Summary
Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.
Abstract
Mikrofluidik-Modelle der Hämostase Beurteilung der Thrombozytenfunktion unter den Bedingungen der hydrodynamischen Scherung, aber in der Gegenwart von Antikoagulantien ist diese Analyse nur auf die Blutplättchenablagerung eingeschränkt. Die komplizierte Beziehung zwischen Ca 2+ -abhängigen Koagulation und Plättchenfunktion erfordert eine sorgfältige und Verkalkung von Blut vor der Analyse gesteuert. Unser Setup verwendet eine Y-förmige Mischkanal, der kurz vor der Perfusion Blut fließt konzentrierte Ca 2+ / Mg 2+ Puffer liefert, wodurch eine schnelle Recalcifizierung ohne Probe Stase. Eine zehnfache Differenz in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen den beiden Reservoiren minimiert Verdünnung. Die rekalzifiziertem Blut wird dann in einem kollagenbeschichteten Analysekammer perfundiert, und differentielle Markierung ermöglicht Echtzeit-Bildgebung sowohl Blutplättchen- und Fibrinablagerung mittels Fluoreszenzvideomikroskopie. Das System verwendet nur kommerziell verfügbaren Tools, die Chancen der Standardisierung zu erhöhen. Rekonstitution von thrombocytopenic Blut mit Blutplättchen aus überhöhten konzentriert weiterhin Modelle Thrombozytentrans, die Anwendung in dieser Forschungsbereich unter Beweis. Beispielhafte Daten zeigten, dass die Koagulation Einsetzens und Fibrinablagerung auf der Plättchenkonzentration linear abhängig waren, das Verhältnis zwischen Primär- und Sekundär Hämostase in unserem Modell bestätigt. In einem Zeitraum von 16 min Perfusion, Kontaktaktivierung fand nicht statt, trotz Recalcifizierung zu normalen Ca 2+ und Mg 2+ Ebenen. Wenn Gerinnungsfaktor XIIa durch corn Trypsininhibitor inhibiert wurde, war dieser Zeitrahmen noch länger, einen beträchtlichen Dynamikbereich anzeigt, in dem die Änderungen in der prokoagulierenden Natur der Plättchen beurteilt werden kann. Co-Immobilisierung von Gewebefaktor mit Kollagen reduziert signifikant die Zeit der Koagulation zu Beginn, aber nicht seine Rate. Die Option, den Gewebefaktor und / oder des Kontaktweges zu untersuchen erhöht die Vielseitigkeit und Nützlichkeit des Assays.
Introduction
Primäre und sekundäre Hämostase wurden ursprünglich als zwei relativ trennbaren biochemische Prozesse konzipiert. Primäre Hämostase wurde als wesentlicher Faktor bei der arteriellen Strömungsbedingungen mit einer Schlüsselrolle für Blutplättchen betrachtet, während sekundäre Hämostase Koagulation unter venösen Blutfluss zu beherrschen war zu sehen, so dass die Protease Kaskade unlösliche Fibrin zu bilden. In den letzten Jahrzehnten haben diese traditionelle Sicht wesentlich umgestaltet, der Erkenntnis, dass die Plättchenaktivierung und Koagulation sind voneinander abhängig und sind ebenso wichtige Prozesse bei der physiologischen und pathologischen Hämostase in allen (nicht extrem) hydrodynamischen Milieus. Diese Ansicht wurde in die Klinik übersetzt, wo Tests umfassend Voll Blutgerinnung entwickelt , zu messen sind zunehmend eingesetzt, wenn auch mit vielen noch offenen Fragen auf Relevanz, Anwendbarkeit und Nützlichkeit 1.
Wir veröffentlichten kürzlich eine funktionelle Analyse von PlättchenKonzentrate Kammern mikrofluidischen Strömungs beschichtet mit fibrillärem Kollagen in einem in vitro Modell der Transfusions 2 mit Proben , die normale Mengen von roten Blutkörperchen, Plasma und Blutplättchen verwendet wird . Diese Methode verwendet Heparin oder Hirudin antikoaguliertes Blut, keine oder geringe Beteiligung der sekundären Hämostase impliziert, die auf Thrombin - Erzeugung und ionisiertem Calcium (Ca 2+) abhängig ist. Zur Bildung von Thrombin unterstützen und somit alle Aspekte der Hämostase unter mikrofluidische Strömung aufzunehmen, entwickelten wir eine ergänzende Methode auf derselben technischen Plattform, jetzt mit freiem Ca 2+. Auf diese Weise wird die Blutplättchenablagerung und Fibrin-Bildung kann in einem Modell der Blutplättchentransfusion untersucht, wieder, um Plättchenkonzentratqualität beurteilen.
Bei diesem Verfahren werden die Blutplättchen und Fibrinogen mit Fluorophoren markiert, die vollständig Emissionsspektren getrennt haben. Dual-Farbe, Echtzeit-Video-Mikroskopie ermöglicht dann die Analyse vonprimäre Plättchenadhäsion sowie Koagulation Initiierung und Fibrinablagerung. Eine wichtige Variable in dieser Art von Assay ist Rekalzifizierung, da die Zugabe von Ca 2+ auf statische Blut, vor der Perfusion wird unweigerlich Kontakt initiierte Koagulation in dem Behälter führen. Diese Einweihung wird Bias das Auslesen aufgrund Verstopfung der Schläuche und Biochip Einlässe vor der Perfusion. Daher wird in unserem Verfahren antikoaguliertem Citratblut und eine Ca 2+ -haltigem Puffer getrennt durch die oberen Schenkel eines Y-förmigen Einlaßkammer gepumpt. Die Komponenten werden während der Perfusion vermischt, bevor eine Analysekammer mit Kollagen alleine oder in Kombination mit rekombinantem menschlichen Gewebefaktor (rhTF) beschichtet eintritt. Durch die Anpassung nimmt die Strömungsgeschwindigkeiten der getrennten Pumpen und die Konzentration von Ca 2+ in den Puffer, eine 10% ige Verdünnung der endgültigen Blutprobe Platz.
Mit diesem erweiterten Protokoll zeigen wir den Beitrag von CoagulatFaktors XII (FXII) und Blutplättchenkonzentration Weg Koagulation Initiierung unter Strömung zu kontaktieren. Unsere Daten zeigen auch, dass rhTF neben Kollagen kann der Gewebefaktor-Pathway gleichzeitig durch Beschichtung gemessen werden.
Protocol
Dieses Protokoll folgt die institutionellen ethischen Richtlinien für die Forschung an menschlichen Proben, und informierte Zustimmung wurde von allen Spendern beteiligt erhalten. Zulassung für den hier beschriebenen Experimenten wurde von der Institutional Review Board der Universitätsklinik Antwerpen (Zulassungsnummer 16/10/120) erhalten.
Hinweis: Temperaturangaben sind immer Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.
1. Mikrofluidik-Setup
- Bereiten Sie die mikrofluidischen Strömungskammer Kanäle, Schläuche und Verbindungsstifte
- Resuspendieren Kollagen Lager Fläschchen mit dem Vortexmixer, und dann in der isotonische Glukoselösung verdünnen vom Hersteller bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zur Verfügung gestellt.
HINWEIS: Verwenden Sie Pferde-Sehnenkollagen, hauptsächlich bestehend aus Typ-I-Fibrillen. Die Pferde-Kollagen Typ I wird oft bezeichnet als "Horm" Kollagen und ist der Goldstandard für diese Art von Test auf, sowohl historische als auchbiologischen Gründen. Menschliche Kollagen Typ III kann auch verwendet werden, aber diese Fibrillen Mantel weniger gut, und die Blutplättchenantwort ist nicht so stark. Andere Beschichtungs Oberflächen können auch verwendet werden, wie beispielsweise von Willebrand - Faktor, Fibrinogen, Fibronectin, Laminin, Vitronektin, Thrombospondin-1, oder Kombinationen dieser drei. - Nehmen Sie eine neue Einweg-mikrofluidischen Biochip mit acht geraden, parallelen Kanälen und Abmessungen in mm, 0,4 cm x 0,1 H x 20 L. Pipettieren 0,8 ul von Kollagen in den Kanal (n) des Biochips an einem Ende und beschriften dies als der Abfluss. Füllen nur 5/6 der Kanallänge, so dass die Kollagenfibrillen nicht am Kanaleinlaß beschichtet sind, weil dies ein Verstopfen verursachen kann, was eine effiziente Perfusion behindert.
- Inkubieren des Biochips bei 4 ° C für mindestens 4 h in einem befeuchteten und verschlossenen Behälter.
- Zu Gewebefaktor (extrinsischen) -vermittelte Koagulation in Verbindung mit dem Kontaktpfad (intrinsisch), Beschichtung der Kanäle mit Colla studierengen und rekombinanten humanen Gewebefaktor (rhTF).
- Verdünnte rhTF in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) -gepufferten saline (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4, 1: 3.000, Stammkonzentration: 4,5 nM).
- Entfernen Sie die Kollagen-Beschichtungslösung über die Steckdose. Pipettieren 0,8 ul rhTF in HBS (Verdünnung 1/500 Stoffkonzentration, Endkonzentration: 21.00 Uhr) in den Auslass des Kanals, Füllen 5/6 der Kanallänge, ähnlich wie die Kollagen-Beschichtung Strategie.
- Inkubieren des Biochips für weitere 30 min in einer befeuchteten und verschlossenen Behälter.
- Füllen der beschichteten Kanäle mit Blockierungspuffer (1,0% (w / v) Rinderserumalbumin und 0,1% (w / v) Glucose in HBS), vom anderen Ende her (als Einlass gekennzeichnet). Füllen eine gleiche Anzahl von Y-förmigen Kanäle mit dem gleichen Blockierungspuffer in einem Misch Biochip.
- Stellen Sie sicher, dass alle Kanäle und Kanalarme sind vollständig mit Blocking-Puffer gefüllt. Inkubieren sowohl Biochips für mindestens 1 h in einem befeuchteten und verschlossenen Behälter.
- Für jeden Kanal in Gebrauch ist, bereiten zwei Schläuche von 8 cm lang, ein 2 cm lang, und ein 46 cm lang. Platzieren einen Stift in einem Ende der drei kleineren Schlauch- und in beiden Enden des längsten Rohr.
- Resuspendieren Kollagen Lager Fläschchen mit dem Vortexmixer, und dann in der isotonische Glukoselösung verdünnen vom Hersteller bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zur Verfügung gestellt.
- Bereiten Sie die Spülpumpe
- Spülen Sie alle Pumpe Fluidik und den angeschlossenen Schlauch mit destilliertem Wasser.
- Entfetten Gussteil der Biochip mit einer Genauigkeit staubfrei wischen und denaturierten Alkohol Drucke und Staub zu entfernen.
- Füllen Sie alle Schläuche mit Puffer blockiert, bevor sie an die Biochips zu verbinden.
- Befestigen Sie den beschichteten Biochip auf die automatisierte Mikroskoptisch. Befestigen Sie das Mischen von Biochips auf der gleichen Höhe wie der Mikroskoptisch ein Labor Scherenheber mit.
- Schließen Sie den beschichteten Biochip mit dem Misch Biochip die längste Schlauch mit, 46 cm lang. Stellen Sie sicher, dass beide Biochips in einem Abstand sind, so dass der Schlauch eine flexible, aber gerade Linie bildet. Bringen Sie eine Spritze Steckerstift in den Luer-kompatiblen Schlauch der Spülpumpe. Verbinden Sie es mit dem freien Ende der 2-cm Schlauch und befestigen Sie das andere Ende mit dem Ausgang des beschichteten Biochips.
- Befestigen Sie die zwei 8-cm Schlauch mit dem Misch Biochip Einlass mit den Stiften an. Legen Sie das freie Ende jedes Rohr in einem Fläschchen von HBS. Spülen Sie alle Schläuche und alle Kanäle mit 1 ml HBS.
HINWEIS: HBS fließt aus dem Fläschchen durch die 8-cm-Rohr in die Misch Chip und durch den 46-cm-Schlauch an den beschichteten Chip (von der unbeschichteten zu der beschichteten Teil fließt) aufgrund der Zugkraft der Spülpumpe. Dieser Schritt entfernt die Blockierungspuffer und schlecht eingehalten Kollagen (oder rhTF in doppelt beschichteten Biochips).
- Bereiten Sie die Perfusion Pumpen
- Öffnen Sie die Treibersoftware der Perfusions-Pumpen. Initialisieren Sie die Pumpen mit einem Doppelklick auf das Spritzen-Symbol in der Software.
- Wählen Sie den Typ der Spritze, die verwendet werden: 1 ml Spritzen für die Koagulation bUffer und 2 ml Spritzen für die Rekonstitution Blut.
- Schließen Sie die Spritzen an die Biochips
- Trennen Sie die Spülpumpe und alle Schläuche, mit Ausnahme des einen, die die beiden Biochips. Die getrennten Schlauch wird in den folgenden Schritten verwendet.
- Schließen Sie das 2-cm Schlauch mit der Spritze Steckerstift an die Luer-Lock von einem dickwandigen Abfallleitung. Füllen Sie den dickwandigen Rohr mit Standard-Pepsin-Lösung mit einer Spritze.
HINWEIS: Die Zugabe von Pepsin auf die Abfallleitung hemmt und lysiert Gerinnungs post-Perfusion und damit verhindert das Verstopfen des Systems am hinteren Ende. - Sichern Sie das offene Ende des dickwandigen Rohr mit einer Klammer Kocher. Stellen Sie einen geeigneten Abfallbehälter mit Bleichmittel unter, um die Durchfluss sammeln.
- Fixieren den Schlauch mit seinem Zapfen mit dem Auslass des beschichteten Biochip.
2. Herstellung von Blutproben
- Sammeln von Blut von einem gesunden Freiwilligen und trennen seiner Komponenten 4
- Sammeln Sie Blut in einem evakuierten Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Behälter. Verwenden Sie dieses Beispiel nur für ein komplettes Blutbild durchführt (CBC) eine automatisierte Hämatologie-Analysator.
- Sammeln Sie Blut in evakuierten Natriumcitrat Containern. 5 ml Blut pro Kanal erforderlich.
- Legen Sie die Probe (n) auf einer horizontalen Rotator anhängige Blut Rekonstitution.
HINWEIS: Der Test sollte innerhalb von 3 h von Aderlass abgeschlossen sein. Platelet-Konzentrat und Vollblut-Proben sind ABO / RhD Blutgruppe abgestimmt. - Zentrifuge für 13 min bei 250 · g zu plättchenreiches Plasma (PRP) vorzubereiten. Verwenden Sie die Zentrifuge Bremse nicht Störung des lose gepackten Pellets zu verhindern.
- Übertragen Sie das PRP in ein frisches konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 10 min bei 4500 × g (mit Bremse), um die Blutplättchen zu pelletieren und plättchenarmes Plasma (PPP) vorzubereiten. Entsorgen Sie die platelet Pellet. Inkubieren des PPP in einem Wasserbad bei 37 ° C.
- Übertragen die gepackten roten Blutkörperchen zu einem frischen konischen Rohr durch den Boden des Original mit einer 21 G Nadel zu perforieren.
HINWEIS: Die Restthrombozytenzahl in der gepackten roten Zellfraktion beträgt 11 ± 4 x 10 3 pro Mikroliter (Mittelwert ± SD, n = 10).
- Rekonstitution Blut
- Bestimmen den Hämatokritwert der gepackten roten Blutkörperchen, hergestellt in Schritt 2.1.6 einen automatisierten Hämatologie-Analysegerät verwendet wird.
- Bestimmung der Blutplättchenkonzentration des Blutplättchenkonzentrats, das für die Analyse verwendet wird, eine automatisierte Hämatologie-Analysator verwendet wird.
- Berechnen des Volumens der gepackten roten Blutkörperchen, Blutplättchenkonzentrat und PPP , das einen 40% Hämatokrit und 250 x 10 3 Blutplättchen / ul in einem 2,5 ml Endvolumen ergibt. Mischen Sie diese rekonstituierten Blut vorzubereiten und durchzuführen, eine CBC.
HINWEIS: Weitere Ziel Titern von Zellen kann verwendet werden, abhängig von the Forschungsfrage. - Vorbereiten eines "leeren" Kontrollprobe , in der das Volumen des Plättchenkonzentrats durch das gleiche Volumen Kochsalzlösung ersetzt wird , um die Konzentration von "endogene" Blutplättchen (dh nicht-Blutbank - Blutplättchen) zu bestimmen.
- Beschriften Sie das aufgelöste Blut für Thrombozyten und Fibrinogen
- Pipettieren 13 ul einer 10,7 mg / ml-Lösung von Alexa Fluor 405-markiertem Fibrinogen (70 ug / ml Endkonzentration) in einem Reagenzglas und 1 mL rekonstituierte Blut.
HINWEIS: Fibrinogen beschriftet wurde mit einem handelsüblichen Kit nach der Anleitung des Herstellers. - Mischen eine weitere 1 ml rekonstituierter Blut in einem Teströhrchen , das 2 & mgr; l von 1 mM DiOC 6 (1 & mgr; M Endkonzentration) oder mit 2 & mgr; l von 5 mM Calcein AM (5 & mgr; M Endkonzentration). Hinzu kommt die Röhre das Blut mit Fibrinogen enthält, um ein Endvolumen von 2 ml plättchen geben und Fibrinogen-senthaltene Blut.
HINWEIS: Die Wahl der Farbstoff kann auf die Forschungsfrage abhängen oder der Präferenz des Forschers 5. Beachten Sie, dass Anregung jeder Farbstoff photo Artefakte verursachen können. - Vorsichtig mischen durch Umdrehen. Inkubieren der Probe für 10 min bei 37 ° C.
- Pipettieren 13 ul einer 10,7 mg / ml-Lösung von Alexa Fluor 405-markiertem Fibrinogen (70 ug / ml Endkonzentration) in einem Reagenzglas und 1 mL rekonstituierte Blut.
- Bereiten Sie die Gerinnungspuffer
- Vorbereitung Gerinnungspuffer 10 mM CaCl 2 und 3,75 mM MgCl 2 in HBS enthält. Vorbereitung 1 mL Gerinnungspuffer für einen Kanal.
- Filter-Sterilisieren der Gerinnungspuffer durch einen 0,2 um-Filter. Vorwärmen diese auf 37 ° C.
3. Perfusions-Assay
- Konzentrieren Sie die Mikroskop-Optik auf den Kollagenfasern auf den Boden des Kanals eingehalten. Verwenden Sie Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC). Wählen Sie "Set aktuelle Z für ausgewählte Fliese Regionen" in der Experiment-Software digital die gewählte Fokus beheben.
- Definieren Sie eine Region of Interest (ROI) in dem ausgewählten Kanal die Erfassungssoftware des Mikroskop.
HINWEIS: Der ROI jeder Oberfläche beliebig innerhalb eines Perfusions-Kanal ausgewählt werden kann. Es wird empfohlen, nicht die Thrombusbildung und Fibrinbildung nahe dem Einlass und Auslass zu analysieren, um Bilder von ungleichmäßig verteilten Thromben zu vermeiden, zu erwerben. Die ROI-Oberfläche sollte eine erhebliche Anzahl von Thromben enthalten für die Nivellierung der Signalvariabilität durch einzelne Plättchen zu ermöglichen. Die Lage des ROI in der xy-Ebene des Kanals wird immer festgelegt und vor der Perfusion bestimmt. Falls erforderlich, kann der unbeschichtete Teil des Kanals in die Analyse einbezogen werden, um zu bestimmen, ob Blutplättchen unspezifisch an den Biochip Kunststoff binden. - Bereiten Sie die Proben für die Perfusion
- Montieren einer 1 ml Spritze, die 1 ml vorgewärmtes Gerinnungspuffer in der Perfusionspumpe.
- Mischen Sie die vorgewärmte rekonstituierten Blut durch sanftes Umdrehen und Last 2 mL in einer 2 ml-Spritze.
- Stellen Sie sicher, dass alle Luft aus den beiden Spritzen entfernt und schließen Sie sie an einem 8-cm Schlauch mit einer Spritze Steckerstift verwenden.
- Prime die Anschlüsse und Schläuche beider Spritzen mit hoher Geschwindigkeit (400 & mgr; l / min) und zu stoppen, wenn alles mit Gerinnungspuffer oder Blut gefüllt ist.
Hinweis: Durch den Schlauch Priming wird die Gerinnungspuffer rekonstituiert und Blut sofort in den Y-förmigen Kanal des Misch Biochip gemischt werden, wenn das Experiment ausgehend, die Vermeidung der Einführung von Luft in den Perfusionskammern.
- Mit Stiften, befestigen Sie das andere Ende der beiden Schläuche zu den geteilten Schenkel des Y-förmigen Kanal in der Misch Biochips. Der untere Schenkel ist zur Perfusion Gerinnungspuffer und das obere Bein für rekonstituierten Blut verwendet.
- Starten Sie das Experiment durch Perfusion mit 4,4 & mgr; l / min für die Koagulation Puffer und 44 & mgr; l / min für rekonstituierten Blut zu initiieren. Entfernen Sie den Kocher Klemme am Ausgang des Abfallleitung zu ermöglichen Perfusion.
HINWEIS: Durchflussrate kann je nach Fragestellung verändert werden. Starten einer Stoppuhr die Zeit zwischen dem Beginn des Experiments und dem Beginn des Echtzeitbildaufnahme zu bestimmen. - Nehmen Sie Bilder alle 10 s für 30 Minuten in Echtzeit mit dem Erwerb und Experiment-Software des Mikroskops. Starten Sie die Aufnahme, wenn die Mischung aus rekonstituierten Blut und Gerinnungspuffer des beschichteten Biochip auf dem Mikroskoptisch montiert eintritt.
Hinweis: andere Zeitreihen können je nach Versuchsaufbau verwendet werden. Verwenden Sie ein 100-facher Vergrößerung (10X-Objektiv und 10X-Objektiven).
4. Abschluss- Experiment
- Beenden Sie die Pumpen und die Bildaufnahme nach 30 min oder früher, wenn das Signal gesättigt ist. Trennen Sie alle Schläuche und Spritzen und entsorgen Sie sie als biologisch gefährlichen Abfall.
5. Datenanalyse
- Bestimmen Sie Thrombuswachstum (grüne Fluoreszenz) und Fibrinbildung (violett fluorescence) Kinetik mit der Bildanalysesoftware. Die folgenden Befehle sind spezifisch für die Software verwendet, hier:
- Öffnen Sie das Plugin Verarbeitung: Nähen der Aufnähen Side-by-Side - Bilder pro Zeitpunkt.
- Öffnen Sie das Plugin Bildanalyse der Oberflächenabdeckung der Blutplättchen zu bestimmen.
- Öffnen Sie das Plugin messen. Definieren Sie den ROI durch ein Rechteck Region einschließlich aller Thromben und Fibrin Fasern zeichnen; In diesem Protokoll ist der ROI ein Rechteck von 637 mm 2.
Wählen Sie die Registerkarte Alle Ansichten , um alle aufgezeichneten Zeitpunkten. - Verwenden Sie Tabellen erstellen , um automatisch eine Tabelle erstellen, die die mittlere Fluoreszenzintensität Wert des ausgewählten Rechtecks Bereich jeder Zeitpunkt enthalten.
- Speichern Sie die Tabellen im XML-Format.
- Öffnen Sie eine Tabelle in einem Tabellenkalkulationsprogramm für weitere Berechnungen.
- Ziehen Sie den Anfangs (background) Wert aller Daten.
- Plotten das Fluoreszenzsignal als Funktion der Zeit für die Perfusion sowohl der grünen (Thrombozyten) und der violet (Fibrin) Farbstoffe.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie die Zeit zwischen Pumpe Initialisierung und dem eigentlichen Ausgangspunkt der Bildaufnahme. Thrombus - Bildung ist in der Regel ein zweistufiges Verfahren in diesem Modell: (1) "langsam" Blutplättchenadhäsion (dh Adhäsion) an immobilisiertes Kollagen , gefolgt von (2) Koagulation getriebenen Thrombus Wachstum mit einem "schnellen" Zunahme sowohl Thrombozytenbindung ( das heißt, die Akkumulation) und Fibrinablagerung (dh Koagulation) (Abbildung 1). - Berechnen der Steigung der Plättchenadhäsion und Akkumulation durch lineare Regression; Diese Neigung führt zu Blutplättchen-Thrombus Wachstumskinetik in jeder Phase seiner Bildung.
- Berechnen Sie die Steigung von Fibrinkoagulation und extrapolieren diese Linie die X-Achse abzufangen, den Moment des Ausbruchs zu bestimmen.
Representative Results
Die Analyse der Echtzeit - Rohdaten werden in Abbildung 1 beschrieben. Ersten, Blutplättchen an die reaktive Oberfläche anhaften, was zu einem stetigen Anstieg der aufgezeichneten grüne Fluoreszenz (1A, i), die so genannte Adhäsion. In dieser Phase gibt es nur wenig violetten Fluoreszenz, die anzeigt , dass Fibrin nicht oder nur marginal gebildet (1B). Zu Beginn einer Koagulation, violet-fluoreszierender Fibrinablagerungen schnell (iii), und während dieser Zeit, plättchen grüne Fluoreszenz steigt bei etwa der gleichen Geschwindigkeit, hier als Thrombozytenansammlung (ii). Ein einzelnes Experiment liefert somit drei Raten von Fluoreszenzanstieg (i, ii, und iii) als Surrogatmarker für die Geschwindigkeit, mit der Blutplättchen und Fibrinablagerung in diesem Modell nimmt. Ferner wird ein Moment des Gerinnungsbeginn (Moment-of-onset (iv)) hochgerechnet wird, welches eine Determinante der Blutplättchen istProkoagulanz-Potenzial.
In Abwesenheit von TF ist Koagulation Initiations langsam und läuft in erster Linie durch den Kontaktwegs , wo die intrinsische Tenasekomplexes FX durch direkte Aktivierung von FIX 6 durch FXI und / oder FXII aktiviert. Um zu demonstrieren , wurde FXII Abhängigkeit, 4 uM Mais - Trypsin - Inhibitor (CTI) hinzugefügt aktiviert FXII (FXIIa) zu hemmen 7. Diese Hemmung hatte keinen Einfluss auf die Blutplättchen - Adhäsion (2A), aber die Koagulation nicht für die willkürlich definierte Gesamtdauer des Perfusions - Experiment (2B und Ergänzungs Video 1) beginnen.
In vitro kann die Kontaktweges durch Fremdmaterialien wie Glas eingeleitet werden, oder in klinischen Assays , einem mineralischen Material wie Kaolin verwenden. In vivo liefern aktivierte Blutplättchen die negative Ladung 8 </ sup> durch die Membran Exposition von sauren Phospholipiden 9, wie Phosphatidylserin und / oder durch die Freisetzung von Polyphosphaten (polyP) 10, 11. Unsere mikrofluidischen Echtzeit - Assay ahmt die letztere , weil in einem Bereich von Plättchenkonzentrationen, hing die hämostatische Reaktion auf der Thrombozytenzahl (Abbildung 3). Durch die Erhöhung der Anzahl der Blutplättchen in der rekonstituierten Probe, die Rate der Adhäsion (3A), die Akkumulation (3B, grün) und Koagulation (3B, violett) linear erhöht. Der Moment-of-onset deutlich verkürzt (3C) durch die Erhöhung Blutplättchenkonzentration, was darauf hindeutet , dass eine Schwellenzahl von (aktiviert) abgeschiedenen Blutplättchen auslösen Koagulation erforderlich.
Bei der Gewebeschädigung in vivo, werde ich jedoch TF-tragende Zellennitiate die Blutgerinnung über die FVIIa-TF extrinsische Tenasekomplexes in Gegenwart von Ca 2+. Dies ist in unserem Versuchsaufbau von post-Beschichtung der kollagenhaltigen Perfusionskammern mit lipidierter rhTF nachgeahmt. In einem gekoppelten Analyse von Kanälen mit Kollagen beschichtet oder in Kombination mit rhTF war Koagulation Beginn deutlich schneller (4A). Die Rate der Thrombozytenadhäsion war nicht linear, so dass keine lineare Regression durchgeführt werden konnte (Daten nicht gezeigt). Sowohl die Rate der Koagulation und Plättchenakkumulation wurden nicht anders zwischen den Bedingungen (4B-4C, Ergänzender Video 2).
Abbildung 1: Die Regressionsanalyse der Plättchenhaftung und Koagulation in mikrofluidischen Perfusionskammern. Diese Zahl verdeutlicht die Parameter abgeleitet von Echtzeit-Fluoreszenz-Rohdaten während rekalzifiziertem Blutfluss über eine reaktive Oberfläche erworben. (A) Mittlere Intensität der grünen Fluoreszenz zeigt Plättchenablagerung in Funktion der Zeit Perfusion. Die Kurve beschreibt ein bimodales Verfahren mit (i) beginnen , langsam linear Thrombozytenadhäsion durch (ii) schnell wachsenden linearen Akkumulation gefolgt erhöhen. Beide linearen Teile der Kurve zurückgebildet und die Steigung dieser beschreibt die beiden Raten von Thrombusbildung durch Blutplättchen Fluoreszenz; (I) Haftung und (ii) Akkumulation. (B) Die mittlere Intensität der violetten Fluoreszenz zeigt Ablagerung von Fibrin in Funktion der Zeit. Während die Blutplättchen-Adhäsion ist violett Fluoreszenz im wesentlichen fehlt, während es schnell folgende Einleitung der Blutgerinnung entwickelt. Die (iv) Moment-of-onset wird als der Schnittpunkt mit der x-Achse des extrapolierten linearen Regression von (iii) die zweite Phase der Thrombusbildung durch Fibrin Fluoreszenz hier definiert als Koagulation bezeichnet.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: In Abwesenheit von TF, Koagulation in kollagenbeschichteten Perfusion Strömungsräume hängt von FXIIa. Mikrofluidik - Perfusion von Blut rekonstituiert enthält CTI oder Kontrollpuffer (CONTROL) wurde bei einer Scherrate von 1000 s -1 durchgeführt für insgesamt 30 min. (A) Die Rate der Thrombozytenadhäsion (s -1) war auf CTI nicht abhängig. (B) Der Moment-of-onset für CTI-behandelten Proben wurde über die 30 min Grenze des Experiments (als gepunktete Linie gezeigt), die Abhängigkeit von FXIIa dieses Parameters zeigt. Bars und Punkte sind Mittelwerte, Whisker sind Standardabweichung. Die statistische Analyse wurde durch gepaarte t-Test. (NS = nicht signifikant, n ≥3). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Coagulation unter Strömungs hängt von der Thrombozytenzahl. Mikrofluidik - Perfusions - Experimente wurden in kollagenbeschichteten Kammern mit rekonstituierten Blut in Gegenwart von Ca 2+ und variierenden Blutplättchenkonzentrationen (n ≥3) durchgeführt. (A) Rate der Plättchenadhäsion (B) Rate der Plättchenansammlung (grün) und Koagulation (violett) und (C) Moment-of-onset als Funktionen der Blutplättchen - Konzentrationen in Blut rekonstituiert gezeigt. Punkte sind Mittelwerte, Whisker sind Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier einen größeren versi zu sehenauf dieser Figur.
Abbildung 4: Aktivierung beider TF und Kontakt Weg Koagulation deutlich verkürzt den Moment-of-Eintritt der Gerinnung. Rekonstituiert Blut, in Gegenwart von Ca 2+ wurde durch die Kammern perfundiert mit Kollagen beschichtet allein oder mit Kollagen und rhTF des Kontaktwegs alleine oder eine Kombination der Kontakt und TF Wege zu untersuchen. (A) Der Moment-of-Einsetzen der Koagulation wird in TF-enthaltenden Strömungskammern erheblich verkürzt. (B) Die Rate der Anhäufung von Blutplättchen während der Koagulation und (C) die Rate der Koagulation sind nicht signifikant verschieden zwischen Kollagen nur oder Kollagen- und rhTF beschichteten Strömungskammern. Bars und Punkte sind Mittelwerte; Whisker sind Standardabweichungen. Die statistische Analyse wurde durch gepaarte t-Test. (NS = nicht signifikant, * P < 0,05, n ≥3). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzungs Video 1: In Abwesenheit von TF, Koagulation in kollagenbeschichteten Perfusion Strömungsräume hängt von FXIIa. Die Rolle des Kontaktweges wird in kollagenbeschichteten Perfusion Strömungskammern bestimmt. (A) Überlagerte Fluoreszenzbildsequenz von Blutplättchen (grün) und Fibrin (ogen) (violett) Abscheidung in Abwesenheit von CTI. (B) gleiche Sequenz wie Panel A , aber mit dem grünen Kanal ausgeschaltet. (C) Überlagerte Fluoreszenzbildsequenz von Blutplättchen (grün) und Fibrin (ogen) (violett) Abscheidung in Gegenwart von CTI. (D) derselben Sequenz wie Panel C , aber mit dem grünen Kanal ausgeschaltet.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Klicken Sie hier um das Video herunter zu laden.
Ergänzende Video 2: Aktivierung beider TF und der Kontakt Weg verkürzt erheblich die Koagulation Moment-of-onset. Um die Rolle von TF untersuchen, Strömungskammern mit Kollagen beschichtet allein oder mit Kollagen und rhTF wurden verwendet. (A) Überlagerte Fluoreszenzbildsequenz von Blutplättchen (grün) und Fibrin (ogen) (violett) Ablagerung in Strömungskammern beschichtet nur mit Kollagen. (B) gleiche Sequenz wie Panel A , aber mit dem grünen Kanal ausgeschaltet. (C) Überlagerte Fluoreszenzbildsequenz von Blutplättchen (grün) und Fibrin (ogen) (violett) Ablagerung in Strömungskammern sowohl beschichtet mit Kollagen und rhTF. (D) derselben Sequenz wie Panel C , aber mit dem grünen Kanal switched ab. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video herunterzuladen.
Discussion
Die Transfusion von Thrombozytenkonzentraten ist für die Thrombozytopenie Patienten verschrieben, um zu verhindern oder zu stoppen Blutungen. Die klinische Wirkung wurde in einer historischen Überprüfung von akuter Leukämie 12, unter Hinweis darauf , dass eine erhöhte Überlebensraten von pädiatrischen Patienten in den sechziger und siebziger Jahren zu Verbesserungen weitgehend zurückzuführen waren in (Thrombozyten) Transfusionsmedizin kürzlich hervorgehoben. Platelet Konzentrate werden auch zur Eindämmung Blutungen bei akutem Trauma oder während der Operation eingesetzt. Unter diesen Bedingungen Plättchen mit ausgezeichneten Prokoagulanz-Eigenschaften, die schnell Hämostase initiieren werden bevorzugt, aber sind Thrombozytenkonzentrate aus Spenden von freiwilligen Spendern hergestellt und, anders als pharmakologische Medikamente, durch Herstellung nur standardisiert sind, nicht durch (chemische) Zusammensetzung. Daher sind mehrere Fragen im Bereich der Blutbanken unbeantwortet, auch die auf optimale Spende Modalitäten, die Lagerbedingungen und Transfusionspraktiken. Im Bereich der platelet (Transfusions) Biologie, viele Fragen auf Zell-Clearance aus dem Verkehr, der Beitrag der transfused Blutplättchen an der Hämostase, oder ihre Immunologie bleiben auch unbeantwortet.
Zahlreiche Labortechniken für Plättchenfunktionsanalyse zur Verfügung, aber diese meist eine singuläre Aspekt der Thrombozytenfunktion ansprechen, wie Aggregation oder Degranulation 13. Um im Großen und Ganzen bewerten Blutplättchen und Thrombozytenkonzentrate, umfassende Modelle der Hämostase unverzichtbar sind, und diese müssen Hydrodynamik umfassen. Blutrheologie ist entscheidend , um korrekt während 14 Hämostase Thrombozytenverhalten interpretieren, 15 oder 16 Thrombose, auch wenn Antikoagulation Ca 2+ verhindert und / oder Thrombin in Gegenwart von Citrat oder Heparin bzw. 2 zu beteiligen. Zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Koagulation und Plättchenfunktion unter Fluss 17, 18, wird die normale Thrombinbildung erforderlich und daher auch freie Ca 2+. Der Versuchsaufbau Hämostase unter diesen Bedingungen für die Untersuchung ist komplex, weil measures "Artefakt" oder unkontrollierte Aktivierung der Koagulation zu verhindern, sollte so viel wie möglich gemacht werden. Darüber hinaus viele spezialisierte Forschungsgruppen nutzen maßgeschneiderte Hardware 19, 20, die 5 wesentliche Interlabor - Variabilität verursacht. Typische Grenzen dieses Ansatzes sind die Verwendung von rechteckigen Behälter, nichtpulsatilen Strömungsprofile und nicht-menschlichen Oberflächenbeschichtungen 5. Der Test, den wir hier beschreiben, nutzt handelsüblichem Werkzeug und kann daher für die Normung geeignet sein.
Weil die Gerinnungskaskade Reaktion leicht aktiviert wird, sobald Blut nicht innerhalb des menschlichen Körpers enthalten ist, gesteuert Rekalzifizierung ist ein entscheidender Schritt. To erreichen, Zugabe von Ca 2+ verschoben werden muss , um kurz vor der Perfusion über die reaktiven Kollagenoberfläche, weil , wenn das Ca 2+ Puffer in der Masse zu statischer Blut zugeführt wird, nimmt die Koagulation zwangsläufig statt schließlich den Schlauch verstopfen und Daten Vorspannen Interpretation (Daten nicht gezeigt). Die Lösung für dieses Problem ist die Ca 2+ Puffer und das Blut getrennt zu pumpen, so dass für durch Konvektions- und Diffusionskräfte während der Perfusion auf seinem Weg zu der Analysekammer zu mischen. Vollständiges Mischen wird in einem 46-cm-Segment des Schlauchs zwischen den Misch- und Analysekammern erreicht. Diese Länge wurde für die optimale Verweilzeit der Reagenzien berechnet bei der Fließgeschwindigkeit verwendet (1.000 s -1) , basierend auf fundamentalen Gesetze der Masse und konvektiven Transport 21 während der Perfusion zu mischen. Dieser Ansatz erwies sich als kontrollierbar und reproduzierbar.
Kontaktaktivierung der Blutgerinnung wird manchmal als ein Artefakt angesehen einfachenBlutentnahme und vermieden werden, wenn die Gerinnungszeiten zu interpretieren. Daher haben wir gezeigt, dass in der Abwesenheit von Inhibitoren, Kontakt-induzierte Koagulation bei 16,7 min beginnt (± 3,7 min) der Perfusion. In Gegenwart von CTI FXIIa-vermittelten Kontaktaktivierung zu hemmen, wird die Koagulation während der willkürlich definierten Verlauf des Experiments (30 min) eingeleitet. Dieses Fenster des Experimentierens ist ausreichend lang, Proben zu erkennen, die pro- oder antithrombotische sind. Auch wenn die Koagulation durch Kontaktaktivierung eine unerwünschte Folge von Blut in Kontakt künstlichen Oberflächen sein kann, zeigen unsere Daten eine klare biologische Dosis Wirkung der Blutplättchen. Dies kann für Transfusionsmedizin von Bedeutung sein, weil neuere Erkenntnisse auf FXII, Thrombozyten 10 Polyphosphate, Phosphatidylserin Verteilung 22 und Blutplättchen Mikropartikel 23 haben tatsächlich Kontakt Weg Koagulation als wichtigen Beitrag zur Hämostase, e neu bewertetspeziell im Zusammenhang mit Thrombose 24. Zum Beispiel induzieren die variable Ausbeute von Thrombozytentransfusionen bei Patienten oder die variable Phosphatidylserin Expression von überhöhten Blutplättchen somit Variabilität in der therapeutischen Wirksamkeit, wenn erfolgreiche Koagulation von diesen Faktoren gezeigt abhängen.
Durch Co-Immobilisierung lipidierter rhTF mit Kollagen, die extrinsische Gerinnungs Route oder TF Weg wird während der Plättchenablagerung auf Kollagen aktiviert. Dies verlängert die Assay seiner umfassendsten Modus als Modell für Verletzungen, die das Blut in Kontakt mit TF-tragenden Zellen und Gewebe zu bringen. Unsere Daten zeigen, dass die Co-Immobilisierung von Kollagen und TF im Moment des Gerinnungsbeginn verringert, aber die Rate der Koagulation nicht ändert. Bemerkenswert ist die Menge von rhTF an die Oberfläche immobilisiert eine wichtige Variable in diesem Modell 25, 26 und sollte innerhalb einer gegebenen Studie standardisiert werden. Im presence von CTI kann der TF Weg ausschließlich untersucht werden (nicht dargestellt), weil die Kontaktaktivierung verhindert wird.
Abschließend kombiniert unsere Versuchsaufbau ein Modell der Transfusions durch Rekonstitution von Thrombozytopenie Blut mit überhöhten Blutplättchen und ein Modell der Hämostase durch Kalzium-abhängige Blutplättchenablagerung und Fibrinbildung unter hydrodynamischen Fluss. Dieser Test wird verwendet, um Fragen über die Prokoagulanz-Natur von überhöhten Blutplättchen zu beantworten und die Auswirkungen Thrombozytenkonzentrat Präparationstechniken haben zu diesem Thema.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Stiftung für Forschung und Entwicklung des Belgischen Roten Kreuz Sektion Flandern Blood Service unterstützt. Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - Sonderforschungsfonds) von der Universität Gent mit Vertragsnummer BOF30290744 dem Projekt gewährt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
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