Summary
La prevención de la triquinelosis humana en muchos países en todo el mundo se basa en el examen de laboratorio de muestras de músculo de animales susceptibles por métodos de la digestión, de los cuales el método de agitador magnético se considera el estándar de oro.
Abstract
La triquinosis es una enfermedad debilitante en seres humanos y es causada por el consumo de carne cruda o mal cocida de animales infectados con el larvas de nematodos del género Trichinella. Las fuentes más importantes de infecciones humanas en todo el mundo son las carnes de caza y de cerdo o productos de cerdo. En muchos países, la prevención de la triquinelosis humana se basa en la identificación de los animales infectados a través de la digestión artificial de muestras de músculo de los cadáveres de animales susceptibles.
Hay varios métodos basados en la digestión de la carne, pero el método de agitación magnética se considera el estándar de oro. Este método permite la detección de larvas de Trichinella por microscopía después de la digestión enzimática de las muestras de músculo y las subsiguientes etapas de filtración y sedimentación. Aunque este método no requiere un equipo especial y caro, los controles internos no pueden ser utilizados. Por lo tanto, la gestión de calidad riguroso debe Apld durante toda la prueba. El objetivo del presente trabajo es proporcionar instrucciones de manejo detallados y puntos de control críticos del método de los analistas, basado en la experiencia del laboratorio de referencia de la Unión Europea para los parásitos y el Laboratorio Nacional de Referencia de Alemania por Trichinella.
Introduction
Los nematodos del género Trichinella se pueden detectar en los músculos estriados de carnívoros y omnívoros mamíferos, aves y reptiles de todo el mundo. Estos nematodos zoonóticas pueden llegar a los seres humanos cuando la carne cruda o semi-cruda y productos cárnicos derivados de cerdos, caballos y animales de caza se ingiere. Esta zoonosis puede ser una enfermedad grave en los seres humanos que se caracterizan por signos y síntomas patognomónicos, por ejemplo, diarrea, fiebre, edema periorbital y mialgias y las posibles complicaciones como la miocarditis, enfermedad tromboembólica y encefalitis 1.
Trichinella spiralis es el agente etiológico más común de infección por Trichinella en animales salvajes y domésticos, y hace que la mayor parte de las infecciones en seres humanos en todo el mundo. En Europa, Norte y Oeste de África y Asia occidental, Trichinella britovi es otra fuente de infecciones humanas. Además, otros diez taxones se presentan con menos frecuencia como el causante Los agentes de la enfermedad humana y se encuentran en diferentes regiones del mundo, por lo general en los animales salvajes 2. Además de los animales silvestres como jabalíes, osos, morsas y tejones, cerdo representa la fuente más importante de infección humana en todo el mundo.
La mejor manera de prevenir la triquinelosis es abstenerse de comer productos cárnicos crudos y cocinar cualquier carne, especialmente la carne de caza a temperaturas seguras (> 65 ° C durante 1 min, es decir, para cambiar el color de la carne de rosa a marrón en el núcleo de la producto de carne) 3. La Unión Europea y el USDA han determinado los tiempos y las temperaturas de congelación y de cocción para los productos de carne de cerdo que se pueden utilizar para matar las larvas de T. spiralis en la carne 4, 5. Por otra parte, las recomendaciones para la inactivación de Trichinella en la carne y productos cárnicos fueron publicados por la Comisión Internacional de Triquinosis"xref"> 6. En Europa, además de la introducción de las condiciones de alojamiento controladas en piaras comerciales donde el riesgo de infección por Trichinella es insignificante, la prevención de la triquinelosis humana se basa en el examen de laboratorio de muestras de músculo de animales susceptibles 4.
Por razones de seguridad alimentaria, pruebas de digestión son los únicos procedimientos fiables para la detección directa de las larvas de Trichinella en la carne 3, 7. Incluso si hay varias variaciones del ensayo de la digestión, el método de agitación magnética es el método aceptado internacionalmente de referencia 3, 4, 7. Este ensayo se basa en la detección de las larvas de Trichinella en los tejidos musculares estriadas. Después de la digestión enzimática de las muestras de músculo y las subsiguientes etapas de filtración y sedimentación, Trilarvas de Trichinella son identificados por microscopía. En función de las obligaciones comerciales y la legislación nacional, hay una multitud de pequeñas variaciones en el protocolo general del método agitador magnético. Aquí, los detalles técnicos se basan en los requisitos de la UE 4, las especificaciones ISO 8, directrices TIC 6, y la experiencia del laboratorio de referencia de la Unión Europea para los parásitos (EURLP) y el Laboratorio de Referencia para la Trichinella alemán.
Protocol
1. Preparativos
- Coleccion de muestra
Nota: El método agitador magnético se puede utilizar para muestras de músculo individuales o agrupados.- Recoger muestras de los sitios de predilección apropiados y en una cantidad apropiada 9. Consulte los requisitos del país o de las recomendaciones de las TIC, la OIE o ISO.
- Para la Unión Europea, por ejemplo, tomar una muestra de 1 g de un pilar del diafragma en la transición hacia la parte tendinosa de los cerdos domésticos. Asegúrese de que todas las muestras de músculo están libres de toda la grasa y la fascia.
- Si la lengua se prueba, retirar la capa superficial antes de la prueba.
- Tenga cuidado si se congelan las muestras, ya que la mayoría larvas de Trichinella no se congele resistentes y desenrollar después de la muerte, son menos resistentes a la digestión y tienden a pegarse a las paredes del recipiente, lo que disminuyó la sensibilidad del ensayo.
Nota: Si se congela, el doble del tamaño de la muestra en leste y aumentar el tiempo de sedimentación (ver abajo).
- Recoger muestras de los sitios de predilección apropiados y en una cantidad apropiada 9. Consulte los requisitos del país o de las recomendaciones de las TIC, la OIE o ISO.
- Preparación de la solución de digestión
- Añadir 25% de HCl (16 ± 0,5 ml) a 2 L de agua del grifo precalentado a 46-48 ° C en un vaso de vidrio de 3 l. Demasiado bajo una temperatura de resultados en la digestión incompleta; demasiado alto de una temperatura desactiva las propiedades enzimáticas de la pepsina.
- Colocar una varilla de agitación en el vaso de precipitados, y se agita la solución en un plato precalentado (46-48 ° C).
- Añadir 10 ± 0,2 g de pepsina (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP) a la solución ácida.
Nota: La calidad de la pepsina es de la actividad enzimática máxima importancia y deben ser certificados por el productor. Por razones de seguridad del laboratorio y para mantener la actividad de la pepsina, la secuencia de adición de los componentes de la solución de digestión se debe respetar.
- Preparación de la muestra del músculo
- Picar hasta 100 g de muestras de músculo en una licuadora o molinillo. Para facilitar Blending, añadir 2 ml de agua precalentada a las muestras y se mezclan a velocidad máxima durante 2 - 3 s.
- Antes de la segunda mezcla, abrir la licuadora y transferir cualquier muestra de músculo en la parte superior del margen del borde tazón de fusión a la parte inferior y la repetición de mezcla. Continuar mezclando con ráfagas de 2 - 3 s hasta que no haya fragmentos visibles de carne se mantienen.
Nota: Demasiado poco de mezcla puede dar lugar a una digestión incompleta, mientras que un exceso de mezcla puede dañar las larvas de Trichinella presentes en las muestras 6.
2. Procedimiento
- Digestión de la muestra de músculo
- Transferir 1 L del líquido de digestión en un cilindro. La transferencia de la carne de tierra en el vaso y difundir en el líquido de digestión con una cuchara o un tenedor. Enjuague bien el recipiente tapa de la licuadora, la cuchilla y la licuadora con 500 ml del líquido de digestión precalentado en el vaso de precipitados de 3 l.
Nota: enjuague incompleto puede resultar en la pérdida de sensitivity. - Cubrir el vaso con papel de aluminio y mantener una temperatura constante de 44-46 ° C y controlar con un termómetro.
- Agitar el líquido de digestión durante 30 min para crear un vórtice profundo sin salpicaduras hasta que las partículas de carne desaparecen. Dependiendo del tipo de carne probado (por ejemplo, carne de animales salvajes), aumentar el tiempo de digestión hasta un máximo de 60 min.
- Transferir 1 L del líquido de digestión en un cilindro. La transferencia de la carne de tierra en el vaso y difundir en el líquido de digestión con una cuchara o un tenedor. Enjuague bien el recipiente tapa de la licuadora, la cuchilla y la licuadora con 500 ml del líquido de digestión precalentado en el vaso de precipitados de 3 l.
- La filtración y sedimentación del líquido de digestión
- Para determinar la cantidad de tejido sin digerir, ajustar la escala a cero, pesar el tamiz antes de su uso, y tenga en cuenta su peso. El tamiz debe estar limpia y libre de cualquier partículas de tejido, lo que podría dificultar las larvas de Trichinella llegar al embudo de separación. Compruebe que el embudo de separación está nivelado verticalmente.
- Después de la digestión, con cuidado vierta el líquido de digestión a través de un tamiz de 180 micras en un embudo de vidrio de separación. La anchura de la embudo de vidrio de separación no debe be mayor que 55% de la longitud para permitir una buena sedimentación larva. Tenga cuidado para evitar cualquier desbordamiento.
- Para evitar la pérdida de la sensibilidad, enjuague bien el vaso de vidrio y el tamiz con aproximadamente 200 ml de agua del grifo de una botella de lavado de aterrizaje y trasladar el agua de enjuague al embudo de vidrio sedimentación. Tenga cuidado de enjuagar cuidadosamente los bordes del vaso de precipitados de 3 l. Levantar el tamiz y enjuague el área bajo el tamiz de fondo.
- Determinación de la cantidad de tejido sin digerir
Nota: debido a errores en la ejecución del método, el tejido muscular puede permanecer en el tamiz, como fascia bien y el tejido conectivo que son indigeribles. La cantidad de tejido no digerido se determina durante la primera etapa de sedimentación 10 min (ver 2.5). Esto permite aproximadamente 30 min para el tamiz se seque, ya que el agua residual puede influir en el peso determinado del tejido no digerido.- Coloque una toalla de papel en una escala, y pesar el tamiz con los undigestejidos TED.
- Restar el peso del tamiz antes de la filtración a partir del peso del tamiz con tejidos no digeridos. El proceso de digestión se considera satisfactorio si no más de 5% del peso de la muestra de partida permanece en el tamiz (es decir, 5 g / 100 g de material de partida).
- Si la cantidad de tejido no digerido es superior al 5%, repita la prueba con muestras de músculo fresco. Si el tejido restante se compone predominantemente de tejido muscular sin digerir y muestras frescas no están disponibles, digerir los restos no digeridos de nuevo y examinar además de las muestras originales.
- La sedimentación del líquido de digestión
- Mantener el líquido de digestión se filtró en el embudo de separación durante 30 minutos. Si se deja sin tocar, las larvas de Trichinella se depositan en el fondo del embudo.
- Si se utilizan muestras congeladas, aumentar el tiempo de sedimentación a un máximo de 60 min.
- Una vez que se haya completado la sedimentación, abra completamente la llave de pasodel embudo de separación para permitir que al menos 40 ml de líquido de digestión rápida escorrentía en un vaso de precipitados (80 ml si las muestras musculares habían sido previamente congelado).
- En primer lugar, dejar que un medio del fluido en el cilindro y abra completamente la llave de paso en la dirección opuesta para permitir que 10 ml de líquido de digestión a pasar. Por último, abrir la llave de paso en la dirección opuesta por otros 10 mL. Este procedimiento garantiza que las larvas de Trichinella no se encuentran atrapados en la llave de paso.
Nota: Se necesita una velocidad suficiente para evitar las larvas que queda en el embudo de separación, la disminución de la sensibilidad.
- La sedimentación de el líquido de digestión en el cilindro
- Deja el sedimento en el cilindro durante 10 minutos para permitir que las larvas a los sedimentos. Eliminar 30 ml de sobrenadante por aspiración con una pipeta sin perturbar el sedimento 10 ml.
- Para reducir la cantidad de fibras de tejido en la muestra, añadir 30 ml de agua corriente en el sedimento y se deja durante otros 10 men. Repita hasta que el líquido es claro.
- Aspirar el sobrenadante y transferir los 10 ml de sedimento se lavó con una placa de Petri cuadriculada o cubeta para el cómputo de larvas. Enjuague el cilindro con 10 ml de agua corriente y luego añadir el agua a la muestra.
Nota: Como grandes cantidades de escombros en la muestra pueden prevenir la identificación de las larvas Trichinella (Figura 1), etapas adicionales de lavado deben ser realizadas, si es necesario.
- Examinación microscópica
- Use un triquinoscopio o un estereomicroscopio con una fuente de luz transmitida subetapa de intensidad regulable a un aumento de 15 a 20 veces para examinar las muestras inmediatamente después de las etapas de lavado.
- Después de verter la muestra en la placa de Petri cuadriculada, examinar el plato / cuenca sistemáticamente red por la red. Si no se encuentran estructuras sospechosas, mueva suavemente el líquido en la placa de Petri cuadriculada o con cubeta para el cómputo de larvas en forma circular para permitir que cualquier La TrichinellaRVAE, que fueron potencialmente alto, se acumule en el centro de la placa de Petri. Repetir el examen.
- Si se encuentra una estructura sospechoso, aumentar la ampliación a 40 - 100X. Retire las larvas de Trichinella del plato / recipiente con una pipeta y recoger en un tubo con 90% de etanol.
- Después de que el plato completo ha sido examinado, repetir el procedimiento, a partir de la agitación suave de la cápsula / cuenca. Repetir el procedimiento al menos tres veces o hasta que ya no se encuentran larvas.
- Contar el número de larvas. Correlacionar con la cantidad de tejido muscular a prueba y se presentan como larvas por gramo de petróleo (GLP).
- Si demasiadas larvas están presentes en el líquido de digestión para determinar el número de larvas de forma fiable, devolver el fluido que contiene las larvas al cilindro de medición, enjuague con agua del grifo de una botella de lavado de aterrizaje, y dejar que las larvas se depositan en el fondo.
- Después de un tiempo de sedimentación 10 min, reducir el sobrenadante a un volumen definido (por ejemplo,10 ml). Para determinar el volumen exacto, transferir el sobrenadante a un nuevo cilindro con una pipeta.
- Suspender las larvas de forma homogénea en el líquido por agitación vigorosa. Durante el movimiento de agitación, añadir 12 gotas de suspensión de larvas 20 l en una placa de Petri.
- Examine cada gota a microscopio. Determinar el número de larvas en 240 l y borrar la cuenta más alta y la más baja. Extrapolar el número de larvas al volumen total (por ejemplo, 10 ml) de sobrenadante.
Nota: La calidad de la estereomicroscopio es de suma importancia para la identificación de larvas de Trichinella. - Cuando las larvas se recoge en un tubo con una pipeta, comprobar cuidadosamente que las larvas no se pegó en la pared de la pipeta, pero se transfieren al tubo.
Nota: Trichinella resultados positivos de muestras combinadas deben ser rastreados desde la piscina a la canal de origen. En este caso, el tamaño de la piscina se debe disminuir progresivamente hasta que la carcasa es positivo idenficados. El tamaño de la muestra también se puede aumentar durante este proceso para aumentar la sensibilidad. Cuando el examen de una muestra colectiva dé un resultado positivo o dudoso, una nueva muestra de 20 g se toma de cada cerdo. Las muestras de 20 g de cinco cerdos se reúnen y se examinaron usando el método descrito. De esta forma se examinarán muestras de 20 grupos de cinco cerdos. Cuando se detecta presencia de triquinas en un grupo de muestras de cinco cerdos, 20 g de muestras se recogen de los cerdos individuales en el grupo y se examinaron por separado hasta que se detecta la canal positivo de origen.
Representative Results
Después de la digestión, la forma de las larvas infectivas muscular puede variar, haciendo la identificación sea más difícil. Las formas típicas incluyen larvas fuertemente enrollado, larvas ligeramente en espiral o en forma de C o larvas completamente desenrollada (Figuras 2B - 2C). El número de larvas encontrado por gramo puede variar considerablemente y puede variar desde una larva a unos pocos cientos de larvas.
La morfología de la larva muscular infecciosa se muestra en la Figura 2A. Larvas de Trichinella son 0,7 a 1,5 mm de largo y aproximadamente 0,3 mm de ancho. El esófago es estrecha y tiene un extremo ligeramente redondeado. La cutícula es lisa. En la mitad anterior de la cavidad del cuerpo, la esticosoma, una estructura constituida por un tubo largo y delgado rodeado por una hilera de 45 a 55 células grandes (stichocytes), se puede observar. El recto es también redondeada sin ningún tipo de proyecciones o apéndices 10, 11.
t "> Otras estructuras, además de las larvas de Trichinella, se pueden encontrar después de la digestión muscular Algunos ejemplos se muestran en las figuras 3A -.. 3F animales salvajes a menudo se infectan con otros parásitos o las muestras de músculo disponibles para las pruebas están contaminados durante el proceso de evisceración por animado o estructuras inanimados / organismos. la longitud de las larvas, la aparición de los extremos anterior y posterior y la ocurrencia de la ayuda esticosoma para discriminar entre los diferentes géneros de nematodos 12.
Figura 1: El examen microscópico de Trichinella larvas después de (a) insuficiente y (B) suficientes etapas de aclarado. Las barras de escala indican 100 micras. Haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura.
Figura 2: Morfología de Trichinella infecciosa larvas que presenten el recto, esófago y esticosoma de la larva (A). Las formas posibles de las larvas del músculo después de la digestión que muestra (B) firmemente enrolladas en espiral y ligeramente larvas y (C) que se mueve desenrolló larvas. Las barras de escala indican 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de hallazgos en el fondo después de la digestión de las muestras del músculo con el método agitador magnético. (A) el pelo en forma de pelos degusano de la tierra que se encuentra en el jabalí; (B) Alaria alata de jabalí; (C) de la fibra muscular de jabalí; (D) Metastrongylus sp. de jabalí; Fibra (E) planta que se encuentra en el jabalí (F): Toxocara sp. larva de jabalí. Las barras de escala indican 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aunque el método de agitador magnético se puede realizar fácilmente, no adherirse estrictamente a los detalles técnicos conduce a la insuficiente sensibilidad, poniendo así en peligro la salud del consumidor. Entre los puntos críticos se han destacado en el texto anterior. Además, el uso de equipo adecuado es crucial para el éxito de la prueba. Todos los buques deben estar hechos de puntas de pipeta de vidrio y revestidas con silicona para reducir la adherencia de las larvas a la superficie.
La sensibilidad del método de digestión depende de la densidad de las larvas en los músculos y la cantidad de muestra de músculo probado. Para una densidad de larvas de 3-5 lpg de los tejidos musculares, se informó de una sensibilidad del 100%, pero por debajo de 1 lpg la sensibilidad se redujo a 40% 13. Dependiendo de la especie animal de acogida ensayados, la sensibilidad de la prueba se puede mejorar mediante el aumento de la cantidad de muestra utilizada. El iNFECCIÓN carga en la fauna silvestre es generalmente baja, por lo tanto, las muestras de mayor tamaño se utilizan 14. Los sitios preferidos también varían entre animales huésped. En este caso, la menor digestibilidad de algunos tejidos musculares como debe ser tenido en cuenta la lengua, que también puede dar lugar a mayor tamaño de la muestra 15.
Además, es importante entender que el método de agitador magnético no incluye los controles internos. Por lo tanto, la gestión de la garantía de calidad del muestreo a la documentación es esencial para obtener resultados exactos y precisos. La calidad de los resultados de laboratorio para detectar larvas de Trichinella en muestras de músculo debe ser supervisada por la participación regular de cada analista en ensayos de aptitud.
Otras limitaciones del método son que la etapa de identificación final de las larvas de músculo por microscopía es altamente subjetiva y heaVily depende del conocimiento de la morfología de las larvas por el analista examinar.
Un método alternativo interesante para evitar este problema es el método agitador magnético / de aislamiento por filtración seguido por la detección larvas por una prueba de aglutinación de látex. Sin embargo, de acuerdo con la legislación de la UE este método sólo se considerará equivalente a la prueba de la carne de cerdos domésticos pero no para los animales que se encuentran en mayor riesgo de infección como el jabalí 4. La identificación del antígeno de larvas con anticuerpos monoclonales hace la prueba más objetiva, pero niega el laboratorio la posibilidad de determinar el número de larvas por gramo de carne 16.
Otras variaciones del método agitador magnético incluyen la técnica del método / sedimentación agrupada digestión de la muestra asistida mecánicamente, la excavación muestra agrupada asistida mecánicamenteestion método / técnica de aislamiento en el filtro, y el método de digestión automática para muestras mezcladas de la técnica hasta 35 g. Estas técnicas se basan en la digestión artificial de la carne y la visualización y recuento de Trichinella larvas, pero difieren en el equipo usado para las etapas de filtración y sedimentación.
Las larvas aislado puede ser aún más identificado a nivel de especie por una prueba molecular (PCR, por ejemplo, múltiplex) 17. De acuerdo con la legislación de la UE, todas las muestras positivas deben enviarse al laboratorio nacional de referencia o para EURLP para la determinación de especies de Trichinella.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Así pues, gracias Sabine Reckinger por su excelente asistencia técnica y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knife, Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
| Blender | With a sharp chopping blade | ||
| Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
| Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
| Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation. | ||
| Stands, rings and clamps | |||
| Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
| Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
| Glass beaker | Capacity 3 L | ||
| Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube | ||
| Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
| Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
| Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
| 25% hydrochloric acid | |||
| Pepsin | Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL | ||
| Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
| Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
| Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
| Metal tray | Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice | ||
| Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 mL) | ||
| Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C | ||
| Siphon | For tap water |
References
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