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Bioengineering

प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन और Hemostasis के लिए एक microfluidic फ्लो चैंबर मॉडल प्लेटलेट बयान और वास्तविक समय में आतंच गठन के उपाय

Published: February 14, 2017 doi: 10.3791/55351
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3,4, 1, 1,2,3
1Transfusion Research Center, Belgian Red Cross-Flanders, 2Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 3Blood Service, Belgian Red Cross-Flanders, 4Department of Public Health and Primary Care, KULeuven - University of Leuven

Summary

इस पत्र रक्तस्तम्भन के एक प्रयोगात्मक मॉडल है कि एक साथ प्लेटलेट समारोह और जमावट उपायों का वर्णन है। प्लेटलेट और आतंच प्रतिदीप्ति वास्तविक समय में मापा जाता है, और प्लेटलेट आसंजन दर, जमावट दर, और जमावट की शुरुआत निर्धारित कर रहे हैं। मॉडल आधान के लिए ध्यान केंद्रित में प्रवाह के तहत प्लेटलेट प्रोकोगुलैंट गुण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

रक्तस्तम्भन के Microfluidic मॉडल hydrodynamic कतरनी की शर्तों के तहत प्लेटलेट समारोह का आकलन है, लेकिन anticoagulants की उपस्थिति में, इस विश्लेषण प्लेटलेट बयान केवल के लिए प्रतिबंधित है। सीए 2 निर्भर जमावट और प्लेटलेट समारोह के बीच के जटिल संबंधों विश्लेषण करने से पहले रक्त की सावधानी से नियंत्रित और पुनर्खटीकरण की आवश्यकता है। हमारे सेटअप एक वाई के आकार का मिश्रण चैनल है, जो रक्त बहने सिर्फ छिड़काव करने से पहले, नमूना ठहराव के बिना तेजी से पुनर्खटीकरण को सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित सीए 2/2 मिलीग्राम + बफर की आपूर्ति का उपयोग करता है। दोनों जलाशयों के बीच प्रवाह वेग में दस गुना का अंतर कमजोर पड़ने कम करता है। recalcified खून तो एक कोलेजन लेपित विश्लेषण कक्ष में भरकर रखा जाता है, और अंतर लेबलिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग वीडियो दोनों प्लेटलेट और आतंच बयान के वास्तविक समय इमेजिंग परमिट। प्रणाली केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है, मानकीकरण की संभावना बढ़ रही है। अपरोक्ष का पुनर्गठनबैंकिंग से प्लेटलेट्स के साथ mbocytopenic रक्त इसके अलावा मॉडल प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन केंद्रित है, इस शोध के क्षेत्र में इसके उपयोग साबित हो। अनुकरणीय डेटा दिखा दिया है कि जमावट शुरू होने और आतंच बयान रैखिक प्लेटलेट एकाग्रता पर निर्भर थे, हमारे मॉडल में प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन के बीच के रिश्ते की पुष्टि। 16 छिड़काव मिनट की एक समय सीमा में, संपर्क सक्रियण सामान्य सीए 2 और 2 मिलीग्राम + स्तर के लिए जगह नहीं ले गए थे, पुनर्खटीकरण के बावजूद। जमावट कारक Xiia मकई trypsin अवरोध से हिचकते किया गया था, इस समय सीमा भी रह गया था, काफी गतिशील रेंज में जो प्लेटलेट्स की प्रोकोगुलैंट प्रकृति में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है का संकेत है। कोलेजन के साथ ऊतक कारक के सह-स्थिरीकरण काफी समय जमावट की शुरुआत करने के लिए कम है, लेकिन इसकी दर नहीं। ऊतक कारक और / या संपर्क मार्ग का अध्ययन करने के लिए विकल्प बहुमुखी प्रतिभा और परख की उपयोगिता बढ़ जाती है।

Introduction

प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन मूल रूप से दो अपेक्षाकृत वियोज्य जैव रासायनिक प्रक्रियाओं रूप में की अवधारणा कर रहे थे। प्राथमिक रक्तस्तम्भन, प्लेटलेट्स के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका के साथ धमनी प्रवाह की स्थिति में एक बड़ा योगदान के रूप में देखा गया था, जबकि माध्यमिक रक्तस्तम्भन शिरापरक रक्त प्रवाह के तहत जमावट पर हावी होने की इजाजत दी, प्रोटीज झरना अघुलनशील आतंच के लिए फार्म में देखा गया था। पिछले कुछ दशकों के इस परंपरागत दृष्टिकोण काफी हद तक reshaped है, स्वीकार करते हैं कि प्लेटलेट सक्रियण और जमावट अन्योन्याश्रित हैं और सभी (गैर चरम) hydrodynamic milieus में शारीरिक और रोग रक्तस्तम्भन के दौरान समान रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं हैं। यह दृश्य क्लिनिक, जहां व्यापक पूरे रक्त जमावट को मापने के लिए तैयार कर लिया assays तेजी से प्रासंगिकता, प्रयोज्यता और उपयोगिता 1 पर कई शेष प्रश्नों के साथ प्रयोग किया जा रहा है, हालांकि करने के लिए अनुवाद किया गया है।

हमने हाल ही में प्लेटलेट की एक कार्यात्मक विश्लेषण प्रकाशित, आधान 2 की इन विट्रो मॉडल में तंतुमय कोलेजन के साथ लेपित microfluidic प्रवाह कक्षों का उपयोग कर लाल रक्त कोशिकाओं, प्लाज्मा, और प्लेटलेट्स की मात्रा सामान्य से युक्त नमूनों के साथ केंद्रित है। इस विधि हेपरिन या Hirudin anticoagulated रक्त, कोई या माध्यमिक रक्तस्तम्भन, जो थ्रोम्बिन पीढ़ी और आयनित कैल्शियम (सीए 2) पर निर्भर है की सीमित भागीदारी जिसका अर्थ का उपयोग करता है। Microfluidic प्रवाह के तहत रक्तस्तम्भन के सभी पहलुओं को शामिल करने के लिए थ्रोम्बिन गठन का समर्थन करने के लिए और इस तरह, हम अब सहित मुक्त सीए 2 ही तकनीकी मंच पर एक पूरक विधि विकसित की है। इस तरह, प्लेटलेट बयान और आतंच गठन का अध्ययन किया जा सकता है, प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन के एक मॉडल में फिर से, प्लेटलेट ध्यान केंद्रित गुणवत्ता का आकलन करने के लिए।

इस विधि में, प्लेटलेट्स और फाइब्रिनोजेन fluorophores कि पूरी तरह से उत्सर्जन स्पेक्ट्रा अलग कर दिया है साथ लेबल रहे हैं। दोहरी रंग, वास्तविक समय वीडियो माइक्रोस्कोपी तब के विश्लेषण परमिटप्राथमिक प्लेटलेट आसंजन, साथ ही जमावट दीक्षा और आतंच बयान। क्योंकि स्थिर रक्त के लिए सीए 2 के अलावा, छिड़काव करने से पहले, अनिवार्य रूप से कंटेनर में संपर्क शुरू की जमावट कारण होगा परख के इस प्रकार में एक महत्वपूर्ण चर, पुनर्खटीकरण है। यह दीक्षा छिड़काव करने से पहले ट्यूबिंग और biochip inlets के clogging के कारण पूर्वाग्रह readout होगा। इसलिए, हमारे विधि में, साइट्रेट रक्त anticoagulated और एक सीए 2 युक्त बफर एक वाई के आकार का प्रवेश कक्ष के ऊपरी पैरों के माध्यम से अलग से पंप हैं। घटकों एक विश्लेषण चैम्बर कोलेजन अकेले या पुनः संयोजक मानव ऊतक कारक (rhTF) के साथ संयोजन के साथ लेपित प्रवेश करने से पहले छिड़काव के दौरान मिलाया जाता है। बफर में अलग पंप के प्रवाह वेग और सीए 2 की एकाग्रता आदत डाल करके, अंतिम रक्त नमूने के एक 10% कमजोर पड़ने जगह लेता है।

इस विस्तारित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम coagula के योगदान को प्रदर्शितtion कारक बारहवीं (FXII) और प्लेटलेट एकाग्रता प्रवाह के तहत मार्ग जमावट दीक्षा संपर्क करने के लिए। हमारे आंकड़े यह भी बताते हैं कि कोलेजन के साथ rhTF कोटिंग से, ऊतक कारक मार्ग समन्वित रूप से मापा जा सकता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल मानव नमूनों पर अनुसंधान के लिए संस्थागत नैतिक दिशा निर्देशों के बाद, और सूचित सहमति शामिल सभी दानदाताओं से प्राप्त हुई थी। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए स्वीकृति एंटवर्प विश्वविद्यालय अस्पताल (अनुमोदन संख्या 16/10/120) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड से प्राप्त हुई थी।

नोट: तापमान संकेत हमेशा कमरे के तापमान, जब तक निर्दिष्ट कर रहे हैं।

1. Microfluidics सेटअप

  1. Microfluidic प्रवाह कक्ष चैनलों, ट्यूबिंग, और जोड़ने पिन तैयार
    1. भंवर मिश्रण द्वारा कोलेजन शेयर शीशी Resuspend, और फिर 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए निर्माता द्वारा प्रदान isotonic ग्लूकोज समाधान में पतला।
      नोट: उपयोग घोड़े का पट्टा कोलेजन, मुख्य रूप से के प्रकार मैं तंतुओं बना हुआ है। घोड़े का कोलेजन प्रकार मैं अक्सर "Horm" कोलेजन के लिए भेजा और दोनों ऐतिहासिक और के लिए, परख के इस प्रकार के लिए स्वर्ण मानक हैजैविक कारणों से। मानव प्रकार III कोलेजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन तंतुओं कोट कम अच्छी तरह से, और प्लेटलेट प्रतिक्रिया के रूप में मजबूत नहीं है। अन्य कोटिंग सतहों भी ऐसे वॉन Willebrand कारक, फाइब्रिनोजेन, फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin, vitronectin, thrombospondin -1, या इन 3 के संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. एक नए, डिस्पोजेबल microfluidic biochip आठ सीधे, समानांतर चैनलों और आयामों के साथ एक छोर पर biochip के चैनल (ओं) में 0.4 डब्ल्यू 0.1 एक्स एच एक्स 20 एल Pipet 0.8 कोलेजन की μL का मिमी में ले लो, और के रूप में इस लेबल दुकान। चैनल लंबाई का सिर्फ 5/6 भरें ताकि कोलेजन तंतुओं चैनल प्रवेश पर लेपित नहीं कर रहे हैं, क्योंकि इस clogging है, जो एक कुशल छिड़काव भी नुकसान पहुँचा पैदा कर सकता है।
    3. एक humidified और मोहरबंद कंटेनर में कम से कम 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर biochip सेते हैं।
    4. (आंतरिक), कोट Colla के साथ चैनलों संपर्क मार्ग के साथ संयोजन में ऊतक कारक (बाह्य) मध्यस्थता जमावट अध्ययन करने के लिएजनरल और पुनः संयोजक मानव ऊतक कारक (rhTF)।
      1. 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) में rhTF पतला -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) खारा -buffered (एचबीएस; 0.9% (w / v) NaCl, पीएच 7.4, 1: 3000, शेयर एकाग्रता: 4.5 एनएम)।
      2. आउटलेट के माध्यम से कोलेजन कोटिंग समाधान निकालें। Pipet 0.8 एचबीएस में rhTF की μL (शेयर एकाग्रता, अंतिम एकाग्रता के कमजोर पड़ने 1/500: 9 बजे) चैनल के आउटलेट में, चैनल लंबाई, कोलेजन कोटिंग रणनीति के समान की 5/6 भरने।
      3. एक humidified और मोहरबंद कंटेनर में एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए biochip सेते हैं।
    5. बफर अवरुद्ध साथ लेपित चैनलों भरें (1.0% (w / v) गोजातीय सीरम albumin और 0.1% (w / v) एचबीएस में ग्लूकोज), दूसरे छोर (इनलेट रूप में लेबल) से शुरू। एक मिश्रण का biochip में ही अवरुद्ध बफर के साथ वाई के आकार चैनलों की संख्या बराबर भरें।
      1. सुनिश्चित करें कि सभी चैनलों और चैनल हथियार पूरी तरह से बफर अवरुद्ध से भर रहे हैं बनाओ। दोनों biochip सेतेएक humidified और मोहरबंद कंटेनर में कम से कम 1 घंटे के लिए है।
    6. उपयोग में प्रत्येक चैनल के लिए, लंबे समय से 8 सेमी, एक 2 सेमी लंबा, और एक 46 सेमी लंबे समय के दो ट्यूबिंग तैयार करते हैं। तीन छोटे ट्यूबिंग के एक छोर में और सबसे लंबे समय तक ट्यूबिंग के दोनों सिरों में एक पिन रखें।
  2. Rinsing पंप तैयार
    1. सभी पंप fluidics और आसुत जल से जुड़ा ट्यूबिंग कुल्ला।
    2. एक सटीक धूल से मुक्त पोंछे और विकृत शराब के साथ biochip की कास्टिंग के degrease प्रिंट और धूल हटाने के लिए।
    3. उन्हें biochips को जोड़ने से पहले बफर अवरुद्ध साथ सभी ट्यूबिंग भरें।
    4. स्वचालित खुर्दबीन मंच पर लेपित biochip को ठीक करें। खुर्दबीन मंच एक प्रयोगशाला कैंची जैक का उपयोग कर के रूप में एक ही ऊंचाई पर मिश्रण biochip को ठीक करें।
    5. मिश्रण biochip सबसे लंबे समय तक ट्यूबिंग, 46 सेमी लंबे समय का उपयोग के साथ लेपित biochip कनेक्ट करें। यकीन है कि दोनों biochips इतना है कि ट्यूबिंग एक लचीला लेकिन सीधी रेखा रूपों दूरी पर कर रहे हैं। rinsing पंप के Luer-संगत ट्यूबिंग में एक सिरिंज कनेक्टर पिन संलग्न। यह 2-सेमी ट्यूबिंग के मुक्त अंत से कनेक्ट करें और लेपित biochip के आउटलेट के लिए दूसरे छोर तय कर लो।
    6. अपनी पिन का उपयोग कर मिश्रण biochip प्रवेश करने के लिए दो 8 सेमी ट्यूबिंग को ठीक करें। HBS की एक शीशी में प्रत्येक ट्यूबिंग के मुक्त अंत रखो। सभी ट्यूबिंग और 1 एमएल एचबीएस के साथ सभी चैनलों कुल्ला।
      नोट: HBS rinsing पंप की खींच बल के कारण मिश्रण चिप से 8 सेमी ट्यूबिंग के माध्यम से और लेपित चिप (uncoated से लेपित हिस्सा करने के लिए बह रही है) के लिए 46 सेमी ट्यूबिंग के माध्यम से शीशी से बहती है। यह कदम (डबल लेपित biochips में या rhTF) अवरुद्ध बफर और खराब पालन कोलेजन को हटा।
  3. छिड़काव पंप तैयार
    1. छिड़काव पंप के ड्राइवर सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर में सीरिंज आइकन पर डबल क्लिक करके पंपों को प्रारम्भ करें।
    2. 1 एमएल सीरिंज जमावट बी के लिए: सिरिंज के प्रकार है कि इस्तेमाल किया जाएगा का चयन करेंuffer और पुनर्गठन के लिए रक्त 2 एमएल सीरिंज।
  4. Biochip निर्माण के लिए सीरिंज कनेक्ट
    1. rinsing पंप और सभी ट्यूबिंग, दो biochips जोड़ने वाली एक को छोड़कर डिस्कनेक्ट। काट दिया ट्यूबिंग निम्न चरणों में पुन: उपयोग किया जाता है।
    2. एक मोटी दीवारों अपशिष्ट ट्यूबिंग के Luer लॉक करने के लिए अपने सिरिंज कनेक्टर पिन के साथ 2 सेमी ट्यूबिंग कनेक्ट करें। मानक पेप्सिन समाधान के लिए एक सिरिंज का उपयोग कर के साथ मोटी दीवारों ट्यूबिंग भरें।
      नोट: अपशिष्ट ट्यूबिंग रोकता करने के लिए पेप्सिन के अलावा और बाद के छिड़काव के थक्के lyses और इसलिए वापस अंत में प्रणाली के clogging रोकता है।
    3. एक कोचर क्लैंप के साथ मोटी दीवारों ट्यूबिंग के खुले अंत सुरक्षित। ब्लीच के नीचे के साथ एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए रखें।
    4. लेपित biochip के आउटलेट के लिए अपनी पिन के साथ ट्यूबिंग को ठीक करें।

2. रक्त के नमूनों की तैयारी

  1. एक स्वस्थ स्वयंसेवक से खून ले लीजिए और उसके घटकों को अलग 4
    1. एक खाली ethylenediamine-tetraacetic एसिड (EDTA) कंटेनर में खून ले लीजिए। केवल एक पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) के प्रदर्शन के लिए एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक का उपयोग करने के लिए इस नमूने का प्रयोग करें।
    2. खाली करा लिया सोडियम साइट्रेट कंटेनरों में खून ले लीजिए। रक्त के 5 एमएल प्रति चैनल की आवश्यकता है।
    3. एक क्षैतिज रोटेटर लंबित रक्त पुनर्गठन पर नमूना (एस) रखें।
      नोट: परख शिराछदन के 3 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। प्लेटलेट ध्यान केंद्रित करने और पूरे रक्त के नमूने एबीओ / RhD रक्त समूह से मिलान कर रहे हैं।
    4. 250 XG पर 13 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (पीआरपी) तैयार करने के लिए। शिथिल पैक गोली की अशांति को रोकने के लिए सेंट्रीफ्यूज ब्रेक का प्रयोग न करें।
    5. एक ताजा शंक्वाकार centrifugation ट्यूब के लिए पीआरपी स्थानांतरण। (पीपीपी) के 4,500 XG (ब्रेक के साथ) पर 10 मिनट के प्लेटलेट्स गोली और प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा तैयार करने के लिए अपकेंद्रित्र। बेनी त्यागेंélet गोली। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पीपीपी को सेते हैं।
    6. एक 21 जी सुई के साथ मूल एक के नीचे perforating द्वारा एक ताजा शंक्वाकार ट्यूब पैक लाल रक्त कोशिकाओं स्थानांतरण।
      नोट: पैक लाल सेल अंश में अवशिष्ट प्लेटलेट काउंट (एन = ± एसडी मतलब है, 10) 11 ± 4 x 10 3 μL प्रति है।
  2. रक्त reconstitute
    1. कदम 2.1.6 में तैयार एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक का उपयोग कर पैक लाल रक्त कोशिकाओं के hematocrit निर्धारित करते हैं।
    2. प्लेटलेट ध्यान केंद्रित है कि एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के प्लेटलेट एकाग्रता का निर्धारण।
    3. खचाखच भरे लाल रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट ध्यान, और पीपीपी की मात्रा है कि एक 2.5 एमएल अंतिम मात्रा में एक 40% hematocrit और 250 x 10 3 प्लेटलेट्स / μL निकलेगा गणना। इन मिश्रण पुनर्गठन रक्त तैयार है और एक सीबीसी प्रदर्शन करने के लिए।
      नोट: कोशिकाओं के अन्य लक्ष्य titers, इस्तेमाल किया जा सकता वें पर निर्भर करता हैई अनुसंधान प्रश्न।
    4. एक "रिक्त" नियंत्रण नमूना है जिसमें प्लेटलेट की मात्रा ध्यान केंद्रित खारा का एक ही मात्रा की जगह है "अंतर्जात" प्लेटलेट्स (यानी, गैर-ब्लड बैंक प्लेटलेट्स) की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए तैयार करें।
  3. प्लेटलेट्स और फाइब्रिनोजेन के लिए पुनर्गठित रक्त लेबल
    1. एक 10.7 मिलीग्राम / एमएल एक टेस्ट ट्यूब में एलेक्सा स्त्राव 405 लेबल फाइब्रिनोजेन (70 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) के समाधान के pipet 13 μL और पुनर्गठन रक्त के 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: फाइब्रिनोजेन निर्माता की पुस्तिका के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर चिह्नित किया गया।
    2. 1 मिमी DiOC 6 (1 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के 2 μL युक्त या 5 मिमी Calcein AM (5 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) के 2 μL युक्त एक टेस्ट ट्यूब में पुनर्गठन खून का एक और 1 एमएल मिक्स। फाइब्रिनोजेन के साथ रक्त युक्त ट्यूब के लिए इस जोड़ें, platelet- के 2 एमएल के अंतिम मात्रा दे रही है और फाइब्रिनोजेन-एसtained खून।
      नोट: डाई की पसंद अनुसंधान प्रश्न या शोधकर्ता 5 की पसंद पर निर्भर कर सकते हैं। जानते हैं कि किसी भी डाई की उत्तेजना प्रकाश रासायनिक कलाकृतियों पैदा कर सकता है।
    3. धीरे inverting द्वारा मिश्रण। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  4. जमावट बफर तैयार
    1. जमावट 10 मिमी 2 CaCl और एचबीएस में 3.75 मिमी 2 MgCl युक्त बफर तैयार करें। एक चैनल के लिए जमावट बफर के 1 एमएल तैयार करें।
    2. फिल्टर बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जमावट बफर। 37 डिग्री सेल्सियस को यह पूर्व गर्म।

3. छिड़काव परख

  1. चैनल के नीचे का पालन करने के लिए कोलेजन फाइबर ऑप्टिक्स माइक्रोस्कोप ध्यान दें। चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) का प्रयोग करें। डिजिटल चयनित फोकस ठीक करने के लिए प्रयोग सॉफ्टवेयर में "चयनित टाइल क्षेत्रों के लिए वर्तमान जेड सेट" का चयन करें।
  2. चयनित चैनल माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में रुचि (आरओआई) के एक क्षेत्र को परिभाषित करें।
    नोट: रॉय किसी भी सतह क्षेत्र मनमाने ढंग से एक छिड़काव चैनल के भीतर चुना जा सकता है। यह क्रम में thrombus गठन और आतंच पीढ़ी इनलेट और आउटलेट के करीब विश्लेषण करने के लिए असमान रूप से वितरित thrombi की छवियों को प्राप्त करने से बचने के लिए नहीं की सलाह दी है। रॉय सतह क्षेत्र अलग-अलग प्लेटलेट्स द्वारा संकेत परिवर्तनशीलता से बाहर लेवलिंग के लिए अनुमति देने के लिए thrombi की एक महत्वपूर्ण संख्या को शामिल करना चाहिए। चैनल के xy के विमान में रॉय का स्थान हमेशा तय की और छिड़काव करने से पहले निर्धारित किया जाता है। यदि आवश्यक हो, चैनल के uncoated हिस्सा निर्धारित करने के लिए अगर प्लेटलेट्स biochip प्लास्टिक को nonspecifically बाँध विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है।
  3. छिड़काव के लिए नमूने तैयार
    1. छिड़काव पंप में पूर्व गर्म जमावट बफर के 1 एमएल युक्त 1 एमएल सिरिंज माउंट।
    2. धीरे inverting और लोड 2 मीटर से पूर्व गर्म पुनर्गठन रक्त मिक्सएक 2 एमएल सिरिंज में एल।
    3. सुनिश्चित करें कि सभी हवा दोनों सीरिंज से हटा दिया है और एक सिरिंज कनेक्टर पिन का उपयोग कर एक 8 सेमी ट्यूबिंग के लिए प्रत्येक कनेक्ट करें।
    4. प्रधानमंत्री कनेक्टर्स और उच्च गति (400 μL / मिनट) पर दोनों सीरिंज के ट्यूबिंग और जब सब कुछ जमावट बफर या रक्त से भर जाता है बंद करो।
      नोट: ट्यूबिंग भड़काना करके, जमावट बफर और पुनर्गठन रक्त तुरंत मिश्रण biochip के वाई के आकार चैनल में मिलाया जाएगा, जब प्रयोग शुरू छिड़काव कक्षों के लिए हवा की शुरूआत से परहेज।
  4. पिन का उपयोग कर, मिश्रण biochip में वाई के आकार का चैनल का विभाजन पैरों को दोनों ट्यूबिंग के दूसरे छोर तय कर लो। नीचे पैर जमावट बफर और पुनर्गठन के लिए रक्त ऊपरी पैर perfusing के लिए प्रयोग किया जाता है।
  5. 4.4 μL / जमावट बफर के लिए और न्यूनतम 44 μL / पुनर्गठन के लिए रक्त मिनट पर छिड़काव की शुरुआत से प्रयोग शुरू करें। अपशिष्ट ट्यूबिंग की अनुमति के लिए की दुकान perfu पर कोचर दबाना हटायेसायन।
    नोट: प्रवाह दर अनुसंधान प्रश्न के आधार पर बदला जा सकता है। प्रयोग की दीक्षा और वास्तविक समय छवि अधिग्रहण की शुरुआत के बीच समय निर्धारित करने के लिए एक स्टॉपवॉच शुरू करो।
  6. रिकॉर्ड छवियों माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण और प्रयोग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय में 30 मिनट के लिए हर 10 से। रिकॉर्डिंग शुरू जब पुनर्गठन रक्त और जमावट बफर के मिश्रण लेपित biochip खुर्दबीन मंच पर मुहिम शुरू की प्रवेश करती है।
    नोट: अन्य समय श्रृंखला प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर किया जा सकता है। एक 100X बढ़ाई (10X उद्देश्य और 10X लेंस) का प्रयोग करें।

4. समाप्त प्रयोग

  1. 30 मिनट के बाद पंप और छवि अधिग्रहण बर्खास्त या इससे पहले यदि संकेत संतृप्त है। सभी ट्यूबिंग और सीरिंज को अलग कर उन्हें biohazardous अपशिष्ट के रूप में त्यागें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. Thrombus विकास (हरी प्रतिदीप्ति) और आतंच गठन का निर्धारण करते हैं (बैंगनी fluorescencई) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ कैनेटीक्स। निम्न आदेश का यहां इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट हैं:
    1. प्लगइन प्रसंस्करण खोलें: समय बिंदु प्रति पक्ष द्वारा साइड छवियों सिलाई के लिए सिलाई।
    2. प्लेटलेट्स की सतह कवरेज का निर्धारण करने के लिए प्लगइन छवि विश्लेषण खोलें।
    3. प्लगइन उपाय खोलें। सभी thrombi और आतंच फाइबर सहित एक आयत क्षेत्र ड्राइंग द्वारा रॉय को परिभाषित करें; इस प्रोटोकॉल में, रॉय एक आयत 637 मिमी 2 मापने है।
      सभी रिकॉर्ड समय बिंदुओं को शामिल करने के लिए टैब का चयन करें सभी विचारों।
    4. टेबल बनाने के लिए स्वचालित रूप से एक स्प्रेडशीट कि हर समय बिंदु के चयनित आयत क्षेत्र का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य में शामिल होंगे उत्पन्न करने के लिए प्रयोग करें।
    5. एक्सएमएल फॉर्मेट में स्प्रेडशीट बचाओ।
  2. आगे की गणना के लिए एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में एक स्प्रेडशीट खोलें।
    1. घटाएँ प्रारंभिक (पृष्ठभूमिएन डी) सभी डेटा के मूल्य।
    2. दोनों हरे (प्लेटलेट्स) और वायलेट (आतंच) रंगों के लिए छिड़काव समय के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत प्लॉट।
      नोट: खाते में पंप प्रारम्भ और छवि अधिग्रहण की वास्तविक प्रारंभिक बिंदु के बीच समय ले लो। Thrombus गठन आम तौर पर इस मॉडल में एक दो कदम प्रक्रिया है: (1) "" धीमी प्लेटलेट आसंजन (यानी, आसंजन) दोनों प्लेटलेट बंधन में एक "तेजी" वृद्धि के साथ (2) जमावट संचालित thrombus विकास के द्वारा पीछा स्थिर कोलेजन के लिए ( यानी, संचय) और आतंच बयान (यानी, जमावट) (चित्रा 1)।
    3. प्लेटलेट आसंजन और रेखीय प्रतिगमन द्वारा संचय की ढलान की गणना; इस ढलान अपने गठन के प्रत्येक चरण में प्लेटलेट thrombus विकास कैनेटीक्स अर्जित करता है।
    4. आतंच जमावट की ढलान की गणना और एक्स अक्ष अवरोधन के लिए इस लाइन एक्सट्रपलेशन, शुरुआत के क्षण का निर्धारण।

Representative Results

वास्तविक समय कच्चे डेटा के विश्लेषण के चित्र 1 में वर्णित है। सबसे पहले, प्लेटलेट्स प्रतिक्रियाशील सतह का पालन करना, दर्ज की हरी प्रतिदीप्ति में लगातार वृद्धि (चित्रा 1 ए, मैं) में जिसके परिणामस्वरूप, आसंजन बुलाया। इस चरण के दौरान, वहाँ छोटे बैंगनी प्रतिदीप्ति का संकेत है कि आतंच नहीं है या केवल मामूली गठन किया है (चित्रा 1 बी) है। जमावट की दीक्षा पर, बैंगनी fluorescing आतंच जमा तेजी से (iii), और उस समय के दौरान, के बारे में एक ही दर पर प्लेटलेट हरी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, प्लेटलेट संचय के रूप में यहाँ नामित (ii)। एक ही प्रयोग इस प्रकार प्रतिदीप्ति वृद्धि के तीन दरों रिटर्न (मैं, द्वितीय और तृतीय) वेग, जिस पर प्लेटलेट और आतंच बयान इस मॉडल में जगह लेता है के लिए एक किराए मार्कर के रूप में। इसके अलावा, जमावट शुरुआत (पल-की शुरुआत (iv)) का एक पल extrapolated है, जो प्लेटलेट का एक कारक हैप्रोकोगुलैंट संभावित।

टीएफ के अभाव में, जमावट दीक्षा धीमी है और मुख्य रूप से संपर्क मार्ग जहां आंतरिक tenase जटिल FXI और / या FXII द्वारा निदान 6 के प्रत्यक्ष सक्रियण के माध्यम से सक्रिय हो जाता है FX के माध्यम से चलाता है। (FXIIa) 7 FXII निर्भरता को प्रदर्शित करने के लिए, मकई trypsin अवरोध के 4 सुक्ष्ममापी (सीटीआई) सक्रिय FXII को बाधित करने के लिए जोड़ा गया था। इस निषेध प्लेटलेट आसंजन (2A चित्रा) को प्रभावित नहीं किया था, लेकिन जमावट छिड़काव प्रयोग (चित्रा 2 बी और पूरक वीडियो 1) के मनमाने ढंग से परिभाषित कुल अवधि के लिए शुरू नहीं किया।

इन विट्रो में, संपर्क मार्ग kaolin तरह एक खनिज सामग्री का उपयोग कर विदेशी सामग्री कांच की तरह, या चिकित्सीय संसाधनों में से शुरू किया जा सकता है। विवो में, सक्रिय प्लेटलेट्स नकारात्मक चार्ज 8 प्रदान </ sup> अम्लीय फॉस्फोलिपिड 9, phosphatidylserine की तरह, और / या polyphosphates की रिहाई (नाकड़ा) 10, 11 के माध्यम से की झिल्ली प्रदर्शन के माध्यम से। हमारे microfluidic वास्तविक समय परख mimics उत्तरार्द्ध क्योंकि, प्लेटलेट सांद्रता का एक सीमा में, hemostatic प्रतिक्रिया प्लेटलेट काउंट (चित्रा 3) पर निर्भर करता था। पुनर्गठन के नमूने में प्लेटलेट्स की संख्या में वृद्धि करके, आसंजन की दर (चित्रा 3 ए), संचय (चित्रा 3 बी, हरा), और जमावट (चित्रा 3 बी, बैंगनी) रैखिक वृद्धि हुई है। पल-की शुरुआत काफी बढ़ रही है, प्लेटलेट एकाग्रता से छोटा (चित्रा 3 सी) का सुझाव है कि (सक्रिय) जमा प्लेटलेट्स की एक सीमा नंबर जमावट को गति प्रदान करने के लिए आवश्यक है।

विवो में ऊतकों को नुकसान करने पर, तथापि, टीएफ असर कोशिकाओं मैं लूंगासीए 2 की उपस्थिति में FVIIa-TF बाह्य tenase जटिल के माध्यम से रक्त के थक्के nitiate। इस से हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में मजाक उड़ाया जाता है के बाद कोटिंग lipidated rhTF साथ कोलेजन युक्त छिड़काव कक्षों। कोलेजन केवल या rhTF के साथ संयोजन में साथ लेपित चैनलों की एक बनती विश्लेषण में, जमावट शुरू होने के काफी तेजी से (चित्रा -4 ए) था। प्लेटलेट आसंजन की दर रेखीय नहीं था, इसलिए कोई रेखीय प्रतिगमन (डेटा) नहीं दिखाया प्रदर्शन किया जा सकता है। दोनों जमावट और प्लेटलेट संचय की दर की स्थिति (चित्रा 4 बी-4C, पूरक वीडियो 2) के बीच अलग नहीं थे।

आकृति 1
चित्रा 1: प्लेटलेट आसंजन और microfluidic छिड़काव कक्षों में जमावट के प्रतिगमन विश्लेषण। यह आंकड़ा मापदंडों के वास्तविक समय प्रतिदीप्ति कच्चे डेटा से प्राप्त स्पष्ट किया एक प्रतिक्रियाशील सतह पर recalcified रक्त के प्रवाह के दौरान हासिल कर ली। (ए) मतलब हरी प्रतिदीप्ति की तीव्रता छिड़काव समय के समारोह में प्लेटलेट बयान से पता चलता है। वक्र एक bimodal प्रक्रिया के साथ (मैं) शुरुआत धीरे-धीरे रेखीय प्लेटलेट आसंजन (ii) तेजी से बढ़ रही रैखिक संचय के द्वारा पीछा बढ़ती वर्णन करता है। वक्र के दोनों भागों रैखिक वहीं कर रहे हैं और इनमें से ढलान प्लेटलेट प्रतिदीप्ति द्वारा thrombus गठन के दो दरों का वर्णन करता है; (I) आसंजन और (ii) संचय। (बी) मतलब बैंगनी प्रतिदीप्ति की तीव्रता समय के समारोह में आतंच के बयान से पता चलता है। प्लेटलेट आसंजन के दौरान, बैंगनी प्रतिदीप्ति जबकि इसे जल्दी जमावट के निम्नलिखित दीक्षा विकसित करता है, अनिवार्य रूप से अनुपस्थित है। (Iv) पल-की शुरुआत जमावट के रूप में यहाँ नामित आतंच प्रतिदीप्ति द्वारा (iii) thrombus गठन के दूसरे चरण के extrapolated रेखीय प्रतिगमन की एक्स अक्ष के साथ अवरोधन के रूप में परिभाषित किया गया है।एफई = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: टीएफ के अभाव में, कोलेजन लेपित छिड़काव प्रवाह कक्षों में जमावट FXIIa पर निर्भर करता है। पुनर्गठन रक्त सीटीआई या नियंत्रण बफर (नियंत्रण) युक्त Microfluidic छिड़काव 1,000 एस के एक कतरनी दर -1 30 मिनट की कुल के लिए प्रदर्शन किया था। (ए) प्लेटलेट आसंजन की दर (एस -1) सीटीआई पर निर्भर नहीं था। (बी) के पल-की शुरुआत सीटीआई इलाज के नमूने के लिए प्रयोग (एक बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है) के 30 मिनट की सीमा से परे था, इस पैरामीटर के FXIIa पर निर्भरता का प्रदर्शन है। बार और डॉट्स मतलब मूल्यों, मूंछ मानक विचलन कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण बनती टी परीक्षण द्वारा किया गया था। (एन एस = महत्वपूर्ण नहीं, एन ≥3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रवाह के तहत जमावट प्लेटलेट की संख्या पर निर्भर करता है। Microfluidic छिड़काव प्रयोगों सीए 2 की उपस्थिति में पुनर्गठन रक्त और अलग प्लेटलेट सांद्रता (एन ≥3) के साथ कोलेजन लेपित कक्षों में प्रदर्शन किया गया। प्लेटलेट आसंजन (बी) प्लेटलेट संचय (हरा) और जमावट (बैंगनी), और (सी) पल-की शुरुआत की दर से (ए) दर पुनर्गठन रक्त में प्लेटलेट सांद्रता के कार्यों के रूप में दिखाया गया है। डॉट्स मतलब मूल्यों, मूंछ मानक विचलन कर रहे हैं कर रहे हैं। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की पर।

चित्रा 4
चित्रा 4: दोनों टीएफ और संपर्क मार्ग जमावट की सक्रियता काफी पल-की शुरुआत की जमावट shortens। रक्त का पुनर्गठन, सीए 2 की उपस्थिति में, कोलेजन अकेले या कोलेजन और rhTF अकेले संपर्क मार्ग या संपर्क और TF रास्ते में से एक संयोजन का अध्ययन करने के साथ साथ लेपित कक्षों के माध्यम से भरकर रखा गया था। (ए) पल-की शुरुआत जमावट की काफी टीएफ युक्त प्रवाह कक्षों में छोटा है। (बी) जमावट और (सी) के दौरान प्लेटलेट्स के संचय की दर जमावट की दर केवल या कोलेजन और rhTF लेपित प्रवाह कक्षों कोलेजन के बीच काफी अलग नहीं कर रहे हैं। बार और डॉट्स मतलब मूल्यों कर रहे हैं; मूंछ मानक विचलन कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण बनती टी परीक्षण द्वारा किया गया था। (एन एस महत्वपूर्ण नहीं =, * पी < 0.05, एन ≥3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1
पूरक वीडियो 1: टीएफ के अभाव में, कोलेजन लेपित छिड़काव प्रवाह कक्षों में जमावट FXIIa पर निर्भर करता है। संपर्क मार्ग की भूमिका कोलेजन लेपित छिड़काव प्रवाह कक्षों में चुना गया है। सीटीआई के अभाव में प्लेटलेट (हरा) और आतंच (ogen) (बैंगनी) बयान की (ए) मढ़ा प्रतिदीप्ति छवि अनुक्रम। (बी) के एक पैनल के रूप में है, लेकिन ग्रीन चैनल के साथ एक ही क्रम बंद कर दिया। (सी) प्लेटलेट (हरा) और आतंच (ogen) (बैंगनी) सीटीआई की उपस्थिति में बयान की मढ़ा प्रतिदीप्ति छवि अनुक्रम। (डी) पैनल सी के रूप में है, लेकिन ग्रीन चैनल के साथ एक ही क्रम बंद कर दिया।ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2
पूरक वीडियो 2: दोनों टीएफ की सक्रियता और संपर्क मार्ग काफी जमावट पल-की शुरुआत shortens। टीएफ की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, प्रवाह कक्षों कोलेजन अकेले या कोलेजन और rhTF साथ लेपित के साथ इस्तेमाल किया गया। (ए) प्लेटलेट (हरा) और आतंच (ogen) (बैंगनी) केवल कोलेजन के साथ लेपित प्रवाह कक्षों में बयान की मढ़ा प्रतिदीप्ति छवि अनुक्रम। (बी) के एक पैनल के रूप में है, लेकिन ग्रीन चैनल के साथ एक ही क्रम बंद कर दिया। (सी) प्लेटलेट (हरा) और आतंच (ogen) (बैंगनी) दोनों कोलेजन और rhTF के साथ लेपित प्रवाह कक्षों में बयान की मढ़ा प्रतिदीप्ति छवि अनुक्रम। (डी) पैनल सी के रूप में है, लेकिन ग्रीन चैनल switc साथ उसी क्रमबंद hed। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्लेटलेट की आधान केंद्रित रोकने या रक्तस्राव को रोकने के thrombocytopenic रोगी के लिए निर्धारित है। इसके नैदानिक प्रभाव हाल ही में तीव्र ल्यूकेमिया 12 के एक ऐतिहासिक समीक्षा में डाला गया था, याद है कि साठ के दशक और सत्तर के दशक में बाल चिकित्सा रोगियों की वृद्धि की जीवित रहने की दर काफी हद तक (प्लेटलेट) ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के क्षेत्र में सुधार के कारण थे। प्लेटलेट केंद्रित भी तीव्र आघात या सर्जरी के दौरान खून बह रहा है स्टेम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन परिस्थितियों में, उत्कृष्ट प्रोकोगुलैंट गुण है कि तेजी से रक्तस्तम्भन आरंभ के साथ प्लेटलेट्स पसंद कर रहे हैं, लेकिन प्लेटलेट केंद्रित स्वैच्छिक दाताओं की दान से तैयार कर रहे हैं और, औषधीय दवा के विपरीत, केवल, के द्वारा नहीं (रासायनिक) रचना तैयारी द्वारा मानकीकृत कर रहे हैं। इसलिए, रक्त बैंकिंग के क्षेत्र में कई सवाल अनुत्तरित हैं, इष्टतम दान के तौर तरीकों, भंडारण की स्थिति, और आधान प्रथाओं पर उन सहित। पी एल के क्षेत्र मेंatelet (आधान) जीव विज्ञान, प्रचलन से सेल निकासी पर कई सवाल, रक्तस्तम्भन को चढ़ाया प्लेटलेट्स का योगदान है, या उनके इम्यूनोलॉजी भी अनुत्तरित रह।

प्लेटलेट समारोह के विश्लेषण के लिए कई प्रयोगशाला तकनीक उपलब्ध हैं, लेकिन इनमें से ज्यादातर प्लेटलेट समारोह की एक विलक्षण पहलू को संबोधित, एकत्रीकरण या degranulation 13 की तरह। मोटे तौर पर प्लेटलेट्स और प्लेटलेट केंद्रित का आकलन करने के लिए, रक्तस्तम्भन के व्यापक मॉडल अपरिहार्य हैं, और इन hydrodynamics शामिल करना चाहिए। रक्त rheology सही ढंग से रक्तस्तम्भन 14, 15 या 16 थ्रोम्बोसिस दौरान प्लेटलेट व्यवहार की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है, भले ही anticoagulation सीए 2 + रोकता है और / या थ्रोम्बिन साइट्रेट या हेपरिन क्रमश: 2 की उपस्थिति में भाग लेने के लिए। प्रवाह 17 के तहत जमावट और प्लेटलेट समारोह के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के, 18, सामान्य थ्रोम्बिन पीढ़ी की आवश्यकता होती है, और इसलिए, मुक्त सीए 2 के रूप में अच्छी तरह से। क्योंकि उपाय "विरूपण साक्ष्य" या जमावट के अनियंत्रित सक्रियण जितना संभव हो उतना ही लिया जाना चाहिए रोकने के लिए इन शर्तों के तहत रक्तस्तम्भन के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना, जटिल है। कस्टम बनाया हार्डवेयर 19, 20, जो पर्याप्त अंतर-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता का कारण बनता है 5 इसके अलावा, कई विशेष अनुसंधान समूहों का उपयोग करें। इस दृष्टिकोण की विशिष्ट सीमाओं आयताकार वाहिकाओं, गैर गुणवाला प्रवाह प्रोफाइल, और गैर मानव सतह कोटिंग्स 5 का उपयोग कर रहे हैं। परख हम यहाँ वर्णन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है और इसलिए मानकीकरण के लिए उपयुक्त हो सकता है।

क्योंकि जमावट झरना प्रतिक्रिया आसानी से एक बार रक्त मानव शरीर के भीतर निहित नहीं है सक्रिय होता है, नियंत्रित पुनर्खटीकरण एक निर्णायक कदम है। टीओ इस लक्ष्य को हासिल, सीए के अलावा 2 + स्थगित किया जा करने की जरूरत है तो बस प्रतिक्रियाशील कोलेजन सतह पर छिड़काव करने से पहले, क्योंकि जब सीए 2 बफर स्थिर रक्त के लिए थोक में आपूर्ति की जाती है, जमावट अनिवार्य रूप से जगह लेता है, अंत में ट्यूबिंग clogging और डेटा biasing व्याख्या (डेटा) नहीं दिखाया। इस समस्या के समाधान के लिए अलग से सीए 2 बफर और रक्त पंप करने, विश्लेषण चैम्बर के लिए अपने रास्ते पर छिड़काव के दौरान संवहनी और वाचाल बलों द्वारा मिश्रण के लिए अनुमति देता है। पूरा मिश्रण मिश्रण और विश्लेषण कक्षों के बीच टयूबिंग की एक 46 सेमी क्षेत्र में हासिल की है। इस्तेमाल किया प्रवाह दर पर छिड़काव के दौरान बड़े पैमाने पर और संवहनी परिवहन 21 के मौलिक कानून (1000 एस -1) पर आधारित मिश्रण करने के लिए यह लंबाई अभिकर्मकों का इष्टतम समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए गणना की गई। इस दृष्टिकोण से चलाया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साबित कर दिया।

जमावट के संपर्क सक्रियण कभी कभी साधारण के एक विरूपण साक्ष्य के रूप में देखा जाता हैरक्त नमूने और जब थक्के बार की व्याख्या को टाला जा सकता। इसलिए, हम प्रदर्शन किया है कि, अवरोधकों के अभाव में, संपर्क प्रेरित जमावट छिड़काव के 16.7 मिनट (± 3.7 मिनट) में शुरू होता है। सीटीआई की उपस्थिति FXIIa की मध्यस्थता संपर्क सक्रियण को बाधित करने के लिए, जमावट प्रयोग (30 मिनट) का मनमाने ढंग से परिभाषित पाठ्यक्रम के दौरान शुरू नहीं किया गया है। प्रयोग के इस विंडो को पर्याप्त रूप से नमूने है कि समर्थक या antithrombotic हैं विचार करने के लिए लंबा है। हालांकि संपर्क सक्रियण द्वारा जमावट रक्त कृत्रिम सतहों से संपर्क करने का एक अवांछित परिणाम हो सकते हैं, हमारे डेटा प्लेटलेट्स की एक स्पष्ट जैविक खुराक प्रभाव प्रदर्शित करता है। इस ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, क्योंकि FXII पर हाल के निष्कर्षों, प्लेटलेट polyphosphates 10, phosphatidylserine वितरण 22, और प्लेटलेट microparticles 23 वास्तव में करने के लिए रक्तस्तम्भन, ई एक महत्वपूर्ण योगदान के रूप में संपर्क मार्ग जमावट पुनर्मूल्यांकन हैविशेष रूप से थ्रोम्बोसिस 24 के संदर्भ में। उदाहरण के लिए, रोगियों में प्लेटलेट चढ़ाने की चर उपज या बैंकिंग प्लेटलेट्स की चर phosphatidylserine अभिव्यक्ति इस प्रकार चिकित्सीय प्रभावकारिता में परिवर्तनशीलता के लिए प्रेरित करता है, तो सफल जमावट इन कारकों पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है सकते हैं।

द्वारा कोलेजन, बाह्य जमावट मार्ग, या टीएफ मार्ग के साथ सह-immobilizing lipidated rhTF, कोलेजन पर प्लेटलेट बयान के दौरान सक्रिय है। यह इसकी सबसे व्यापक मोड के लिए परख फैली चोटों कि टीएफ असर कोशिकाओं और ऊतकों के साथ संपर्क में खून लाने के लिए एक मॉडल के रूप में। हमारे डेटा है कि कोलेजन और TF के सह स्थिरीकरण जमावट शुरू होने के पल कम हो जाती है, लेकिन जमावट की दर में परिवर्तन नहीं करता दिखा। ध्यान से, rhTF की राशि की सतह के लिए स्थिर इस मॉडल 25, 26 में एक महत्वपूर्ण चर रहा है और एक निश्चित अध्ययन के भीतर मानकीकृत किया जाना चाहिए। presen मेंसीटीआई के सीई, TF मार्ग विशेष रूप से अध्ययन किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया है) क्योंकि संपर्क सक्रियण रोका है।

अंत में, हमारे प्रयोगात्मक सेटअप बैंकिंग प्लेटलेट्स के साथ thrombocytopenic रक्त के पुनर्गठन और कैल्शियम पर निर्भर प्लेटलेट बयान और आतंच गठन के द्वारा रक्तस्तम्भन का एक मॉडल hydrodynamic प्रवाह के तहत द्वारा आधान की एक मॉडल को जोड़ती है। इस परख बैंकिंग प्लेटलेट्स की प्रोकोगुलैंट प्रकृति पर सवालों के जवाब देने में इस्तेमाल किया जाएगा और प्रभाव प्लेटलेट ध्यान केंद्रित तैयार करने की तकनीक इस पर लोगों की है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध अनुसंधान और बेल्जियम के रेड क्रॉस-फ़्लैंडर्स रक्त सेवा के विकास के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। गेन्ट विश्वविद्यालय से साथ अनुबंध संख्या BOF30290744 परियोजना के लिए दी - हम "Bijzonder onderzoeksfond" (विशेष अनुसंधान निधि बीओएफ) द्वारा प्रदान की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

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References

  1. Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
  2. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
  3. Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
  4. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
  5. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
  6. Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).
  7. Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
  8. Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
  9. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
  10. Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
  11. Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
  12. Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).
  13. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
  14. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
  15. Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
  16. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  17. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
  18. Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
  19. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
  20. Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
  21. Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
  22. Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
  23. Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
  24. Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
  25. Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
  26. Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).

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प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन और Hemostasis के लिए एक microfluidic फ्लो चैंबर मॉडल प्लेटलेट बयान और वास्तविक समय में आतंच गठन के उपाय
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Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst,… More

Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

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