряды могут быть использованы в зависимости от экспериментальной установки. Используйте увеличение 100X (10X цель и 10X линзы).
4. Оконечное Эксперимент
- Прекратить насосы и получение изображений через 30 мин или ранее, если сигнал насыщения. Отделить все трубки и шприцы, и отказаться от них как биологически опасные отходы.
5. Анализ данных
- Определить рост тромба (зеленая флуоресценция) и образование фибрина (фиолетовый fluorescencе) кинетика с программным обеспечением для анализа изображений. Следующие команды используются для программного обеспечения, используемого здесь:
- Откройте Обработка плагина: шить для того чтобы сшить бок о бок изображений в момент времени.
- Открыть Анализ плагин изображения для определения покрытия поверхности тромбоцитов.
- Откройте плагин Меру. Определить ROI, нарисовав область прямоугольника, включая все тромбов и фибриновых волокон; в этом протоколе, ROI представляет собой прямоугольник размером 637 мм 2.
Выберите вкладку All Views , чтобы включить все записанные моменты времени. - Использование Создание таблиц для автоматического создания таблицы , которая будет содержать среднее значение интенсивности флуоресценции выбранного прямоугольника области каждой временной точки.
- Сохранение электронных таблиц в формате XML.
- Откройте таблицу в программе электронных таблиц для дальнейших расчетов.
- Вычтите начальной (backgrouй) значение всех данных.
- Участок флуоресцентного сигнала в зависимости от времени, перфузионной для зеленых (Тромбоциты) и фиолетовый (фибрин) красителей.
Примечание: Примите во внимание время между инициализации насоса и фактической начальной точки захвата изображения. Образование тромба обычно представляет собой двухступенчатый процесс в этой модели: (1) "медленные" адгезии тромбоцитов (т.е., адгезия) к иммобилизованным коллагена с последующим (2) рост тромба свертывающей управляемой с "быстрым" увеличением как связывания тромбоцитов ( т.е. накопление) и отложение фибрина (т.е. коагуляция) (рисунок 1). - Вычислить наклон адгезии тромбоцитов и накопления с помощью линейной регрессии; этот наклон дает тромбоцитов кинетики роста тромба в каждой фазе его формирования.
- Вычислить наклон фибрина коагуляции и экстраполировать эту линию, чтобы перехватить оси Х, определение момента начала заболевания.
Representative Results
Анализ в режиме реального времени исходных данных описан на рисунке 1. Во- первых, тромбоциты прилипают к реактивной поверхности, что приводит к постоянному увеличению записанной зеленой флуоресценции (рис 1А, I), называется адгезией. Во время этой фазы, существует мало фиалка флуоресценции, указывая , что фибрин не или лишь слабо сформированы (Фигура 1В). При инициации коагуляции, фиолетово-флуоресцирующих отложения фибрина быстро (III), и в течение этого времени, тромбоцитов зеленой флуоресценции возрастает при примерно с той же скоростью, обозначаемые здесь как накопление тромбоцитов (II). Таким образом, один эксперимент возвращает три темпы роста флуоресценции (I, II, и III) в качестве суррогатного маркера для скорости, при которой тромбоцитов и фибрина осаждение происходит в этой модели. Кроме того, момент начала коагуляции ( о моменте начала (IV)) экстраполируется, что является определяющим фактором тромбоцитовпрокоагулянтное потенциал.
При отсутствии TF, инициация свертывания происходит медленно и в основном проходит через контактный путь , где внутренняя Тэнасе комплекс активирует FX посредством прямой активации FIX 6 с помощью FXI и / или FXII. Чтобы продемонстрировать FXII зависимость, 4 мкМ ингибитора трипсина кукурузы (CTI) добавляли для ингибирования активированного FXII (FXIIa) 7. Это ингибирование не влияет на адгезию тромбоцитов (фиг.2А), но коагуляция не начинал для произвольно заданной общей продолжительности перфузионной эксперимента (рис 2B и дополнительного видео 1).
В пробирке, контактный путь может быть инициирована инородных материалов , как стекло, или в клинических анализах с использованием минерального материала , как каолин. В естественных условиях, активированные тромбоциты обеспечивают отрицательный заряд 8 </ SUP> через мембрану воздействию кислых фосфолипидов 9, как фосфатидилсерин, и / или посредством высвобождения полифосфатов (полип) 10, 11. Наши микрофлюидальные в режиме реального времени анализа подражает последнего , потому что, в диапазоне концентраций тромбоцитов, гемостатический реакция зависела от количества тромбоцитов (рисунок 3). За счет увеличения количества тромбоцитов в разведенном образце, скорость адгезии (рис 3А), накопление (фигура 3В, зеленый), и коагуляция (фигура 3В, фиалка) линейно возрастает. О моменте начала значительно укорочена (3в) при увеличении концентрации тромбоцитов, предполагая , что пороговое число (активированный) , осажденных тромбоцитов требуется , чтобы вызвать коагуляцию.
После повреждения ткани в естественных условиях, однако, клетки TF-подшипник яnitiate свертывание крови через FVIIa-TF примесного Тэнасе комплекса в присутствии ионов Са 2+. Это имитируется в нашей экспериментальной установке путем последующего нанесения покрытия на коллаген-содержащих перфузионные камеры с липидированного rhTF. В парного анализа каналов , покрытых только или в комбинации с rhTF коллагена, коагуляция начало было значительно быстрее (фиг.4А). Скорость адгезии тромбоцитов не была линейной, поэтому никакой линейной регрессии не может быть выполнена (данные не показаны). И скорость коагуляции и накопления тромбоцитов не отличались от условий (4В-4С, Дополнительное видео 2).
Рисунок 1: Результаты регрессионного анализа адгезии тромбоцитов и коагуляции в микрофлюидальных перфузионных камерах. На этом рисунке уточняются параметры, полученные из реального времени флуоресценции исходных данных приобретенные в течение рекальцифицированной кровотока над реактивной поверхности. (А) Средняя интенсивность зеленой флуоресценции показывает отложение тромбоцитов в зависимости от времени перфузии. Кривая описывает бимодальное процесс , начинающийся с (I) медленно возрастающую линейную адгезию тромбоцитов с последующим (II) быстро растущего линейного накопления. Обе линейные части кривой регресс и наклон их описывает две скорости формирования тромба путем тромбоцитов флуоресценции; (Я) адгезия и (б) накопление. (Б) средняя интенсивность флуоресценции показывает фиолетовой отложение фибрина в зависимости от времени. Во время адгезии тромбоцитов, фиолетовый флуоресцентный практически отсутствует, в то время как он быстро развивается после начала коагуляции. (IV) о моменте начала определяется как пересечения с осью х экстраполированного линейной регрессии (III) на втором этапе формирования тромба фибрином флуоресценции обозначенной здесь в качестве коагуляции.эф = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: При отсутствии TF, свертывание в коллагеновых покрытием камер перфузия потока зависит от FXIIa. Микрожидкостных перфузия водостойких крови , содержащей CTI или управления буфером (контроль) проводили при скорости сдвига 1000 с -1 в общей сложности 30 мин. (А) Скорость адгезии тромбоцитов (с -1) не зависит от ИТК. (В) о моменте начала для ИТК-обработанных образцов было за пределом 30 мин эксперимента (показан пунктирной линией), демонстрирующий зависимость от FXIIa этого параметра. Бары и точки являются средними значениями, Усы стандартное отклонение. Статистический анализ был по парного критерия Стьюдента. (NS = не имеет существенного значения, п ≥3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: коагуляция в потоке зависит от количества тромбоцитов. Микрожидком эксперименты перфузионные были выполнены в коллагеновых покрытием камерах с разведенной крови в присутствии ионов Са 2+ и различных концентраций тромбоцитов (п ≥3). (А) Степень адгезии тромбоцитов (B) скорость накопления тромбоцитов (зеленый) и коагуляции (фиолетовый) и (С) о моменте начала показаны как функции концентрации тромбоцитов в разведенной крови. Точки являются средними значениями, Усы стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versiна этой фигуре.
Рисунок 4: Активация обоих TF и контактный затрагивающего пути коагуляции значительно укорачивает о моменте начала коагуляции. Водостойких крови, в присутствии ионов Са 2+, вливают через камеры , покрытый одним или с коллагеном и rhTF учиться самостоятельно контактного пути или комбинацию контактных и TF путей коллагена. (A) о моменте начала коагуляции существенно сокращается в TF-содержащих проточных камер. (B) Скорость накопления тромбоцитов в процессе коагуляции и (С) скорость коагуляции значимо не отличаются между коллагеном или только коллагеном и rhTF покрытием камеры потока. Бары и точки представляют собой средние значения; нитевидные кристаллы представляют собой стандартные отклонения. Статистический анализ был по парного критерия Стьюдента. (NS = не имеет существенного значения, * P < 0,05, п ≥3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительное видео 1: При отсутствии TF, свертывание в коллагеновых покрытием камер перфузия потока зависит от FXIIa. Роль контактного пути определяется в коллагеновых покрытием камер перфузия потока. (A) , наложенное последовательность флуоресцентного изображения тромбоцитов (зеленый) и фибрина (оген) (фиолетовый) осаждения при отсутствии CTI. (В) той же последовательности , как панели А , но с зеленого канала выключен. (C) , наложенное последовательность флуоресценции изображение тромбоцитов (зеленый) и фибрина (оген) (фиолетовый) осаждения в присутствии ИТК. (D) , и ту же последовательность , как панели С , но с зеленого канала выключен.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео 2: Активация обоих TF и контактный путь значительно укорачивает коагуляционной о моменте начала. Для изучения роли TF, использовались проточных камер, покрытый одним или с коллагеном и rhTF коллагена. (A) , наложенное последовательность флуоресцентного изображения тромбоцитов (зеленый) и фибрина (оген) (фиолетовый) осаждения в проточных камерах , покрытых только с коллагеном. (В) той же последовательности , как панели А , но с зеленого канала выключен. (C) , наложенное последовательность флуоресценции изображение тромбоцитов (зеленый) и фибрина (оген) (фиолетовый) осаждения в проточных камерах , покрытых коллагена и rhTF. (D) той же последовательности , как панели С , но с зеленым канала пехед прочь. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить это видео.
Discussion
Переливание концентратов тромбоцитов назначают для тромбоцитопенической пациента, чтобы предотвратить или остановить кровотечение. Его клиническое воздействие было недавно выделен в историческом обзоре острого лейкоза 12, напомнив , что увеличение выживаемости педиатрических больных в шестидесятых и семидесятых годов были в основном связаны с улучшением (тромбоцитов) трансфузионной медицины. Тромбоцитов концентраты также используются, чтобы остановить кровотечение в острой травмы или во время операции. В этих условиях, тромбоциты с отличными прокоагулянтных свойствами, которые быстро инициируют гемостаз, являются предпочтительными, но тромбоциты концентраты получают из пожертвований добровольных доноров и, в отличие от фармакологического препарата, стандартизованы препарата только, а не (химического) состава. Таким образом, несколько вопросов в банковской сфере в крови являются без ответа, в том числе и на оптимальных условиях донорства, условий хранения и практики переливания крови. В области плatelet (переливание) биологии, много вопросов по оформлению клеток из обращения, вклад трансфузии тромбоцитов в гемостазе, или их иммунология также остаются без ответа.
Многочисленные лабораторные методы для анализа функции тромбоцитов доступны, но они в основном решить особую аспект функции тромбоцитов, как агрегирование или дегрануляции 13. Для того, чтобы оценить в целом тромбоциты и концентратов тромбоцитов, комплексные модели гемостаза необходимы, и они должны включать в себя гидродинамику. Кровь реологию имеет решающее значение для правильной интерпретации тромбоцитов поведение во время остановки кровотечения 14, 15 или 16 , тромбоз, даже если антикоагулянтная терапия предотвращает Са 2+ и / или тромбин , чтобы участвовать в присутствии цитрата или гепарина, соответственно 2. Для изучения взаимосвязи между свертывающей и функции тромбоцитов в потоке 17, 18, нормальное образование тромбина требуется, и , следовательно, свободный Са 2+ , а также. Экспериментальная установка для исследования гемостаза при этих условиях является сложной, так как меры, чтобы предотвратить "артефакт" или неконтролируемая активация коагуляции следует принимать как можно больше. Кроме того, многие специализированные исследовательские группы используют заказные аппаратные средства 19, 20, что приводит к существенной межлабораторный изменчивости 5. Типичные ограничения этого подхода являются использование прямоугольных сосудов, профилей без пульсирующих потоков и поверхностных покрытий нечеловеческих 5. Анализ мы описываем здесь используются коммерчески доступные инструменты и, следовательно, могут быть пригодны для стандартизации.
Поскольку реакции коагуляции каскад легко активируется, как только кровь не содержится в человеческом теле, контролируемое рекальцификации является ключевым шагом. TO добиться этого, добавление Ca 2+ должно быть отложено до непосредственно перед перфузией над реактивным коллагеном поверхности, потому что , когда 2+ буфер Ca поставляется навалом застывшей крови, коагуляция неизбежно происходит, в конце концов засорение трубки и смещения данных интерпретация (данные не показаны). Решение этой проблемы заключается в прокачивать буфер Ca 2+ и кровь по отдельности, что позволяет для смешивания с помощью конвективных и диффузионных сил во время перфузии на своем пути к анализу камеры. Полное смешение достигается в 46-сантиметровом участке трубы между смешивания и анализа камер с. Эта длина была рассчитана для оптимального времени пребывания реагентов в смесь на основе фундаментальных законов массы и конвективного переноса 21 во время перфузии при скорости потока , используемого (1000 с -1). Такой подход оказался управляемым и воспроизводимым.
Контактная активация коагуляции иногда рассматривается как артефакт простойотбор проб крови и следует избегать при интерпретации время свертывания. Таким образом, мы показали, что, при отсутствии ингибиторов, контактно-индуцированной коагуляции начинается при 16.7 мин (± 3,7 мин) перфузией. При наличии CTI ингибировать FXIIa-опосредованную активацию контакта, коагуляция не инициируется в течение определенного произвольно ходе эксперимента (30 мин). Это окно экспериментов достаточно долго, чтобы различать образцы, которые про- или антитромботической. Даже при том, свертывание путем активации контакта может быть нежелательным последствием контакта крови искусственных поверхностей, наши данные показывают четкую биологическую эффекта дозу тромбоцитов. Это может быть важно для трансфузионной медицины, потому что последние данные по FXII, тромбоцитов полифосфаты 10, распределение 22 фосфатидилсерин и тромбоцитов микрочастицы 23 фактически переоценены контактной коагуляции тропинка в качестве важного фактора для гемостаза, еособенно в контексте тромбоза 24. Например, переменная выход трансфузии тромбоцитов у пациентов или переменной экспрессии фосфатидилсерина из насыпным тромбоцитов может, таким образом, вызывать изменчивость в терапевтической эффективности в случае успеха коагуляции показано, что в зависимости от этих факторов.
К со-иммобилизации липидированного rhTF с коллагеном, внеш пути коагуляции, или пути TF, активируется во время осаждения тромбоцитов на коллагене. Это расширяет анализ ее наиболее полный режим, в качестве модели для ран, которые приносят кровь в контакт с клетками и ткани TF-подшипник. Наши данные показывают, что совместное иммобилизации коллагена и TF уменьшает момент начала коагуляции, но не изменяет скорость коагуляции. Следует отметить, что количество rhTF иммобилизованным на поверхности является важной переменной в данной модели 25, 26 и должен быть стандартизован в рамках данного исследования. В PresenCE ИТК, путь ТФ может изучаться исключительно (не показано), так как предотвращается активация контактная.
В заключение, наша экспериментальная установка сочетает в себе модель переливания путем воссоздания тромбоцитопенической крови с тромбоцитами и насыпным модели гемостаза путем кальций-зависимой отложение тромбоцитов и образованием фибрина при гидродинамическом потоке. Этот анализ будет использоваться для ответа на вопросы о прокоагулянтной природе насыпным тромбоцитов и методы подготовки концентрата тромбоцитов эффекты имеют по этому вопросу.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Фондом исследований и разработок бельгийской службы Красного Креста Фландрии крови. Мы признаем финансовую поддержку, оказываемую "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - специальное исследование фонда) из Гентского университета, предоставленного проекта с номером контракта BOF30290744.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
References
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
- Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
