Forebyggelse af human trikinose i mange lande verden over er baseret på laboratorieundersøgelse af muskel prøver fra modtagelige dyr ved fremgangsmåder til spaltning, hvoraf den magnetomrører metoden betragtes som den gyldne standard.
Trikinose er en invaliderende sygdom hos mennesker, og er forårsaget af indtagelse af råt eller utilstrækkeligt kød fra dyr inficeret med nematodelarverne af slægten Trichinella. De vigtigste kilder til infektioner hos mennesker over hele verden er vildt og svinekød eller svinekødsprodukter. I mange lande er forebyggelse af human trikinose baseret på identifikation af inficerede dyr ved hjælp af den kunstige fordøjelse af muskelprøver fra modtagelige døde dyr.
Der er flere metoder baseret på fordøjelsen af kød, men den magnetomrører metoden betragtes som den gyldne standard. Denne metode gør det muligt at påvisning af trikiner larver ved mikroskopi efter enzymatisk nedbrydning af muskel prøver og efterfølgende filtrering og sedimentering trin. Selv om denne fremgangsmåde ikke kræver særlige og dyrt udstyr, kan interne kontroller ikke anvendes. Derfor bør strenge kvalitetsstyring blive applied hele testen. Formålet med nærværende arbejde er at give detaljerede håndtering instruktioner og kritiske kontrolpunkter i metoden analytikere, baseret på erfaringerne fra EU-referencelaboratoriet for parasitter og det nationale referencelaboratorium Tyskland for trikiner.
Kan detekteres nematoder af slægten trikiner i tværstribede muskler af kødædende og omnivore pattedyr, fugle og krybdyr verdensplan. Disse zoonotiske nematoder kan nå mennesker, når rå eller semi-råt kød og afledte produkter fra svin, hest, og vildt indtages. Denne zoonose kan være en alvorlig sygdom hos mennesker er kendetegnet ved patognomonisk tegn og symptomer, fx diarré, feber, periorbitalt ødem og muskelsmerter og mulige komplikationer såsom myocarditis, tromboembolisk sygdom og hjernebetændelse en.
Trikiner spiralis er den mest udbredte ætiologiske agent trikiner infektion i vilde og tamme dyr og forårsager de fleste af de humane infektioner på verdensplan. I Europa, Nord- og Vestafrika, og vestlige Asien, Trichinella britovi er en anden kilde til infektioner hos mennesker. Desuden er ti andre systematiske enheder rapporteret så ofte som det forårsagende agenter for sygdom hos mennesker og findes i forskellige regioner i verden, som regel i vilde dyr 2. Ud over vilde dyr som vildsvin, bjørne, hvalrosser og grævlinger, svinekød er den vigtigste kilde til infektion hos mennesker over hele verden.
Den bedste måde at forhindre trikinose er at afstå fra at spise rå kødprodukter og at tilberede kød, især vildt til sikre temperaturer (> 65 ° C i 1 min, dvs. at ændre kødet farve fra lyserød til brun i kernen af kødprodukt) 3. Den Europæiske Union og USDA har specificeret fryse- og madlavning tider og temperaturer for svinekødsprodukter, der kan bruges til at dræbe T. spiralis larver i kød 4, 5. Endvidere blev anbefalinger for inaktivering af trikiner i kød og kødprodukter offentliggjort af International Commission on Trikinose"xref"> 6. I Europa, ud over indførelsen af kontrollerede opstaldningsforhold i kommercielle svinebesætninger, hvor risikoen for trikiner infektion er ubetydelig, er forebyggelse af menneskelige trikinose bygger på laboratorieundersøgelse af muskel prøver fra modtagelige dyr 4.
For fødevarer sikkerhedshensyn, fordøjelse analyser er de eneste pålidelige procedurer for direkte påvisning af trikiner larver i kød 3, 7. Selv om der er flere variationer af fordøjelsen assay magnetomrøreren metode er den internationalt anerkendte referencemetode 3, 4, 7. Denne analyse er baseret på påvisning af trikiner larver i tværstribede muskelvæv. Efter den enzymatiske fordøjelse af muskelprøver og efterfølgende filtrering og sedimentering trin, Trichinella larver identificeres ved mikroskopi. Afhængig af handels- forpligtelser og national lovgivning, er der et væld af små variationer i den almindelige protokol af magnetomrører metoden. Her er tekniske detaljer baseret på EU-kravene 4, ISO specifikationer 8, ikt retningslinjer 6, og erfaringer fra EU-referencelaboratoriet for parasitter (EURLP) og den tyske referencelaboratorium for trikiner.
Selvom den magnetomrører metode kan let udføres, ikke nøje overholdt tekniske detaljer fører til utilstrækkelig følsomhed, således forbrugernes sundhed bringes i fare. De kritiske kontrolpunkter er blevet fremhævet i ovenstående tekst. Hertil kommer, at brugen af passende udstyr er afgørende for det vellykkede resultat af testen. Alle fartøjer skal være lavet af glas og pipettespidser overtrukket med silicium for at reducere vedhæftning af larver til overfladen.
Følsomheden af fordøjelsen metode afhænger larve tæthed i musklerne og mængden af muskelprøve testes. For en larve tæthed af 3 – 5 lpg af muskelvæv blev en følsomhed på 100% rapporteret, men under 1 lpg følsomheden faldet til 40% 13. Afhængigt af de testede værtsdyrearter kan følsomheden af testen forbedres ved at forøge mængden af anvendte prøve. Den infection byrde i dyreliv er normalt lav, derfor større prøvestørrelserne bruges 14. Steder, parasitterne typisk også variere blandt værtsdyr. Her er den nedre fordøjelighed af muskelafslappende væv, såsom tungen skal tages i betragtning, som også kan resultere i større stikprøvestørrelser 15.
Endvidere er det vigtigt at forstå, at magnetomrører fremgangsmåden ikke omfatter interne kontroller. Derfor kvalitetssikring ledelse fra prøvetagning til dokumentation er afgørende for at opnå nøjagtige og præcise resultater. Kvaliteten af laboratoriernes præstationer til påvisning af trikiner larver i muskel prøver bør overvåges ved regelmæssig deltagelse af hver analytiker i præstationsprøvninger.
Yderligere begrænsninger for fremgangsmåden er, at den endelige identifikation fase af muskel larver ved mikroskopi er meget subjektiv og heavily afhængig af viden om larvernes morfologi ved at undersøge analytiker.
Et interessant alternativ metode til at omgå dette problem er den magnetomrører metoden / om filter isolation efterfulgt af larver påvisning af en latex agglutination. Men ifølge EU-lovgivningen denne metode kun betragtes som svarende til afprøvning af kød af tamsvin, men ikke for dyr, der har større risiko for infektion, såsom vildsvin 4. Identifikationen af larve antigen med monoklonale antistoffer gør testen mere objektiv, men benægter laboratoriet mulighed for at bestemme antallet af larver per gram kød 16.
Yderligere varianter af magnetomrører metoden omfatter mekanisk bistået samleprøve fordøjelse metode / sedimentering teknik, den mekanisk bistået samleprøve gravekombination af ovenstående metode / om filter isolation teknik, og den automatiske fordøjelse til undersøgelse af samleprøver på op til 35 g teknik. Disse teknikker er alle baseret på den kunstige fordøjelse af kød og visualiseringen og optællingen af Trichinella larver, men adskiller sig i det anvendte udstyr til filtrering og sedimentation trin.
Den isolerede larver kan yderligere identificeres på artsniveau ved en molekylær test (f.eks multiplex PCR) 17. Ifølge EU-lovgivningen skal alle positive prøver sendes til det nationale referencelaboratorium eller EURLP til artsbestemmelse af trikiner.
The authors have nothing to disclose.
Vi venligt takker Sabine Reckinger for fremragende teknisk bistand og støtte.
Knife,Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
Blender | With a sharp chopping blade | ||
Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 litres, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation | ||
Stands, rings and clamps | |||
Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
Glass beaker | Capacity 3 litres | ||
Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 ml, or centrifuge tube | ||
Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
25 % hydrochloric acid | |||
Pepsin | Strength: 1:10 000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/ml | ||
Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
Metal tray | Capacity 10 to 15 litres, to collect the remaining digestive juice | ||
Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 ml) | ||
Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 ° C | ||
Siphon | For tap water |