Summary
Dette notatet beskriver en eksperimentell modell av hemostase som samtidig måler blodplatefunksjon og koagulasjon. Blodplater og fibrin fluorescensen måles i sanntid, og blodplateadhesjon hastighet, koagulering hastighet, og begynnende koagulering blir bestemt. Modellen blir brukt til å bestemme blodplate prokoaguleringsbetingelser egenskaper under strømning i konsentrater for transfusjon.
Abstract
Microfluidic modeller av hemostase vurdere platefunksjonen under forhold med hydrodynamisk skjær, men i nærvær av antikoagulantia, er denne analysen begrenset til blodplateavleiring bare. Den intrikate forholdet mellom Ca 2+ -avhengige koagulasjon og blodplatefunksjon krever forsiktig og kontrollert recalcification av blod før analyse. Vårt oppsett bruker en Y-formet blande kanal, som leverer konsentrert Ca 2+ / Mg 2+ buffer til å strømme blod rett før perfusjon, muliggjør rask recalcification uten prøve stasis. En ti-gangers forskjell i strømningshastighet mellom de to reservoarene minimaliserer fortynning. Den recalcified blod blir deretter perfusert i en kollagen-belagte analyse kammer, og differensial merking tillater sanntids avbildning av både blodplater og fibrin-avsetning ved hjelp av fluorescens videomikroskopi. Systemet bruker kun kommersielt tilgjengelige verktøy, øker sjansene for standardisering. Tilberedning av thrombocytopenic blod med blodplater fra banked konsentrerer seg dessuten modeller platetransfusjon, beviser dens bruk i denne forskningen domenet. Eksempler på data vist at koagulering angrep og fibrinavsetning var lineært avhengig av platekonsentrasjon, noe som bekrefter forholdet mellom primær og sekundær hemostase i vår modell. I en tidsramme på 16 perfusjon min, fikk kontakt aktiveringen ikke finne sted, til tross for recalcification til normal Ca 2+ og Mg 2+ nivåer. Når koagulasjonsfaktor Xlla ble inhibert med mais-trypsininhibitor, denne tidsrammen var enda lenger, noe som indikerer en betydelig dynamisk område hvor endringene i prokoagulerende arten av blodplatene kan vurderes. Co-immobilisering av vev faktor med kollagen betydelig redusert tid til utvikling av koagulering, men ikke dens hastighet. Alternativet for å studere vevsfaktor og / eller kontaktveien øker allsidigheten og anvendeligheten av analysen.
Introduction
Primær og sekundær hemostase ble opprinnelig begrepsfestet som to relativt separable biokjemiske prosesser. Primær hemostase ble sett på som en viktig bidragsyter i det arterielle strømningsforhold, med en nøkkelrolle for blodplater, mens sekundær hemostase ble sett å dominere koagulasjon etter venøs blodstrøm, slik at protease kaskade å danne uløselig fibrin. De siste tiårene har omformet dette tradisjonelle synet betydelig, erkjenne at plateaktivering og koagulasjon er avhengige av hverandre og er like viktige prosesser i løpet av fysiologisk og patologisk hemostase i alle (ikke-ekstreme) hydrodynamiske miljøer. Dette synet har blitt oversatt til klinikken, der analyser utviklet omfattende måle fullblods koagulasjon brukes stadig mer, men med mange gjenværende spørsmål om relevans, anvendbarhet og nytte en.
Vi har nylig publisert en funksjonell analyse av blodplatekonsentrater ved hjelp av microfluidic strømningskamrene er belagt med fibrillær kollagen i en in vitro modell for transfusjon 2, med prøver som inneholder normale mengder av røde blodlegemer, plasma og blodplater. Denne metoden benytter heparin eller hirudin antikoagulert blod, noe som tyder på ingen eller begrenset involvering av sekundær hemostase, som er avhengig av trombindannelsen og ionisert kalsium (Ca2 +). For å støtte trombin formasjon og dermed til å omfatte alle aspekter av hemostase etter mikrofluidstrømning, utviklet vi en komplementær metode på samme tekniske plattform, nå inkludert gratis Ca 2+. På denne måte kan blodplateavleiring og fibrindannelse studeres, igjen i en modell av blodplatetransfusjon, for å vurdere blodplatekonsentrat kvalitet.
I denne metoden, blir blodplater og fibrinogen merket med fluoroforer som har fullt adskilt emisjonsspektra. Dual farge, tillater real-time video mikroskopi da analysen avprimære blodplateadhesjon, samt koagulering initiering og fibrinavsetning. En viktig variabel i denne type analyse er recalcification, fordi tilsetningen av Ca 2+ til statisk blod, før perfusjon, vil uunngåelig føre til at kontakt-initiert koagulering i beholderen. Denne innvielsen vil skjevhet avlesning på grunn av tilstopping av rør og biochip viker før perfusjon. Derfor, i vår fremgangsmåte, citrat antikoagulert blod og en Ca2 + -holdig buffer pumpes separat gjennom de øvre ben av et Y-formet innløpskammer. Komponentene blandes i løpet av perfusjon før de går inn et analysekammer belagt med kollagen alene eller i kombinasjon med rekombinant human vevsfaktor (rhTF). Ved å tilpasse strømningshastigheter av de separate pumper og konsentrasjonen av Ca 2+ i bufferen, tar en 10% fortynning av den endelige blodprøven sted.
Ved hjelp av denne utvidede protokollen, viser vi bidraget fra coagulasjon faktor XII (FXII) og blodplatekonsentrasjonen å kontakte pathway koagulering start i henhold flyt. Våre data viser også at ved å belegge rhTF sammen med kollagen, det vevsfaktor pathway måles samtidig.
Protocol
Denne protokollen følger de institusjonelle etiske retningslinjer for forskning på humane prøver, og informert samtykke ble innhentet fra alle givere involvert. Godkjenning for forsøkene beskrevet her ble innhentet fra institusjonelle gjennomgang styret i Antwerpen universitetssykehus (godkjenningsnummer 16/10/120).
MERK: Temperatur indikasjonene er alltid romtemperatur, med mindre spesifisert.
1. Microfluidics Setup
- Forbered microfluidic flyt kammer kanaler, rør og skjøtestifter
- Resuspender kollagen lager ampullen ved virvelblanding, og deretter fortynnes i isotonisk glukoseoppløsning levert av produsenten til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml.
MERK: Bruk hest sene kollagen, i hovedsak består av type I fibriller. Equine kollagen type I er ofte referert til som "Horm" kollagen og er gullstandard for denne type assay, for både historisk ogbiologiske årsaker. Human type III kollagen kan også brukes, men disse fibriller belegge mindre godt, og det blodplateresponsen er ikke så sterk. Andre belegg flater kan også benyttes, såsom von Willebrand faktor, fibrinogen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1, eller kombinasjoner av disse tre. - Ta en ny engangsmikrofluid biochip med åtte rette, parallelle kanaler og dimensjoner, i mm, av 0,4 W x 0,1 H x 20 L. Pipetter 0,8 mL av kollagen og inn i kanalen (e) av biochip på den ene enden og merke dette så uttaket. Fylle bare 5/6 av kanallengden, slik at kollagen fibriller ikke er belagt på kanalen, fordi dette kan føre til tilstopping, noe som hindrer en effektiv perfusjon.
- Inkuber biochip ved 4 ° C i minst 4 timer i en fuktet og forseglet beholder.
- Å studere vev faktor (ytre) -mediert koagulasjon i kombinasjon med kontaktveien (indre), jakke kanalene med Collagen og rekombinant faktor menneskelig vev (rhTF).
- Fortynn rhTF i 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) -buffered saltvann (HBS, 0,9% (vekt / volum) NaCl, pH 7,4, 1: 3000, lager-konsentrasjon: 4,5 nM).
- Fjern det kollagenbeleggoppløsningen via utløpet. Pipetter 0,8 mL av rhTF i HBS (fortynning 1/500 av lager-konsentrasjon, sluttkonsentrasjon: 21:00) inn i utløpet av kanalen, fyller 5/6 av kanalens lengde, i likhet med den kollagen-belegget strategi.
- Inkuber biochip i ytterligere 30 minutter i en fuktet og forseglet beholder.
- Fylle de belagte kanaler med blokkeringsbuffer (1,0% (w / v) bovint serumalbumin og 0,1% (w / v) glukose i HBS), med start fra den andre enden (merket som innløpet). Fylle et likt antall Y-formede kanaler med samme blokkeringsbuffer i en blande biochip.
- Sørg for at alle kanaler og kanal armene er helt fylt med blokkeringsbuffer. Inkuber både biochips i minst 1 time i en fuktet og forseglet beholder.
- For hver kanal er i bruk, fremstille to rør på 8 cm lang, en 2 cm lange, og en 46 cm lang. Plassere en tapp i den ene ende av de tre mindre røret og i begge ender av den lengste røret.
- Resuspender kollagen lager ampullen ved virvelblanding, og deretter fortynnes i isotonisk glukoseoppløsning levert av produsenten til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml.
- Forbered skyllepumpe
- Skyll alle pumpelufthåndtering og den tilkoblede slanger med destillert vann.
- Avfette biochip casting med en presisjon støvfritt tørke og rødsprit for å fjerne utskrifter og støv.
- Fyll alle slanger med blokkeringsbuffer før du kobler dem til biochips.
- Fest belagt biochip på den automatiserte mikroskop scenen. Fest blande biochip i samme høyde som mikroskopet scenen ved hjelp av et laboratorium sakse jack.
- Koble den belagte biochip med blande biochip ved hjelp av den lengste rør, 46 cm lang. Kontroller at begge biochips er på avstand, slik at slangen danner en fleksibel, men rett linje. Fest en sprøyte kontaktpinnen inn i Luer-kompatible rør av skyllepumpe. Koble den til den frie ende av den to-cm røret og feste den andre enden til utløpet av den belagte biochip.
- Fest to 8 cm rør til blande biochip innløpet ved hjelp av pinnene. Sett den frie enden av hvert rør i en ampulle med HBS. Skyll alle rør og alle kanaler med 1 ml HBS.
MERK: HBS strømmer fra ampullen gjennom 8-cm røret til blande brikken og inn i 46-cm røret til den belagte brikke (som strømmer fra den ubelagte til den belagte del) på grunn av trekkraften fra skyllepumpen. Dette trinnet fjerner blokkerende buffer og dårlig levd kollagen (eller rhTF i dobbeltbelagt biochips).
- Klargjør perfusjon pumpene
- Åpne driveren av perfusjon pumper. Initial pumpene ved å dobbeltklikke på sprøyter ikonet i programvaren.
- Velg type sprøyte som skal brukes: 1 ml sprøyter for koagulering bUffer og 2 ml sprøyter for det rekonstituerte blod.
- Koble sprøytene til biochip bygge
- Koble fra skyllepumpen og alle rør, med unntak av den ene som forbinder de to biochips. Den kobles slangen blir gjenbrukt i følgende trinn.
- Koble 2-cm slange med sprøyte kontaktpinnen til Luer lock av en tykkvegget avfall slange. Fyll tykkveggede rør med standard pepsin løsning ved hjelp av en sprøyte.
MERK: Tilsetning av pepsin til avfalls tubing hemmer og lyserer post-perfusjon clotting og hindrer derfor tilstopping av systemet på baksiden slutten. - Feste den åpne ende av det tykkveggede røret med en klemme Kocher. Plasser en passende avfallsbeholder med blekemiddel under for å samle opp gjennomstrømning.
- Fest slangen med sin pin til utløpet av den belagte biochip.
2. Utarbeidelse av blodprøver
- Samle blod fra en frisk frivillig og skille komponentene 4
- Samle opp blod i en evakuert etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) beholder. Bruk denne prøven bare for å utføre en fullstendig blodtelling (CBC) med en automatisert hematologi analysator.
- Samle blod i evakuerte natriumsitrat beholdere. 5 ml blod kreves per kanal.
- Plasser prøven (e) på en horisontal rotator påvente blod tilberedning.
MERK: Analysen skal være fullført innen 3 timer med blodprøvetaking. Platekonsentrat og fullblodsprøver er ABO / RhD blodtype matchet. - -Sentrifuge i 13 min ved 250 x g for å fremstille blodplaterikt plasma (PRP). Ikke bruk sentrifugen bremsen for å hindre forstyrrelse av løst pakket pellet.
- Overfør PRP til en ny sentrifugering konisk rør. Sentrifuger i 10 minutter ved 4500 x g (med brems) for å pelletere blodplatene og fremstille blodplate-fattig plasma (PPP). Kast platelet pellet. Inkuber PPP i et vannbad ved 37 ° C.
- Overfør de sammenpakkede røde blodcellene til en frisk konisk rør ved å perforere bunnen av den opprinnelige ett med en 21 G nål.
MERK: Restplatetallet i den pakkede røde blodfraksjon er 11 ± 4 x 10 3 per mL (gjennomsnitt ± SD, n = 10).
- rekonstituere blod
- Bestem hematokrit av røde blodceller utarbeidet i trinn 2.1.6 ved hjelp av en automatisert hematologi analysator.
- Bestem platekonsentrasjon til blodplate-konsentrat som vil bli brukt for analyse ved bruk av en automatisert hematologianalysator.
- Beregn volum av pakkede røde blodceller, blodplatekonsentrat, og PPP som vil gi en 40% hematokritt, og 250 x 10 3-blodplater / pl i en 2,5 ml sluttvolum. Bland disse for å fremstille rekonstituerte blod og utføre en CBC.
MERK: Andre mål-titere av celler kan benyttes, avhengig av the problemstillingen. - Fremstille en "blank" kontrollprøve hvor volumet av blodplatekonsentrat er erstattet med det samme volum av saltløsning for å bestemme konsentrasjonen av "endogene" blodplater (dvs. ikke-blodbank blodplater).
- Merk rekonstituert blod for blodplater og fibrinogen
- Pipetter 13 ul av en 10,7 mg / ml oppløsning av Alexa Fluor 405-merket fibrinogen (70 ug / ml endelig konsentrasjon) i et reagensglass og tilsett 1 ml rekonstituert blod.
MERK: Fibrinogen ble merket med en kommersielt tilgjengelig kit i henhold til produsentens manual. - Bland annet 1 ml av rekonstituert blod i et reagensrør inneholdende 2 pl 1 mM DiOC 6 (1 mM endelig konsentrasjon) eller inneholdende 2 pl 5 mM Calcein AM (5 mM endelig konsentrasjon). Legge dette til røret som inneholder den blod med fibrinogen, noe som gir et sluttvolum på 2 ml platelet- og fibrinogen-sholdt blod.
MERK: Valget av fargestoff kan stole på problemstillingen eller preferanse for forskeren 5. Vær oppmerksom på at eksitasjon av noen fargestoff kan forårsake foto gjenstander. - Bland forsiktig ved å snu. Inkuber prøven i 10 minutter ved 37 ° C.
- Pipetter 13 ul av en 10,7 mg / ml oppløsning av Alexa Fluor 405-merket fibrinogen (70 ug / ml endelig konsentrasjon) i et reagensglass og tilsett 1 ml rekonstituert blod.
- Klargjør koagulasjon buffer
- Fremstille koagulering buffer inneholdende 10 mM CaCl2 og 3,75 mM MgCl2 i HBS. Forbered 1 ml av koagulasjon buffer for en kanal.
- Filter-sterilisere koagulasjon buffer gjennom et 0,2 mikrometer filter. Forvarme denne til 37 ° C.
3. Perfusjons analyse
- Fokusere mikroskopet optikken til kollagenfibre festet til bunnen av kanalen. Bruk fase kontrast eller differensial interferens kontrast (DIC). Velg "Set gjeldende Z for utvalgte fliser regioner" i forsøket programvare til digitalt fikse det valgte fokus.
- Definere en region av interesse (ROI) i den valgte kanalen med oppkjøpet programvaren av mikroskopet.
MERK: ROI kan være hvilken som helst overflate område vilkårlig valgt innenfor et perfusjon kanal. Det anbefales ikke å analysere trombedannelse og fibrin generasjon nær innløpet og utløpet for å unngå å skaffe bilder av ujevnt fordelt tromber. ROI overflatearealet bør inneholde et betydelig antall av tromber for å tillate utjevning av signalet variasjon av individuelle blodplater. Plasseringen av ROI i xy-planet for kanalen er alltid fast og bestemt før perfusjon. Om nødvendig, kan den ikke-belagte del av kanalen være inkludert i analysen for å bestemme om blodplater binder ikke-spesifikt til den biochip plast. - Forbered prøver for perfusjon
- Montere en 1 ml sprøyte inneholdende 1 ml forvarmet buffer koagulering i perfusjon pumpen.
- Bland forvarmet rekonstituert blod ved å forsiktig snu og last 2 mL i en 2 ml sprøyte.
- Pass på at all luft er fjernet fra både sprøyter og koble hver til en 8-cm rør ved hjelp av en sprøyte kontaktpinnen.
- Prime kontaktene og rør av både sprøyter i høy hastighet (400 mL / min) og stoppe når alt er fylt med koagulasjon buffer eller blod.
MERK: Ved fylling av røret, vil koagulering buffer og rekonstituerte blod umiddelbart blandes i den Y-formede kanal i blande biochip ved start av eksperimentet, unngår innføring av luft til kamrene perfusjon.
- Ved hjelp av pinner, feste den andre ende av slangen både til de delte ben av det Y-formede kanal i blande biochip. Den nederste ben er brukt for perfusert koagulering buffer og det øvre ben for rekonstituerte blod.
- Begynn eksperimentet ved å initiere perfusjon på 4,4 mL / min for koagulering buffer og 44 mL / min for rekonstituert blod. Fjern det Kocher klemmen ved utløpet av avfallsøret for å mulig perfuSion.
MERK: Strømningshastighet kan endres avhengig av problemstillingen. Start en stoppeklokke for å bestemme tiden mellom oppstart av forsøket og starten av sanntids bildeopptak. - Ta bilder hver 10 s for 30 minutter i sanntid ved hjelp av oppkjøp og eksperimentere programvare av mikroskopet. Starte opptaket når blanding av rekonstituert blod og koagulering buffer går det belagte biochip montert på mikroskopet scenen.
MERK: Andre tidsserier kan brukes avhengig av eksperimentelle oppsettet. Bruk en 100X forstørrelse (10X objektiv og 10X-objektiver).
4. Avslutte Experiment
- Avslutte pumpene og bildeopptak etter 30 min eller tidligere hvis signalet er mettet. Ta alle slanger og sprøyter og kast dem som biologisk farlig avfall.
5. Data Analysis
- Bestem trombe vekst (grønn fluorescens) og fibrin formasjon (fiolett fluorescence) kinetikk med bildeanalyse programvare. Følgende kommandoer er spesifikke for programvaren som brukes her:
- Åpne plugin Processing: sy å sy side-by-side bilder per tidspunkt.
- Åpne plugin bildeanalyse for å bestemme overflatedekning av blodplater.
- Åpne plugin Mål. Definer ROI ved å tegne et rektangel regionen, inkludert alle tromboser og fibrin fiber; i denne protokollen, er avkastningen et rektangel som måler 637 mm 2.
Velg kategorien Alle Views til å omfatte alle registrerte tidspunkter. - Bruk lage tabeller for å automatisk generere et regneark som skal inneholde gjennomsnittlig fluorescens intensitet verdien for valgt rektangel region av hvert tidspunkt.
- Lagre regneark i xml-format.
- Åpne et regneark i et regnearkprogram for videre beregninger.
- Trekk den første (background) verdien av alle data.
- Plotte fluorescente signalet som en funksjon av perfusjonen tid til både det grønne (blodplater) og den fiolette (fibrin) fargestoffer.
MERK: Ta hensyn til tiden mellom pumpe initialisering og selve utgangspunktet for bildeopptak. Dannelse av trombe er vanligvis en to-trinns prosess i denne modellen: (1) "langsom" blodplateadhesjon (dvs. adhesjon) til immobilisert kollagen, etterfulgt av (2) koagulering drevet trombe vekst med en "rask" økning i både blodplate-binding ( dvs. akkumulering) og fibrinavleiring (dvs. koagulering) (figur 1). - Beregn skråningen av blodplateadhesjon og akkumulering av lineær regresjon; denne skråningen gir plate trombe vekstkinetikk i hver fase av dannelsen.
- Beregn skråningen av fibrin koagulering og ekstrapolere denne linje for å avskjære X-aksen, å bestemme det øyeblikk av utbruddet.
Representative Results
Analyse av sanntids rådata er beskrevet i figur 1. For det første blodplater seg til den reaktive overflate, noe som resulterer i en jevn økning i nedtegnet grønn fluorescens (figur 1A, i), kalt adhesjon. I løpet av denne fasen, er det lite fiolett fluorescens, noe som indikerer at fibrin er ikke eller er bare marginalt dannet (figur 1B). Ved oppstart av koagulering, fiolett-fluorescerende fibrin innskudd raskt (iii), og i denne perioden, plate grønn fluorescens øker på omtrent samme hastighet, betegnet her som plate akkumulering (ii). Et enkelt eksperiment returnerer således tre forekomst av fluorescens økning (i, ii, og iii) som en surrogatmarkør for den hastighet ved hvilken blodplater og fibrin avsetningen finner sted i denne modellen. Videre er det et øyeblikks koagulering debut (øyeblikk-of-angrep (iv)) ekstrapolert, som er med på å bestemme blodplateprocoagulant potensial.
I fravær av TF, er koagulasjon initiering langsom og hovedsakelig går gjennom kontaktveien hvor den indre tenase komplekset aktiveres FX via direkte aktivering av FIX 6 ved FXI og / eller FXII. For å demonstrere FXII avhengighet, ble 4 mM av mais trypsin inhibitor (CTI) tilsettes for å hemme aktivert FXII (FXIIa) 7. Denne hemmingen ikke påvirke blodplate adhesjon (figur 2A), men koagulasjon startet ikke for vilkårlig definert totale varigheten av perfusjon eksperimentet (figur 2B og analytiker Video 1).
In vitro, kan kontaktveien være initiert av fremmede materialer som glass, eller i kliniske analyser ved anvendelse av et mineralsk materiale som kaolin. In vivo aktiverte plater gi den negative ladningen 8 </ sup> gjennom membranen eksponering av sure fosfolipider 9, som fosfatidylserin, og / eller gjennom utgivelsen av polyfosfater (polypp) 10, 11. Våre microfluidic sanntidsanalyseetterligner den sistnevnte fordi, i en rekke blodplatekonsentrasjon, den hemostatiske reaksjonen var avhengig av antallet blodplater (figur 3). Ved å øke antall blodplater i den rekonstituerte prøve, hastigheten for vedheft (figur 3A), akkumulering (figur 3B, grønn), og koagulasjon (figur 3B, fiolett) økte lineært. I det øyeblikket-of-innsett betydelig forkortet (figur 3C) ved å øke blodplatekonsentrasjon, noe som tyder på at en terskel rekke (aktivert) avsettes blodplater er nødvendig for å utløse koagulering.
Ved vevsskade in vivo, men TF-bærende celler vil jegnitiate koaguleringen av blod via den FVIIa-TF extrinsic tenase kompleks i nærvær av Ca2 +. Dette er etterlignet i vår eksperimentelle oppsett av post-belegg kollagen-holdige perfusjon kamre med lipidert rhTF. I en sammenkoblet analyse av kanaler belagt med kollagen eller i kombinasjon med rhTF, koagulering inntreden var betydelig raskere (figur 4A). Frekvensen av blodplateadhesjon var ikke lineær, slik at ingen lineær regresjon kan utføres (data ikke vist). Både frekvensen av koagulasjon og blodplate akkumulering var ikke forskjellig mellom forhold (figur 4B-4C, Supplementary Video 2).
Figur 1: Regresjonsanalyse av blodplateadhesjon og koagulering i microfluidic perfusjon kamre. Dette tallet klargjør parameterne utledet fra sanntids fluorescens rådata ervervet under recalcified blodstrømmen over en reaktiv overflate. (A) Mean intensiteten til grønn fluorescens viser blodplateavleiring som funksjon av tid perfusjon. Kurven beskriver en bimodal prosess som starter med (i) langsomt økende lineær blodplateadhesjon, etterfulgt av (ii) hurtig voksende lineær opphopning. Både lineære deler av kurven er gått tilbake og skråningen av disse beskriver de to satsene for trombedannelse ved blodplate-fluorescens; (I) adhesjon og (ii) oppsamling. (B) midlere intensitet av fiolett fluoresens viser avsetning av fibrin i funksjon av tiden. Under platelet vedheft, er fiolett fluorescens i hovedsak fraværende, mens det raskt utvikler følgende innledning av koagulasjon. Den (iv) øyeblikk-of-angrep er definert som skjæringen med x-aksen av den ekstrapolerte lineær regresjon av (iii) den andre fasen av trombedannelse ved fibrin fluorescens betegnet her som koagulering.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: I fravær av TF, koagulasjon i kollagen-belagte perfusjon strømningskammere, avhenger av FXIIa. Mikrofluid perfusjon av rekonstituerte blod som inneholder CTI eller kontrollbuffer (kontroll) ble utført ved en skjærhastighet på 1000 s -1 i til sammen 30 min. (A) Graden av blodplateadhesjon (r-1) var ikke avhengig av CTI. (B) I det øyeblikket-of-utbruddet for CTI-behandlede prøver var utover 30 min grense av forsøket (vist som en stiplet linje), som viser avhengigheten av FXIIa av denne parameteren. Barer og prikker er gjennomsnittsverdier, værhår er standardavvik. Statistisk analyse var av paret t-test. (NS = ikke signifikant, n ≥3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Koagulasjon henhold strømning avhenger av blodplatenummer. Mikrofluid perfusjon eksperimenter ble utført i kollagen-belagte kamre med rekonstituert blod i nærvær av Ca2 + og varierende blodplatekonsentrasjon (n ≥3). (A) Rate av blodplateadhesjon (B) pr blodplateopphopning (grønn) og koagulasjon (fiolett), og (C) øyeblikk-of-angrep er vist som funksjoner av blodplate-konsentrasjoner i rekondisjonert blod. Dots er middelverdier, værhår er standardavvik. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.
Figur 4: Aktivering av både TF og kontakt sti koagulering forkorter betydelig øyeblikk-of-utbruddet av koagulasjon. Rekonstituerte blod, i nærvær av Ca2 +, ble perfusert gjennom kamrene belagt med kollagen alene eller sammen med kollagen og rhTF å studere kontakt sti alene eller en kombinasjon av kontakt og TF veier. (A) I det øyeblikket-of-utbruddet av koagulering er betydelig forkortet i TF-inneholdende gjennomstrøm- ningskammere. (B) Satsen for akkumulering av blodplater under koagulering og (C) frekvensen av koagulasjon er ikke signifikant forskjellig mellom kollagen bare eller collagen- og rhTF-belagt flyt kamre. Barer og prikker er gjennomsnittsverdier; værhår er standardavvik. Statistisk analyse var av paret t-test. (NS = ikke signifikant, * P < 0,05, n ≥3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video 1: I fravær av TF, koagulasjon i kollagen-belagt perfusjon flyt kamre avhenger FXIIa. Rollen av kontaktbanen er bestemt i kollagen-belagte perfusjon strømningskammere. (A) Overlappende fluorescens bildesekvensen av blodplater (grønn) og fibrin (ogen) (fiolett) avsetning i fravær av CTI. (B) Samme sekvens som panel A, men med den grønne kanalen slått av. (C) Overlappende fluorescens bildesekvensen av blodplater (grønn) og fibrin (ogen) (fiolett) avsetning i nærvær av CTI. (D) Samme sekvens som panel C, men med den grønne kanalen slått av.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggs Video 2: Aktivering av både TF og kontakten sti forkorter betydelig koagulering øyeblikk-of-utbruddet. For å studere rollen til TF, ble strømningskamrene er belagt med kollagen alene eller sammen med kollagen og rhTF anvendt. (A) Overlappende fluorescens bildesekvensen av blodplater (grønn) og fibrin (ogen) (fiolett) avsetning i strømnings kamre belagt bare med kollagen. (B) Samme sekvens som panel A, men med den grønne kanalen slått av. (C) Overlappende fluorescens bildesekvensen av blodplater (grønn) og fibrin (ogen) (fiolett) avsetning i strømningskamrene er belagt med både kollagen og rhTF. (D) Samme sekvens som panel C, men med den grønne kanalen switched off. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Transfusjon av blodplatekonsentrater er foreskrevet for trombocytopenisk pasienten for å hindre eller stoppe blødninger. Dens klinisk effekt ble nylig markert i en historisk gjennomgang av akutt leukemi 12, minner om at økt overlevelse av pediatriske pasienter i sekstitallet og syttitallet var stort sett tilskrives forbedringer i (trombocytter) transfusjonsmedisin. Trombocyttkonsentrater brukes også til å demme blødning i akutt traume eller under operasjonen. Under disse forholdene, er blodplater med gode prokoaguleringsbetingelser egenskaper som hurtig initiere hemostase foretrukket, men blodplatekonsentratene blir fremstilt fra donasjoner av frivillige givere, og i motsetning farmakologiske medikamenter, er standardisert ved fremstillingen, ikke ved (kjemisk) masse. Derfor flere spørsmål innen blod banktjenester er ubesvart, inkludert de på optimale donasjon modaliteter, lagringsforhold og transfusjonspraksis. I feltet av platelet (blodoverføring) biologi, mange spørsmål på celle klaring fra sirkulasjon, bidrag transfundert blodplater til hemostase, eller deres immunologi også forbli ubesvart.
Tallrike laboratorieteknikker for platefunksjon analyse er tilgjengelige, men disse stort sett løse et entall aspekt av platefunksjon, som aggregering eller degranulation 13. For å vurdere blodplater og plate konsentrater bredt, omfattende modeller av hemostase er uunnværlig, og disse må inkludere hydrodynamikk. Blod reologi er avgjørende for å tolke blodplate oppførsel under hemostase 14, 15 eller 16 trombose, selv om antikoagulasjon hindrer Ca2 + og / eller trombin for å delta i nærvær av henholdsvis 2-citrat eller heparin,. For å studere samspillet mellom koagulasjon og blodplatefunksjon i henhold flyt 17, 18, normal trombindannelsen er nødvendig, og derfor fri Ca2 + i tillegg. Det eksperimentelle oppsettet for å studere hemostase under disse betingelser er komplisert, fordi tiltak for å hindre "gjenstand" eller ukontrollert aktivering av koagulering skal tas så mye som mulig. Videre mange spesialiserte forskningsgrupper bruker skreddersydde maskinvare 19, 20, noe som fører til betydelig inter-laboratoriet variabilitet 5. Typiske begrensninger av denne tilnærmingen er bruk av rektangulære beholdere, ikke-pulserende strømning profiler, og ikke-humane overflatebelegg 5. Analysen vi beskriver her bruker kommersielt tilgjengelige verktøy og kan derfor være egnet for standardisering.
Fordi koagulasjonskaskaden reaksjonen lett aktiveres når blod ikke er inneholdt i det menneskelige legeme, er kontrollert recalcification en dreietrinn. To oppnå dette, tilsetning av Ca 2+ som må utsettes til like før perfusjon, over det reaktive kollagen overflate, fordi når Ca 2 + buffer leveres i bulk til statisk blod, finner koagulering sted uunngåelig, etterhvert tetter igjen røret og biasing data tolkning (data ikke vist). Løsningen på dette problemet er å pumpe den Ca2 + buffer og blodet hver for seg, slik at for blanding av konvektive og diffusiv styrker under perfusjon på sin vei til analysekammeret. Fullstendig blanding er oppnådd i en 46-cm segment av produksjonsrøret mellom blandings- og analysekamrene. Denne lengden ble beregnet for optimal holdetid av reagenser til å blande basert på grunnleggende lover masse og konvektive transport 21 under perfusjon ved strømningshastighet benyttes (1000 s -1). Denne tilnærmingen viste seg kontrollerbar og reproduserbar.
Kontakt aktivering av koagulasjon er ofte sett på som et produkt av enkleblodprøvetaking og unngås ved tolkning av koaguleringstider. Derfor har vi demonstrert at, i fravær av inhibitorer, starter kontakt-indusert koagulasjon ved 16,7 min (± 3,7 min) av perfusjon. I nærvær av CTI å inhibere FXIIa-mediert kontakt aktivering, er koagulasjon ikke innledet under vilkårlig definert løpet av eksperimentet (30 min). Dette vinduet eksperimentering er tilstrekkelig lang til å skjelne prøver som er pro- eller antitrombotisk. Selv om koagulering ved kontakt aktivering kan være en uønsket konsekvens av blod i kontakt kunstige overflater, våre data viser en tydelig biologisk dose virkning av blodplater. Dette kan være viktig for transfusjonsmedisin, fordi nyere funn på FXII, polyfosfater plate 10, fosfatidylserin distribusjon 22, og platemikropartiklene 23 har faktisk revurdert kontakt sti koagulasjon som en viktig bidragsyter til hemostase, espesielt i sammenheng med trombose 24. For eksempel kan den variable utbyttet av blodplatetransfusjon i pasienter eller den variable fosfatidylserin ekspresjon av doserte blodplater og dermed fremkalle variasjoner i terapeutisk effektivitet hvis det lykkes koagulering er vist å være avhengig av disse faktorene.
Ved å co-immobilisere lipidert rhTF med kollagen, ytre koagulasjon rute, eller TF vei, aktiveres under plate avsetning på kollagen. Dette utvider analysen til sin mest omfattende modus, som en modell for skader som bringer blod i kontakt med TF-bærende celler og vev. Våre data viser at ko-immobilisering av kollagen og TF reduserer øyeblikk av koagulasjon utbruddet, men ikke forandre graden av koagulering. Av notatet, mengden av rhTF immobilisert til overflaten, er en viktig variabel i denne modellen 25, 26 og bør være standardisert innenfor en gitt studie. I gavece av CTI, kan TF veien skal studeres utelukkende (ikke vist) fordi kontaktaktivering blir forhindret.
Konklusjonen vår eksperimentelle oppsettet kombinerer en modell av transfusjon ved tilberedning av trombocytopenisk blod med banked blodplater og en modell av hemostase ved kalsiumavhengig blodplateavleiring og fibrin formasjon under hydrodynamisk flyt. Denne analysen vil bli brukt til å svare på spørsmål på den prokoagulerende arten av doserte blodplater og virkningene blodplatekonsentrat prepareringsteknikker har på denne.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Fondet for forskning og utvikling av den belgiske Røde Kors-Flandern Blood service. Vi erkjenner økonomisk støtte fra "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - spesiell forskningsfond) fra Ghent universitet bevilget til prosjektet med kontraktsnummer BOF30290744.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
References
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
- Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
