Summary
Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.
Abstract
hemostaz mikroakışkan modelleri hidrodinamik kesme koşulları altında trombosit fonksiyonu değerlendirmek ancak antikoagülan mevcudiyetinde, bu analiz, trombosit birikimi sadece sınırlıdır. Ca 2 + bağımlı koagülasyon ve trombosit fonksiyonu arasındaki karmaşık ilişki analizden önce kan dikkatli ve kontrollü n yeniden gerektirir. Bizim kurulum Örnek staz olmaksızın hızlı n yeniden etkinleştirme hemen önce perfüzyon kan akışı konsantre Ca 2 + / Mg2 + tampon malzemeleri, Y-şeklinde karıştırma kanalı kullanır. Her iki rezervuar arasındaki akış hızında bir on kat bir fark seyreltme en aza indirir. recalcified kan daha sonra kollajen kaplı analiz odasına perfüze edilir ve ayırıcı markalama flüoresans görüntü mikroskopi kullanılarak hem trombosit ve fibrin depolanmasının gerçek zamanlı görüntüleme izin verir. Sistem standardizasyon şansı artan, sadece piyasada mevcut araçları kullanır. bir uçtan bir uca bir SulandırmaÖbekli gelen trombositler ile mbocytopenic kan bu araştırma alanında kullanımını kanıtlayan, modeller ayrıca trombosit transfüzyonu yoğunlaşmaktadır. Örnek veri pıhtılaşma başlangıcı ve fibrin birikimi bizim modelinde primer ve sekonder hemostaz arasındaki ilişkiyi doğrulayan, trombosit konsantrasyonu doğrusal bağımlı olduğunu göstermiştir. 16 perfüzyon dakikalık bir zaman dilimi içinde, iletişim aktivasyonu, normal Ca 2+ ve Mg 2+ seviyelere n yeniden rağmen, yer almadı. pıhtılaşma faktörü XIIa mısır tripsin inhibitörü ile inhibe edilmiştir, bu zaman çerçevesi trombositlerin prokoagülan gelen değişiklikler tespit edilebilir olan önemli bir dinamik aralık ile daha uzun idi. kollajen doku faktörünün Eş-immobilizasyon önemli ölçüde hızını koagülasyon başlama zamanı azalır, ancak. doku faktörü ve / veya kontak yolu incelemek için seçenek testinin çok yönlülük ve yarar artırır.
Introduction
Primer ve sekonder hemostaz aslında iki nispeten ayrılabilir biyokimyasal süreçler olarak kavramsallaştırma edildi. İkincil hemostaz proteaz kaskad çözünmeyen fibrin oluşturmak için izin, venöz kan akışı altında pıhtılaşmasını hakim görüldü ise birincil hemostaz, trombositlerin için önemli bir role sahip, arter akım koşullarında önemli bir katkı olarak görülüyordu. Son birkaç on yıl bu trombosit aktivasyonu ve koagülasyon birbirine bağımlı ve tüm (aşırı olmayan) hidrodinamik çevrelerde fizyolojik ve patolojik hemostaz sırasında eşit derecede önemli süreçlerdir kabul, esasen bu geleneksel görünümünü yeniden şekillendirmiştir. Bu görüş kapsamlı tam kan pıhtılaşmasını ölçmek için tasarlanmış tahliller giderek alaka, uygulanabilirliği ve yarar 1 birçok kalan sorular olsa kullanılmakta olan kliniğe, tercüme edilmiştir.
Biz son zamanlarda trombosit fonksiyonel bir analiz yayınladıKırmızı kan hücreleri, plazma ve trombosit normal miktarlarını ihtiva eden numuneler ile transfüzyon 2 bir in vitro modelinde fibriler kolajen ile kaplanmış mikro-akışkan akış odası kullanılarak yoğunlaşmaktadır. Bu yöntem, heparin ya da hirudin veya hiç trombin üretimi ve iyonize kalsiyum (Ca 2+) bağlıdır sekonder hemostaz, sınırlı katılımı ima, kan antikoagüle kullanır. Mikroakışkan akış altında hemostaz tüm yönleriyle dahil böylece trombin oluşumunu desteklemek ve için, biz şimdi Ca 2 + da dahil olmak üzere, aynı teknik platform üzerinde tamamlayıcı bir yöntem geliştirdi. Bu şekilde, trombosit birikimi ve fibrin oluşumu trombosit konsantresi kalitesini değerlendirmek için, tekrar trombosit transfüzyon modelinde, ele alınabilir.
Bu yöntemde, trombositler ve fibrinojen tam emisyon spektrumları ayrılmış olduğu florofor ile etiketlenir. Çift renkli, gerçek zamanlı video mikroskobu sonra analiz edilmesini sağlarBirincil platelet yapışma, hem de koagülasyon başlatma ve fibrin oluşumu. Statik kana Ca 2 eklenmesi, perfüzyon önce, kaçınılmaz olarak bir kap içinde temas başlatılan pıhtılaşma neden olur, çünkü Bu tür testlerde önemli bir değişken, n yeniden olup. Bu inisiyasyon nedeniyle önce perfüzyon tüp ve biochip girişlerinin tıkanması için önyargı okuma olacak. Bu nedenle, yöntem, sitrat kan pıhtılaşması önlenmiş ve Ca + 2 içeren tampon, Y-şeklinde, giriş bölmesinin üst bacak boyunca ayrı pompalanır. bileşenleri kollajen tek başına ya da rekombinan insan dokusu faktörü (rhTF) ile kombinasyon halinde ile kaplı bir analiz odasına girmeden önce perfüzyon sırasında karıştırılır. Tampon içinde, ayrı pompalarının akış hızları ve Ca2 + konsantrasyonu uyarlayarak, son kan numunesinin% 10 seyrelti gerçekleşir.
Bu genişletilmiş protokolü kullanarak, Coagula katkısını göstermektediryon faktörü XII (FXII) ve trombosit konsantrasyonu akış altında yolu koagülasyon başlangıcını başvurun. Verilerimiz kolajen birlikte rhTF kaplayarak, doku faktörü yolu eşzamanlı olarak ölçülebilir olduğunu göstermektedir.
Protocol
Bu protokol, insan numuneler üzerinde araştırmalar için kurumsal etik kuralları takip ve bilgilendirilmiş onam ilgili tüm vericilerden elde edildi. Burada tarif edilen deneyler için onay Antwerp Üniversitesi Hastanesi (Onay numarası 16/10/120) kurumsal inceleme kurulu elde edilmiştir.
NOT: belirtilmediği sürece Sıcaklık göstergeleri, her zaman oda sıcaklığı vardır.
1. Mikroakiskan Kur
- Mikroakışkan akış odası kanalları, boru ve bağlantı işaretçilerine hazırlayın
- vorteks karıştırması kolajen hazır şişe tekrar süspansiyon ve daha sonra 50 ug / ml bir son konsantrasyona kadar üretici tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde seyreltin.
NOT: at tendon kollajen, özellikle tip I fibriller oluşur. at kollajen tip I sık sık "Horm" kolajen olarak adlandırılır ve tarihsel ve hem de, testin bu tip altın standarttır edilirBiyolojik nedenler. İnsan tip III kollajen da kullanılabilir, ancak bu fibriller kat daha az, ve trombosit cevabı kadar güçlü değildir. Diğer kaplama yüzeyleri de von Willebrand faktörü, fibrinojen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1, ya da bunların 3 kombinasyonları gibi, kullanılabilir. - bir ucunda Biochip kanal (lar) içine 0,4 W 0,1 x H kollajen x 20 L. Pipet 0.8 uL, mm cinsinden, sekiz düz, paralel kanalları ve boyutları ile yeni, tek kullanımlık mikroakışkan Bioçip alın ve bu etiket çıkış. kolajen fibrilleri kanal girişinde kaplı değildir ki bu verimli perfüzyon engeller, hangi tıkanmaya neden olabilir, çünkü, sadece 5/6 kanal uzunluğu doldurun.
- nemlendirilmiş ve kapatılmış bir kap içinde en az 4 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin Bioçip.
- Colla ile temas yolunda birlikte doku faktörü (dışsal) aracılı pıhtılaşmayı incelemek için (içsel), ceket kanallarıGen ve rekombinant insan doku faktörü (rhTF).
- 10 mM 4- (2-hidroksietil) 'de rhTF seyreltilir -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tuz -buffered (HBA,% 0.9 (a / h) NaCI, pH 7.4, 1 w 3000, stok konsantrasyonu: 4.5 nM).
- çıkış aracılığıyla kolajen Kaplama çözeltisini çıkarın. HBS rhTF pipetleyin 0.8 uL (stok konsantrasyonu, nihai konsantrasyon seyreltme 1/500: 09:00) kolajen kaplama stratejisine benzer bir kanal uzunluğu, 5/6 dolum kanalının prize.
- nemlendirilmiş ve kapatılmış bir kap içinde, bir 30 dakika daha Bioçip inkübe edin.
- Blokaj tamponu ile kaplanmış kanal doldurun ((w /% 1.0 v) inek serumu albümini ve% 0.1 (HBS'de / hac) glikoz W), (giriş olarak işaretlenmiş), diğer ucundan başlayarak. Karıştırma Biochip aynı blokaj tamponu ile Y-şekilli kanalların eşit sayıda doldurun.
- Tüm kanallar ve kanal kolları emin tamamen bloklama tamponu ile doldurulur olun. Her iki Bioçip inkübenemlendirilmiş ve kapatılmış bir kap içinde en az 1 saat boyunca s.
- Kullanılan her kanal için, bir 2 cm uzunluğunda uzunluğunda 8 cm, ve uzun bir 46 cm'lik iki tüp hazırlar. üç küçük hortumun bir ucunda ve en uzun boru iki ucunda bir pim yerleştirin.
- vorteks karıştırması kolajen hazır şişe tekrar süspansiyon ve daha sonra 50 ug / ml bir son konsantrasyona kadar üretici tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde seyreltin.
- Durulama pompası hazırlayın
- tüm pompa Fluidics ve distile su ile bağlı tüp durulayın.
- baskılar ve toz kaldırmak için tozsuz silme hassas ve denatüre alkol ile biochip en döküm yağdan arındırın.
- bioçipler onları bağlamadan önce bloklama tamponu ile tüm boru doldurun.
- Otomatik mikroskop sahnede kaplı Bioçip sabitleyin. Bir laboratuvar makas jack kullanarak mikroskop sahne ile aynı yükseklikte karıştırma Bioçip sabitleyin.
- 46 cm uzunluğunda en uzun boru kullanılarak karıştırma Biochip ile kaplanmış Bioçip bağlayın. boru esnek fakat düz bir çizgi oluşturacak şekilde her iki Biochipler bir mesafede olduğundan emin olun. durulama pompası Luer-uyumlu boru içine bir şırınga konektör pimini takın. 2 cm tüpünün serbest ucuna bağlayın ve kaplamalı Biochip çıkışına diğer ucunu düzeltmek.
- onun işaretçilerine kullanarak karıştırma biyoçip girişine iki 8 cm'lik boru sabitleyin. HBS bir şişe içinde, her boru serbest son ver. tüm boru ve 1 mL HBS ile tüm kanalları durulayın.
NOT: HBS nedeniyle durulama pompası çekme kuvvetine karıştırma çip 8 cm'lik boru yoluyla ve (kaplanmış kısmına kaplanmamış akan) kaplı yonga 46 cm tüp aracılığıyla flakon akar. Bu adım (çift kaplı bioçipler veya rhTF) engelleme tampon ve kötü yapıştırılır kollajeni kaldırır.
- Perfüzyon pompaları hazırlayın
- perfüzyon pompaları sürücü yazılımını açın. yazılımda şırıngalar simgesine çift tıklayarak pompaları başlatılamıyor.
- 1 ml şırınga koagülasyon b: kullanılacaktır şırınga türünü seçinUffer ve yeniden kan 2 ml şırınga.
- Biochipin inşaat şırınga bağlayın
- İki bioçipler bağlayan biri hariç durulama pompası ve tüm boru, ayırın. kesilmiş boru aşağıdaki adımlarda tekrar kullanılır.
- kalın duvarlı atık boru Luer kilit onun şırınga konektör pimi ile 2 cm boru bağlayın. bir şırınga kullanarak standart pepsin çözeltisi ile kalın duvarlı boru doldurun.
NOT: ve atık boru engellediği için pepsin eklenmesi sonrası perfüzyon pıhtılaşma lyses ve bu nedenle geri sonunda sistemin tıkanmasını önler. - Bir Kocher kelepçe ile kalın duvarlı boru açık ucunu sabitleyin. flow-through toplamak için ağartma ve alt kısımda uygun bir atık kabını yerleştirin.
- kaplanmış Biochip çıkışına onun iğne ile tüp sabitleyin.
Kan Örneklerinin 2. Hazırlık
- Sağlıklı bir gönüllüden kan toplayın ve bileşenlerini ayırmak 4
- boşaltılmış bir etilendiamin-tetraasetik asit (EDTA), bir kap içinde kan toplamak. Sadece otomatik hematoloji analizörü kullanılarak tam kan sayımı (CBC) gerçekleştirmek için bu örneği kullanmak.
- tahliye sodyum sitrat kaplarda kan toplayın. 5 mL kan kanal başına gereklidir.
- yatay rotator bekleyen kan sulandırma üzerine örneği (ler) yerleştirin.
NOT: Tahlil Flebotomi 3 saat içinde tamamlanmalıdır. Trombosit konsantresi ve tam kan numuneleri ABO / RhD kan grubu uyumlu bulunmaktadır. - 250 x g'de 13 dakika boyunca santrifüj trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlanır. gevşekçe paketlenmiş pelet olumsuz yönde etkilenmemesi için santrifüj fren kullanmayın.
- Taze konik santrifüj tüpüne PRP aktarın. trombositleri peletleştirmek ve trombosit bakımından fakir plazma hazırlamak için (fren) 4500 x g'de 10 dakika boyunca (PPP) santrifüj. plat atınelet pelet. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde PPP inkübe edin.
- 21 G iğne ile özgün bir alt delinerek taze konik tüp paketlenmiş kırmızı kan hücreleri aktarın.
NOT: paketlenmiş kırmızı hücre fraksiyonu kalan trombosit sayısı mcL başına 11 ± 4 x 10 3 (ortalama ± SD, n = 10) 'dir.
- kan sulandırın
- otomatik hematoloji analizörü kullanılarak adım 2.1.6 hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokrit belirleyin.
- otomatik bir hematoloji analiz cihazı kullanılarak analiz için kullanılacaktır trombosit konsantresi trombosit konsantrasyonunun belirlenmesi.
- 2.5 mL nihai hacim içinde% 40 hematokrit ve 250 x 10 3 trombosit / ml elde edecek eritrosit, trombosit konsantresi ve PPP hacmini hesaplar. sulandırılmış kan hazırlamak ve CBC gerçekleştirmek için bu karıştırın.
Not: hücre bir diğer hedef titerleri th bağlı olarak kullanılabilire araştırma sorusu. - Trombosit konsantresinin miktarı ", endojen" trombosit (yani, dışı kan bankası trombosit) konsantrasyonunu belirlemek için serum fizyolojik, aynı hacimde ile ikame edildiği bir "boş" kontrol numunesi hazırlanır.
- Trombositler ve fibrinojen için yeniden kan Etiket
- Pipet 13 Bir test tüpü içinde Alexa Fluor 405-etiketli fibrinojen (70 mg / ml son konsantrasyon) bir 10.7 mg / ml çözeltisi uL yeniden oluşturulmuş 1 ml kan ilave edin.
NOT: Fibrinojen üreticinin kılavuzuna göre piyasada bulunan bir kit kullanılarak etiketli oldu. - 1 mM DiOC 6 (1 uM son konsantrasyon), 2 ul ihtiva eden ya da 5 mM Calcein AM (5 uM son konsantrasyon), 2 ul ihtiva eden bir deney tüpü içinde yeniden kan bir başka 1 mL karıştırın. fibrinojen-s platelet- 2 mL bir son hacim verir fibrinojen ile kan içeren tüp ilave edilerektained kan.
NOT: boya seçimi araştırma sorusu veya araştırmacı 5 tercihine bağlı olabilir. Herhangi bir boya uyarma fotokimyasal eserler neden olabilir unutmayın. - Yavaşça tersine çevirerek karıştırın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca örnek inkübe edin.
- Pipet 13 Bir test tüpü içinde Alexa Fluor 405-etiketli fibrinojen (70 mg / ml son konsantrasyon) bir 10.7 mg / ml çözeltisi uL yeniden oluşturulmuş 1 ml kan ilave edin.
- Pıhtılaşma tampon hazırlayın
- 10 mM CaCl2 ve HBS 3.75 mM MgCl2 içeren koagülasyon tampon hazırlayın. Bir kanal için pıhtılaşma 1 ml tampon hazırlayın.
- -Filtre sterilize 0.2 mikron filtre ile koagülasyon tampon. 37 ° C, bu ön-ısıtmak.
3. Perfüzyon Testi
- Kanalın alt yapıştırılır kollajen lifleri mikroskop optik odaklanın. faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanın. dijital seçilen odak düzeltmek için deneme yazılımı "seçilen çini bölgeler için Set mevcut Z" seçeneğini seçin.
- Mikroskop tedarik yazılımı kullanılarak seçilen kanalda faiz (ROI) bir bölge tanımlayın.
NOT: ROI keyfi bir perfüzyon kanal içinde seçilen herhangi bir yüzey alanı olabilir. Dengesiz dağıtılmış trombüs görüntülerini elde önlemek için trombüs oluşumunu ve giriş ve çıkışına yakın fibrin oluşumunu analiz etmek değil tavsiye edilir. YG yüzey alanı, bireysel trombositler sinyal değişkenlik dışında tesviye için izin vermek için trombüs önemli sayıda içermelidir. Kanalın xy-düzleminde ROI yeri her zaman sabit ve perfüzyon önce belirlenir. Gerekirse, kanalın kaplanmamış kısmı trombosit biyoçip plastik spesifik olmayan bağlanma olmadığını belirlemek için analize dahil edilebilir. - perfüzyon örnekleri hazırlamak
- perfüzyon pompası önceden ısıtılmış pıhtılaşma 1 ml tampon içeren 1 ml'lik bir şırınga monte edin.
- yavaşça tersine çevrilmesi ve yük 2 m tarafından önceden ısıtılmış yeniden kan Mix2 ml şırınga içinde L.
- Tüm hava hem şırınga kaldırılır ve bir şırınga konektör pimi kullanılarak 8 cm boru Her bağlamak olduğundan emin olun.
- Başbakan konnektörleri ve yüksek hızda (400 mL / dak) her iki şırıngalar tüp ve her şeyi koagülasyon tampon ya da kan ile dolu olduğunda durur.
Not: deney başlamadan perfüzyon odalarına hava giriş kaçınarak boru priming, koagülasyon tampon yeniden Kan, hemen karıştırma Biochip Y biçimli kanal karıştırılacaklardır.
- işaretçilerini kullanılarak, karıştırma Biochip Y-şeklinde bir kanal bölme bacak, her iki boru diğer ucunu sabitlemek. Alt bacak koagülasyon tampon ve yeniden kan üst bacak perfüze kullanılır.
- koagülasyon tampon 4.4 mL / dk ve yeniden kan 44 uL / dk'da perfüzyon başlatarak deneyi başlatın. izin vermek için atık boru çıkışında perfu de Kocher kelepçesini sökünsion.
NOT: Debi araştırma sorusu bağlı olarak değiştirilebilir. deneyin başlangıcından ve gerçek zamanlı görüntü elde başlaması arasındaki süre belirlemek için bir kronometre başlatılır. - Tutanak görüntüleri her 10 s mikroskop satın alma ve deney yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak 30 dakika boyunca. sulandırılmış kan ve pıhtılaşma tampon karışımı mikroskop sahnede monte kaplı Bioçip girdiğinde kayda başlamak.
NOT: Diğer zaman serisi deney düzeneği bağlı kullanılabilir. 100X büyütme (10X objektif ve 10X lens) kullanın.
4. Sonlandırma Deney
- Sinyal doymuş ise, daha önce 30 dakika sonra pompa ve görüntü elde etme feshedebilir veya. tüm boru ve şırınga ayırın ve biyolojik tehlikeli atık olarak atın.
5. Veri Analizi
- Trombüs büyümesini (yeşil floresan) ve fibrin oluşumunu belirlemek (menekşe fluorescence) görüntü analizi yazılımıyla kinetiği. Aşağıdaki komutlar burada kullanılan yazılım için özeldir:
- Eklenti İşleme açın: zaman noktası başına yan yana görüntüleri dikiş dikiş.
- Trombositlerin yüzey kapsama belirlemek için eklenti Görüntü Analizi açın.
- Eklenti ölçün açın. Tüm trombüs ve fibrin lifleri içeren bir dikdörtgen bölgesini çizerek ROI tanımlayın; Bu protokolde, YG 637 mm 2 ölçülerinde bir dikdörtgendir.
Kaydedilen tüm zaman noktalarını içerecek şekilde sekmesi Tüm Görüntüleme seçin. - Otomatik olarak her zaman noktasında seçilmiş dikdörtgen bölgenin ortalama floresan yoğunluğu değerini içerecek bir elektronik tablo oluşturmak için Tablolar oluşturma kullanın.
- xml formatında elektronik tabloları kaydedin.
- Sonraki hesaplamalar için bir elektronik tablo programı bir tabloyu açın.
- İlk (backgrou çıkarmatüm verilerin nd) değer.
- Green (trombosit) ve mor (fibrin) boyalar hem perfüzyon zamanın bir fonksiyonu olarak flüoresan sinyal çizilir.
NOT: hesaba pompa başlatma ve görüntü alımı gerçek başlangıç noktası arasındaki zaman ayırın. Trombüs oluşumu genellikle bu modelde iki adımlı bir işlemdir: (1) (yani, yapışma) bağlayıcı hem trombosit bir "hızlı" artışla (2) pıhtılaşma odaklı trombüs büyüme izledi hareketsiz kollajen (trombosit yapışması "yavaş" yani birikmesi) ve fibrin birikimi (örneğin, pıhtılaştırma) (Şekil 1). - trombosit yapışması ve lineer regresyon ile birikim eğimi hesaplamak; Bu eğim oluşumu her aşamasında trombosit trombus büyüme kinetikleri verir.
- başlangıç anı belirleyen, fibrin koagülasyon eğimi hesaplamak ve X ekseni kesmek için bu satırı tahmin.
Representative Results
Gerçek zamanlı, ham verilerin analizi, Şekil 1 'de tarif edilmektedir. İlk olarak, trombositler kaydedilen yeşil floresan istikrarlı bir artış (Şekil 1A, i) sonuçlanan reaktif yüzeye yapışma, yapışma çağırdı. Bu aşamada, bir fibrin değildir ya da çok az (Şekil 1B) oluşturulmuş olduğunu gösteren küçük mor floresan vardır. Pıhtılaşmasının başlangıç üzerine, mor-fluoresan hızlı fibrin tortularının, (iii), ve bu süre içinde, trombosit birikimi burada belirlenen yaklaşık aynı oranda trombosit yeşil floresan artar, (ii). Tek bir deney bu şekilde floresan artış üç oran verir (I, II ve III), trombosit ve fibrin birikimi, bu modelde, meydana geldiği hızı için bir vekil markeri olarak. Ayrıca, pıhtılaşma başlangıcı (an-of-başlangıçlı (iv)) bir an trombosit bir belirleyicisi olan ekstrapole edilirprokoagülan potansiyeli.
TF yokluğunda, pıhtılaşma başlatma yavaş ve öncelikle içsel tenase kompleksi FXI ve / veya FXII ile FIX 6 doğrudan aktivasyonu yoluyla FX aktive iletişim yolu aracılığıyla çalışır. FXII bağımlılığı göstermek için, mısır tripsin inhibitörü 4 uM (CTI) aktive FXII inhibe etmek için ilave edildi (FXIIa) 7. Bu engelleme trombosit yapışması (Şekil 2A) etkilemedi, ancak pıhtılaşma perfüzyon deney (Şekil 2B ve Ek Video 1) keyfi tanımlanmış toplam süresi başlamadı.
İn vitro olarak, iletişim yolu kaolin gibi bir mineral madde kullanılarak cam gibi bir ya da klinik deneyler içerisinde yabancı maddeler tarafından başlatılabilir. In vivo aktive trombositler negatif yük 8 sağlamak </ sup> ve / veya polifosfatlar salınımı (polip) 10, 11 ile asidik fosfolipitler 9, fosfatidilserin gibi, membran maruz kalma yoluyla. Bizim mikroakışkan gerçek zamanlı deney taklit eden bu için, trombosit bir konsantrasyon aralığı içinde, hemostatik Reaksiyon trombosit sayısı (Şekil 3) bağlıdır. Yeniden numunedeki platelet sayısı artırılarak, yapışma oranı (Şekil 3A), birikim (yeşil Şekil 3B) ve koagülasyon (Şekil 3B, mor) doğrusal bir artış göstermiştir. An-of-başlangıçlı anlamlı (aktif) yatırılan trombositlerin bir eşik sayısı pıhtılaşma tetiklemek için gerekli olduğunu düşündüren, artan trombosit konsantrasyonu (Şekil 3C) kısaltılmış.
In vivo doku hasarı üzerine, ancak, TF-taşıyan hücrelerin yapacağımCa 2 varlığında FVIIa-TF dışsal tenase kompleksinin yoluyla kan pıhtılaşmasını nitiate. Bu bizim deney düzeneği de taklit post-kaplama lipidlenmiş rhTF ile kolajen içeren perfüzyon odaları. Kolajen veya sadece rhTF ile kombinasyon halinde ile kaplanmış bir kanallar eşleştirilmiş analizinde pıhtılaşma belirgin şekilde daha hızlıydı (Şekil 4A) idi. platelet yapışmasının oranı, doğrusal olmayan, yani lineer regresyon (veriler gösterilmemiştir) gerçekleştirilebilir. Hem koagülasyon ve trombosit birikim oranı koşullarında (Şekil 4B-4C, Yardımcı Video 2) arasında farklı değildi.
Şekil 1: mikroakışkan perfüzyon odaları trombosit yapışması ve pıhtılaşma regresyon analizi. Bu rakam gerçek zamanlı floresan ham verilerden elde edilen parametreleri açıklar reaktif bir yüzey üzerinde recalcified kan akışı sırasında elde edilen. Yeşil floresan (A) ortalama yoğunluğu perfüzyon, zamanın bir fonksiyonu olarak trombosit birikimini gösterir. Eğrisi yavaş (ii) hızla büyüyen lineer birikimi, ardından, doğrusal platelet yapışmasını artırmak (i) ile başlayan iki modlu bir işlemi tarif etmektedir. eğrinin her iki lineer kısımları geriledi ve bu eğimi trombosit floresan trombüs oluşumu iki oranları açıklanır vardır; (I) yapışma ve (ii) birikmesi. (B) mor floresan yoğunluğu, zamanın bir fonksiyonu olarak fibrin birikmesini gösterir ortalama. hızla koagülasyon aşağıdaki başlatılmasını geliştirir iken trombosit yapışması sırasında, menekşe floresan, esasen yoktur. (IV) 'an-of-başlangıçlı koagülasyon burada belirlenen fibrin floresan trombus oluşumu, (iii), ikinci fazın ekstrapole doğrusal regresyon X ekseni yolunu kesmek olarak tanımlanır.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: TF yokluğunda, kollajen kaplı perfüzyon akış gözlerinden koagülasyon FXIIa bağlıdır. CTI veya kontrol tamponu (kontrol) içeren bir sulandırılmış kan mikroakışkan perfüzyon 1000 s kesme hızında -1, 30 dakikalık bir toplam gerçekleştirildi. (A), platelet yapışmasının hızı (s-1) CTI bağımlı değildi. (B) an-of-başlangıçlı CTI muamele edilmiş örnekler için bu parametrenin FXIIa bağımlılığını gösteren, (noktalı çizgi ile gösterilmiştir), deneyin 30 dakika sınırının ötesinde oldu. Barlar ve noktalar bıyıkları standart sapma, ortalama değerlerdir. İstatistiksel analiz eşleştirilmiş t-testi ile yapıldı. (NS = anlamlı değil, n ≥3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: akışı altında Pıhtılaşma trombosit sayısına bağlıdır. Mikroakışkan perfüzyon deneyleri Ca 2 + varlığında içinde yeniden kan ve çeşitli trombosit konsantrasyonları (n ≥3) ile kollajen kaplı odalarında gerçekleştirildi. (A) Hız trombosit birikimi (yeşil) ve koagülasyon (mor) ve (C) an-of-başlangıçlı platelet yapışma (B) oranının yeniden kandaki trombosit konsantrasyonlarının fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Noktalar bıyıkları standart sapmaları vardır, ortalama değerlerdir. Daha büyük bir Versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.
Şekil 4: Her iki TF ve temas yolu koagülasyon aktivasyonu önemli ölçüde anı-of-başlangıçlı koagülasyon kısaltır. Ca + 2 varlığında, kan yeniden oluşturulmuş, kollajen, tek başına ya da tek başına iletişim yolu veya temas TF yollarının bir arada çalışma kollajen ve rhTF ile kaplanmış oda arasındaki perfüze edildi. (A) an-of-başlangıçlı koagülasyon anlamlı TF içeren akış odalarında kısaltılır. (B) koagülasyon oranı sadece veya kollajen ve rhTF kaplı akış odaları kollajen arasında anlamlı farklılık olmadığı koagülasyon ve (C) sırasında trombositlerin birikim oranı. Barlar ve noktalar ortalama değerlerdir; bıyıkları standart sapmaları vardır. İstatistiksel analiz eşleştirilmiş t-testi ile yapıldı. (NS * p <, anlamlı = 0.05, N ≥3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yardımcı video 1: TF yokluğunda, kollajen kaplı perfüzyon akış gözlerinden koagülasyon FXIIa bağlıdır. İletişim yolunun rol kollajen kaplı perfüzyon akış gözlerinden belirlenir. CTI yokluğunda trombosit (yeşil) ve fibrin (ojen) (mor) yerleştirme (A) Kaplanmış floresan görüntü dizisi. (B) Panel A olarak ancak yeşil kanal ile aynı dizi kapalı. Trombosit (yeşil) ve fibrin (ojen) CTI mevcudiyetinde (mor) birikimi (C) Kaplanmış floresan görüntü dizisi. (D) Panel C ancak yeşil kanal ile aynı dizi kapalı.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Bu videoyu indirmek için tıklayınız.
Ek Video 2: Her iki TF aktivasyonu ve temas yolu önemli ölçüde pıhtılaşma an-of-başlangıçlı kısaltır. TF rolünü araştırmak için, kollajen tek başına veya kollajen ve rhTF ile kaplanmış akış odaları kullanıldı. Trombosit (yeşil) ve fibrin (ojen) Sadece kolajen ile kaplanmış akış gözünde (mor) birikimi (A) Kaplanmış floresan görüntü dizisi. (B) Panel A olarak ancak yeşil kanal ile aynı dizi kapalı. Trombosit (yeşil) ve fibrin (ojen) kollajen ve rhTF ile kaplanmış bir akım odalarında (mor) birikimi (C) Kaplanmış floresan görüntü dizisi. (D) Panel C ancak yeşil kanal SWITC ile aynı dizikapalı hed. Bu videoyu indirmek için tıklayınız.
Discussion
Trombosit transfüzyonu önlemek veya kanamayı durdurmak için trombositopenik hasta için reçete konsantreleri. Onun klinik etkisi yakın zamanda altmışlı ve yetmişli yıllarda pediatrik hastalarda artmış sağkalım oranları (trombosit) transfüzyonu tıp gelişmeler büyük ölçüde atfedilebilecek olduğunu hatırlatarak, akut lösemi 12 tarihi bir inceleme vurgulandı. Trombosit konsantreleri akut travma veya ameliyat sırasında kanama kök kullanılır. Bu koşullarda, hızla hemostaz başlatmak mükemmel prokoagülan özelliklere sahip trombositler tercih edilir, ancak trombosit konsantreleri farmakolojik ilaç aksine, değil, yalnızca (kimyasal) kompozisyonu ile hazırlık tarafından standardize edilir, gönüllü donörlerin bağışlardan hazırlanır ve. Bu nedenle, kan bankacılığı alanında birçok soru optimum bağış modaliteleri, saklama koşulları ve transfüzyon uygulamaları konusunda da dahil olmak üzere, cevapsız bulunmaktadır. pl alanındaatelet (transfüzyon) biyoloji, dolaşımdan hücre temizlenmesi ile ilgili birçok soru, hemostaz transfüzyonu trombositlerin katkısı, ya da immünoloji da cevapsız kalmaktadır.
Trombosit fonksiyon analizi için çok sayıda laboratuar teknikleri mevcuttur, ancak bunlar çoğunlukla toplama veya degranülasyon 13 gibi, trombosit fonksiyonunun tekil yönünü ele almaktadır. geniş trombosit ve trombosit konsantreleri değerlendirmek için, hemostaz kapsamlı modelleri vazgeçilmez ve bu hidrodinamik içermelidir. Kan reoloji antikoagülan Ca önler + 2 ve / veya trombin sitrat veya heparin sırasıyla 2 varlığında katılma bile, doğru hemostaz 14, 15 ya da tromboz 16 trombosit davranışı yorumlamak için çok önemlidir. Akış 17 altında koagülasyon ve trombosit fonksiyonu arasındaki etkileşimi incelemek için, 18, normal bir trombin üretimi serbest Ca hem de 2+, dolayısıyla gerekli olup. tedbirler "objeyi" ya da pıhtılaşmanın kontrol dışı aktivasyonu mümkün olduğunca alınmalıdır bilmek için, bu koşullar altında hemostaz çalışmak için deney düzeneği karmaşıktır. Ayrıca, birçok uzman araştırma grupları kullanmak ısmarlama donanım 19, 20, önemli laboratuvarlar arası değişkenliği neden 5. Bu yaklaşımın tipik sınırlamalar dikdörtgen kaplar, non-pulsatil akım profilleri, ve insan olmayan yüzey kaplamaları 5 kullanımı vardır. Biz burada açıklamak tahlil piyasada mevcut araçları kullanır ve bu nedenle standardizasyon için uygun olabilir.
Kan insan vücudu içinde yer almayan bir kez koagülasyon kaskadı Reaksiyon kolayca aktive olduğu için, kontrol edilen n yeniden çok önemli bir adımdır. To Bu elde ertelenmesi gereken Ca2 + eklenmesi sadece reaktif kolajen yüzeyine perfüzyon önce, Ca 2 + tamponu sabit kan toplu olarak sağlandığında olduğu için, pıhtılaştırma kaçınılmaz sonunda boru tıkanma ve veri ağırlık verme yer alır, yorumlanması (veriler gösterilmemiştir). Bu sorunun çözümü analiz odasına yolunda perfüzyon sırasında konvektif ve pasif güçleri tarafından karıştırma için izin ayrı ayrı Ca 2 + tampon ve kan pompalamak olduğunu. Tam Karıştırma ve analiz bölmeler arasında bir boru 46 cm segmenti elde edilir. Bu uzunluk reaktif optimal bekleme süresi hesaplandı kullanılan akış hızında perfüzyon sırasında kütle ve konvektif taşıma 21 temel yasaları (1000 s -1) dayalı mix için. Bu yaklaşım, kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir olduğunu kanıtladı.
koagülasyon İletişim aktivasyonu bazen basit bir eser olarak görülüyorpıhtılaşma kez yorumlanırken, kan örnekleme ve kaçınılması gereken. Bu nedenle, inhibitör yokluğunda, temas kaynaklı koagülasyon perfüzyon 16.7 dakika (± 3.7 dakika) ile başlar, bu gösterdi. FXIIa aracılı iletişim aktivasyonunu inhibe CTI varlığında, pıhtılaşma deneyi (30 dakika) olarak tanımlanmış sırasında başlatılır. deney bu pencere pro- ya da anti-trombotik olan örnekleri ayırt etmek yeterli uzunluktadır. iletişim aktivasyonu pıhtılaşma kan yapay yüzeylerin temas istenmeyen sonucu olabilir olsa da, bizim veri trombositlerin net bir biyolojik doz etkisini göstermektedir. FXII üzerinde yeni bulgular, trombosit, 10 polifosfatlar fosfatidilserin dağılımı 22 ve trombosit mikropartikülleri 23 aslında hemostaz, e önemli bir katkı olarak temas yolu pıhtılaşmasını yeniden değerlenmiş çünkü bu, transfüzyon tıbbı önemli olabilirÖzel olarak tromboz 24 bağlamında. Başarılı koagülasyon bu faktörlere bağlı gösterilir Örneğin, hastalarda trombosit transfüzyon değişken getiri veya banked trombosit değişken fosfatidilserin ifadesi böylece terapötik etkinlik değişkenliği neden olabilir.
Tarafından kollajen, dışsal pıhtılaşma rota veya TF yolağı ile lipidlenmiş rhTF co-immobilize, kollajen trombosit depolanması sırasında aktive edilir. Bu TF-taşıyan hücreler ve doku ile temas halinde kan getirmek yaralanmalar için bir model olarak, en kapsamlı moduna tahlili uzanır. Verilerimiz, kollajen ve TF birlikte immobilizasyon koagülasyon başlangıç anını azaltır, ancak pıhtılaşmanın oranını değiştirmediğini gösterir. Dikkat çekici bir yüzeye immobilize rhTF miktarı bu model 25, 26 önemli bir değişkendir ve belirli bir çalışma içinde standardize edilmelidir. presen içindetemas aktivasyonu önlenir, çünkü CTI CE TF yolu özel olarak incelenebilir (gösterilmemiştir).
Sonuç olarak, bizim deney düzeneği banked trombositler ile trombositopenik kan sulandırma ve hidrodinamik akış altında kalsiyum bağımlı trombosit birikimi ve fibrin oluşumu ile hemostaz bir model tarafından transfüzyon bir model birleştirir. Bu tahlil banked trombositlerin prokoagülan doğası üzerine soruları yanıtlamak için kullanılan ve etkileri trombosit konsantresi hazırlama teknikleri bu konuda sahip olacaktır.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Araştırma ve Belçikalı Kızıl Haç-Flanders Kan Hizmet Geliştirme Vakfı tarafından desteklenmiştir. sözleşme numarası BOF30290744 ile projeye verilen Ghent Üniversitesi'nden - Biz "bijzonder onderzoeksfond" (özel araştırma fonu BOF) tarafından sağlanan mali destek için minnettarım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
References
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M.
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y.
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al.
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
- Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
