Abstract
虚血性心疾患（IHD）、または急性冠症候群（ACS）は、米国における主要な死亡原因の一つです。 IHDは、酸素の損失および心筋のその後の壊死をもたらす、心臓への血液供給の減少によって特徴付けられます。 MIモデルは、短期虚血再灌流モデルと長期永久結紮モデルとしての使用のために人気を博しています。以下では、LADの永久的な連結のために信頼性の高い方法を説明します。マウス遺伝子工学技術により、より高度になってきて、そして品質ネズミ手術器具の増加可用性と、マウスがMIの手術のための人気モデルとなっています。私たちの外科的モデルは、マウスの急速な回復のために容易に可逆麻酔薬の使用を組み込みました。気管切開を伴うことなく、低侵襲性の気管内挿管。胸部内の追加の切開を作成せずに、元の開胸サイトから胸腔穿刺は、そのまま効果的に胸腔から過剰な血液および空気を除去するために、いくつかの他の方法で行います。この方法は、比較的劇的に外科的および術後合併症及び死亡率を低減し、再現性を向上させる他の方法、より低侵襲性です。
Introduction
冠動脈疾患、またはACSは、最も一般的な心血管イベントであり、2020年1で、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因とみなされます。 ACSの原因は、心臓組織2への血流を減少させ、ブロックまたは冠動脈アテローム性動脈硬化性プラークの破裂による心筋の血栓症の存在です。したがって、例えば心筋梗塞（MI）3、4のような急性心筋虚血の存在と一致する臨床徴候があります。 MIは、心筋細胞の質量の損失および心室機能不全と心不全5、6につながる可能病的な心室リモデリング、への進行につながります。
IHDを研究するための最も効果的な方法の1つは、動物モデルにおいて、ヒト心筋梗塞を模倣することでした。これは、LAD内を閉塞することによって達成されますマウス。このモデルを使用して、我々は、心臓がIHDに起因する損傷から保護することができる方法を研究しています。
過去10年間、研究者はマウスにラットからのシフトを含め、より小さな動物に大きな動物モデルを使用してからシフトしています。小さなマウスモデルは、その小さなサイズ、大きなリターサイズ、維持するために、低コスト、及び短い妊娠期間、ならびにトランスジェニックマウスおよび遺伝子ノックアウトモデル7の拡張可用性を含む多くの理由で好ましいことが開始されます。マウスのサイズが小さいですが、特に彼らのために設計された新しい手術器具は、この開発に支援しています。私たちの方法は、これらの新しい手術器具を利用しています。
いくつかの方法は侵襲的気管切開を実施している間、私たちは、気管内挿管の侵襲性の低い方法を使用します。中咽頭のオーバーヘッド照明を使用して、我々はトンのためのより安全でより少ない外傷体験を提供する、任意の切開を作成せずに挿管彼は動物。マウスは、その後、人工呼吸器の上に置き、全体の手順の間、イソフルランで維持されます。それが廃止されると、動物は麻酔から回復するために起因する薬剤によって生成麻酔の短い期間に、それはほんの数分かかります。私たちの外科的モデルは、最小侵襲的胸腔穿刺を含んでいます。緊張性気胸：元の開胸切開を通して胸腔穿刺を用いて胸腔から血液及び過剰空気を注意深く除去は、LAD結紮の一般的な術後合併症に対処しています。他の方法ワン胸腔穿刺-た得少ない術後合併症の気管切開のために、別で使用される2つの追加の切開が不要になり、大幅に死亡率が減少しているこの方法。
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Protocol
この動物プロトコルを見直し、ロードアイランド病院の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
1.麻酔および挿管
- 術後の鎮痛薬の投与量を計算するために、マウスを計量。
- 誘導チャンバ内にマウスを置き、9 4％イソフルランを送達 - を通して動物を監視、10分。装置は、約250℃に予熱することができるようにホットビーズ滅菌器の電源をオンにします。 20分 - 予熱が15になります。
- マウスは麻酔の深い面に達すると、約32呼吸/分の呼吸速度と、発泡スチロール板上にマウス仰向けに配置し、開口を保持するために上部切歯下固定弾性バンドを使用します。つま先のピンチを実行することによって、鎮静を確認します。咽頭を可視化することができるように、マウスの上に高強度の照明を置き。
- 顎別のペアを開くために、湾曲したピンセットを使用し邪魔に舌を持ち上げるために鉗子の。マウスの本体とで、またはわずかアイレベルの下に位置しながら、挿管してください。手術用ルーペの使用が推奨されます。
- 声帯の開閉を可視化します。オープン時、鈍い先端の針の導入と20ゲージ、1で静脈内（IV）カテーテルを挿入します。気管開口部にカテーテルを導くために、針を使用しますが、気管に針を挿入することは避けてください。正しい配置の検証は、プラスチック製のトランスファーピペットを使用して行うことができます。
- 加熱装置を備えた操作面への挿管マウスを転送します。 150μL/ストロークのストローク量および/分130ストロークのストローク速度に設定小さなげっ歯類ベンチレーターにマウスを接続します。
- 2.5％イソフルランを提供します。二国間の胸の上昇を確認することで挿管を確認してください。つま先のピンチを実行することにより、麻酔を確認してください。完全に麻酔をかけになるために、人工呼吸器に10分 - マウスは、5が必要な場合があります。
- 人工呼吸器およびIVカテーテルとの連結現場で挿管チューブダウンテープ。四肢ダウンテープ。目に無菌潤滑滴を置きます。
- 電気かみそりで胸部の腹左側をトリム。乾いたワイプで坊主毛皮をオフにほこりや滅菌綿棒を使用して脱毛クリームの薄い層を適用します。 45秒 - クリームは、約30のための毛包と接触したままにしてください。
- クリームプロセスながら、浸漬するベタジンで満たされた3 1.5 mLチューブ三本の滅菌綿棒を配置します。蒸留水で湿らせたワイプを使用して、そっとクリームや毛皮を乾いた布で拭き取ってください。
- 中心部から周辺部に移動する円を描くように洗浄、ベタジンおよび滅菌70％イソプロパノールプレップパッドを交互に、手術野を3回洗浄してください。マウスの手術野の上四分の一サイズの孔を滅菌ドレープを配置します。
- 覚書の周囲を清掃してください70％エタノールでE。つま先のピンチでもう一度麻酔を確認してください。
3. LADライゲーション
- 約20秒間250℃に予熱したホットビーズ滅菌器でオートクレーブ処理手術器具を置きます。滅菌オートクレーブ滅菌外科用ドレープの滅菌器を置きます。ドン手術用手袋。
- 優しく著名な剣状軟骨の左にある時点で約5mmの皮膚を持ち上げるために先の細いピンセットを使用してください。胸骨柄のレベルまで、上方この点から、皮膚に垂直切開部を作成するために、10番ブレードを用いて外科用メスを使用します。
- 優しく皮膚や筋肉層を分離するために、湾曲鉗子を使用してください。皮膚切開以下、筋層を開きます。 、筋層を介して2本の5-0ポリプロピレン縫合糸を挿入し、切開部の両側に、筋層のオープンを保持するためのクランプで一時的に縫合糸を固定します。
- 以下、第三肋間の切開を特定して作ります胸郭の自然な角度。マウスの左末端からテープを取り外し、テープでその右後足にその左リアの足を確保します。テープの長い部分をカットし、少し高い位置に操作面にその左前足を固定します。 70％エタノールで手袋を清掃してください。
- 穏やかに3 番目と4 番目の肋骨を広げ開創器を使用。約1×½に、滅菌ガーゼの小さな部分を切断し、滅菌0.9％生理食塩水の中に浸し。余分な生理食塩水を絞り出し、ゆっくりと手続きの際に偶発肺の損傷を防ぐために、左肺に対してガーゼを挿入するために鉗子を使用しています。
- 静かにピンセットで薄い心膜を削除します。
- 滅菌綿棒オフ綿の少量を引き裂く、小さなボールにそれをロールバックします。滅菌0.9％生理食塩水の中に、この綿球を浸し、軽く動脈を鑑賞する心臓の表面上の綿棒。そっと上向きに左心耳を押すと下の冠状動脈を見つけますニースの。
- LADを識別し、LAD下で8-0ナイロン縫合糸を通過させます。 2つの完全なライゲーションを確保するためにスローされます。リガチャー意志湯通しから連結が成功した場合、左心室遠位。
- 鉗子を使用して、以前に挿入されたガーゼを除去し、そして次に穏やか開創器を取り外します。開胸開口を通して胸腔内に25ゲージ針に取り付けられた6で、25ゲージ可撓性チューブを挿入します。左肺の上の空間にチューブの2 - 約1進みます。仰臥位にマウスを戻し、70％エタノールで手袋をきれいに。
- 場所に胸腔チューブを保ち、胸郭を閉じるために、単純な、中断パターンで5-0ポリプロピレン縫合糸を使用してください。オープン筋層を保持している2本の縫合糸を外します。再び場所に胸腔チューブを保ち、筋層を閉じるには、単純な連続パターンに5-0ポリプロピレン縫合糸を使用してください。
- 胸管に25ゲージ針を1 mLシリンジを取り付けます。ゆっくりプランジに上向きに引っ張りますR同時に徐々に鉗子で胸腔から胸管を抽出します。このステップは、そうでない場合は気胸で胸腔と結果の中に閉じ込めなる過剰空気と血液を、削除して、ゆっくりとチューブを抽出します。
- 注射器がいっぱいになると、針から注射器を取り外し、廃棄物のビーカーや流しに廃棄物を処分します。胸の管が完全に抽出されるまで、このプロセスを続行します。胸が密閉されていることを確認してください。
- 1.5％のイソフルランを減らします。シンプル中断したパターンで4-0ポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。オフイソフルラン気化器の電源を入れます。
- 腹腔内（IP）注射により、0.9％生理食塩水に0.1mg / mlのブプレノルフィンを投与します。局所的切開に0.9％生理食塩水中の2mg / mLのブピバカインとの2mg / mLのリドカインを適用します。マウスの体重に生理食塩水の量をスケーリング、皮下注射を介して、0.9％の生理食塩水500μL - 200の間に投与します。
- admini後5分を待って挿管チューブからマウスを削除するために鎮痛薬をstering。これは、人工呼吸器オフ遷移を助けます。
- マウスが人工呼吸器をオフに一度、二国間の胸の上昇を持っていない場合は、針の解凍を行います。それは抵抗の急激な減少によって示される、胸腔に入るまでこれを行うには、3 番目と4 番目のリブの間に25ゲージの滅菌針および1 mLの注射器を導入します。過剰の空気を除去するために、プランジャーをゆっくりと引き上げます。
- マウスは、適切な二国間の呼吸数と深さを実証し、つま先のピンチに応答すると、加熱ランプの下でクリーンな回復ケージにマウスを置きます。 20分 - 15のための層流フード内で監視、湿った食物および水ボトルでマウスを提供します。誇張された呼吸努力、過度の出血、または他の潜在的に生命を脅かす合併症のために監視します。
- 次の3日間でIPを介して、0.1mg / mlのブプレノルフィンの鎮痛薬を投与しますjection一日二回。毎日マウスを監視します。
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Representative Results
マウスは28日、手術後安楽死させ、心臓を回収し、検討されています。 75ミリグラム/ kgのケタミン及び5 - - 10mg / kgのキシラジンマウスを50で麻酔します。動物が適切麻酔下にある場合、胸腔を開き、23ゲージ針を使用して、コールド塩化カリウム（KCL、30mMの）は、心臓の後方基底領域に注入されます。心臓は拡張期で逮捕されました。ライゲーションのさらなる検証のために、心臓を動物から除去され、4％パラホルムアルデヒド及び1％エバンスブルー色素を注射します。 図1は、虚血性左心室におけるエバンスブルーの欠如を示しています。 図2は、適切な気管内挿管のセットアップを示しています。縫合筋層Cからの空気抽出前に管の周囲に閉じた状態で、図3は 、初期切開部位に胸腔穿刺のための胸腔チューブの配置を表示しますHEST空洞。トリクローム染色は、梗塞領域におけるコラーゲンの増加（ 図4）を示します。
図1：エバンスブルーインジェクション。エバンスブルー注射は、左心室梗塞領域に局在し、虚血組織における色素の欠如を、明らかにしました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：気管内挿管。適切な気管内挿管のセットアップのデモンストレーション。手術用ルーペを身に着けているオペレータは、マウスを使って眼レベルで着座しています。高輝度照明器は、Oをtransilluminating、気管領域に下向きに集束されますropharynx。弾性バンドは、オペレータは、湾曲鉗子で口を開くことができるように、上顎切歯の背後に引っ掛けられます。曲がった鉗子は、明確な可視化のための側に舌を保持するために使用されています。声帯の開閉が可視化されている間鈍い先端の針の導入と静脈カテーテル挿管カニューレは若干上向きの角度で進められます。声帯が挿管を試みる前に開閉の可視化は、成功した挿管のための重要なポイントの一つです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：胸腔穿刺。オリジナルの切開部位に挿入し、胸腔穿刺に使用胸腔チューブの配置、。筋層を縫合している周りの閉じました胸腔内の空気の前にチューブをシリンジで抽出し、次いで胸部チューブを除去します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：トリクローム染色。左パネル：コントロール、非LAD結紮の心臓。右パネル：LAD結紮、梗塞を起こした心。ビーブリッヒスカーレット酸フクシン溶液、リン/リン酸溶液、アニリンブルーを用いたトリクローム染色（マッソン）は、クロス切断左心室梗塞領域における線維症のマーカーとして増加したコラーゲン（青色）を明らかにする。バー= 500μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
実験室におけるMIモデルの使用が増加して、記載された手順は、その手術後の痛みや不快感を最小限に抑えながらマウスの効率および生存率を高めることを目的とします。このプロトコルは、LAD結紮法のさまざまな側面に多くの改良を行うことで、死亡率を最小限にするよう努めています。いくつかの区別があります。麻酔の彼らの長い期間の利益のために、誘導のためのイソフルランと一緒にケタミンとキシラジンを利用いくつかのマウス挿管研究では、死亡率の増加8を示しています。私たちの方法は大幅に薬物関連の合併症の可能性を低減、誘導のためだけイソフルランを使用しています。他の同様のLAD結紮プロトコルは、長期の回復時間と正確なトレーニング9のための増加の必要性を生産、気管切開を含んでいます。私たちはここで説明する手順は、LOで、その結果、気管内挿管の非侵襲的な方法を利用して死亡率と結果の高い再現性をWER。また、むしろのみ電気かみそりを使用するよりも、私たちの手順は、1分未満で滅菌野の完全明確な可視化を提供し、毛皮の除去のための脱毛クリームを使用しています。
もう一つの重要な違いは、前ではなく、最初の切開後に発生したマウスの再配置、です。マウスを仰向けである切開部を作ること、したがって結果の高い再現性が得られ、例えば剣状突起軟骨などのランドマークのより直接的かつ正確な可視化を可能にします。私たちの方法はまた、医原性火傷、感染の危険性を減少、滅菌綿棒ではなく、管理の出血のためcauterを使用しています。別にこれらの違いから、胸腔穿刺のための胸腔チューブ挿入は、我々の方法は、チューブのための新しい切開部を作成伴わないとして、特に注目すべきです。むしろ、それは再び、前切開部にチューブを挿入減少含むMORtality。我々はまた、記述の手順は、（1）開創器の使用、冠状動脈のより正確で安定した可視化を可能にします。 （2）手順中に胸腔に滅菌ガーゼを挿入し、それによって、医原性肺損傷の危険性を低減します。そして、の両方に示されている手順は、次の生理食塩水（3）投与は、回復時間を短縮し、低体温を防止します。
我々は永久結紮モデルを説明しているが、この手順はまた、急性心筋梗塞モデル用に変更することができます。心臓組織7における再灌流に続く虚血60分間-また、虚血および再灌流として記載急性MIモデルは、30を指します。虚血および再灌流後のリスクのある梗塞サイズ又は面積を評価する別の方法は、2％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）10の染色です。 TTC染色は、虚血発作後に生存組織を染色する能力に基づいています心臓組織に存在するデヒドロゲナーゼによる。これらの酵素は、それによって梗塞領域11の輪郭を描く、不溶性の赤色成分に可溶性の成分を変換します。急性MIモデルはヒトの心臓病で発生メカニズムを模倣することができ、したがって、心筋虚血10のイベントを解明するための有用なツールであり得ます。 LAD結紮は、MIを誘導する、この方法のための利点を提供し、組織の色の即時の変化を観察することによって確認することができます。これは、高価な機器の使用を伴い、すべてのラボのために実行可能ではないかもしれないが、成功したライゲーションをチェックする別の方法は、心電図の使用です。
前述したように、心を収穫した後、ライゲーションを確認するには、いくつかの簡単かつ手頃な価格の分子技術があります。上に示した2つの技術がエバンスブルー染色およびトリクローム染色されています。エバンスブルー色素が直接AOのアーチに注入されます血流の欠如が存在する場所を示すRTA、。これは、モデルが成功したと冠状動脈閉塞の程度を測定するかどうかをテストするために心を収穫した後、直ちに採用迅速かつ効率的な方法です。トリクローム染色のために、心が区分されている必要があり、その後、免疫組織化学を行いました。トリクローム染色は、虚血後の線維性領域または慢性虚血の影響を受けた心臓の領域を示すことができます。術後のマウス2の注入 - 5-エチニル-2'-デオキシウリジン（のEdU）、チミジンアナログで屠殺前24時間は特ににおいて、虚血後のDNA複製および細胞増殖の領域を示すための有効な方法であります血管再生12を含む研究。
一般に、LAD結紮研究の限界は、心臓不整脈、出血、および気胸の存在によって主に引き起こされる術後死亡の発生率を、含みます。効果的な胸腔穿刺、ウィットハウト（現在の方法に記載の）追加の胸部切開、及び適切な術後ケアは、動物における罹患率および死亡率を避けるために必要です。術後の低体温症の非常に注意深い監視も重要です。現在の方法に記載の（気管切開および胸腔穿刺のための）頸部と胸部切開の数の減少は、生存率を改善するのに役立ちます。本明細書に記載の注射可能な術前麻酔薬の回避はまた、動物の術後回復を改善します。
高い再現性を得るためには、LAD結紮モデルは、厳しい訓練と経験が必要です。オペレータは、再現性の心に希望のサイトで梗塞を行う能力を獲得するために手術の数週間を実行する必要があります。トレーニングと経験が成功したLAD結紮生存手術のための2つの重要な要因です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Intensity Light Source | Harvard Apparatus | 72-0215 | |
| SurgiSuite Operating Platform | Kent Scientific Corporation | SurgiSuite | Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery. |
| SurgiSuite LED Lighting Kit | Kent Scientific Corporation | SURGI-5003 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize. |
| Small Rodent Anesthesia System | VetEquip Inc. | 901810 | |
| Isofluorane | Piramal Enterprises | 66794-017-10 | |
| Buprenorphine | Rhode Island Hospital Pharmacy | NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Surgical Loupes | Roboz | RS-6687 | |
| Small Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Lubricating Drops | Thermo Fisher Scientific | 19-898-350 | |
| Electric Razor | Kent Scientific Corporation | CL 9990-1201 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Medical Tape | Thermo Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| Betadine | Thermo Fisher Scientific | 19-027136 | |
| 70% Isopropanol Wipes | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical Drapes | Braintree | SP-TS | |
| Surgical Gloves | Thermo Fisher Scientific | 18999102D | |
| 5-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8630G | |
| 8-0 Nylon Sutures | Fine Science Tools | 12051-08 | |
| Platinum-Cured Tubing | Harvard Apparatus | 72-1042 | 0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter |
| 0.9% Saline | Thermo Fisher Scientific | 19-310-207 | |
| 4-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8631G | |
| 1 CC Syringe with 25-Gauge Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-100 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INSS600225 | |
| Forceps | Kent Scientific Corporation | INS700100 | |
| Cotton Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| IV Catheter, 20-Gauge | Thermo Fisher Scientific | NC9892181 | |
| Retractor | Kent Scientific Corporation | INS 750369 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Dissecting Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 700101 | |
| Dissecting Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 700103 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 750451 | |
| Hemostatic Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 750452 | |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS 700131 | |
| Needle Holder | Kent Scientific Corporation | INS 600109 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INS 600225 |
References
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