Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة منتشر عينات جسري الورم الجوهرية لإنشاء نماذج زراعة الخلايا المشتقة من المريض أو توصيف المباشر للخلايا السرطانية وmicroenvironmental.
Abstract
منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG) هي مرحلة الطفولة ورم الدماغ الذي يحمل التكهن قاتلا عالميا. لأن الاستئصال الجراحي ليس استراتيجية العلاج قابلة للحياة ولم يتم تنفيذ خزعة بشكل روتيني، وتوافر عينات المريض للبحوث محدودة. ونتيجة لذلك، تم الطعن الجهود في دراسة هذا المرض عن طريق ندرة النماذج مرض المؤمنين. لتلبية هذه الحاجة، ونحن هنا وصف بروتوكول لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة عينات نسيجية مأخوذة من أجل توليد نماذج زراعة الخلايا المشتقة من المريض متينة والتي يمكن استخدامها في فحوصات في المختبر أو في التجارب المجراة طعم أجنبي مثلي. هذه النماذج يمكن استخدامها للكشف عن الأهداف المحتملة المخدرات ولدراسة العمليات pathobiological الأساسية داخل DIPG. يمكن كذلك بمد هذا البروتوكول لتحليل وعزل الخلايا السرطانية وmicroenvironmental باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)، التي تمكن من تحليل لاحق من السابق الجينالضغط ووالتعبير البروتين، أو إدخال تعديلات جينية من الحمض النووي في الخلية بكميات كبيرة أو مستوى خلية واحدة. وأخيرا، وهذا البروتوكول يمكن أيضا أن تتكيف لتوليد الثقافات المستمدة من المريض لعلاج أورام الجهاز العصبي المركزي أخرى.
Introduction
DIPG هي المركزي خبيثة الجهاز العصبي العدواني الذي يطرح نفسه في بونس بطني، وعادة خلال منتصف مرحلة الطفولة 1 و 2. وعلى الرغم من عقود من التجارب السريرية، والعلاج الحالي يقتصر على العلاج الإشعاعي، التي تنص على تحسن مؤقت أو استقرار الأعراض وتمتد فقط متوسط بقاء بمعدل 3 أشهر. حتى مع العلاج الإشعاعي، متوسط البقاء الإجمالي هو 9 أشهر فقط مع 90٪ من الأطفال الذين يموتون من المرض في غضون 2 عاما من التشخيص الأولي. بسبب طبيعة الارتشاحي من الورم وظائف الحرجة من الدماغ، استئصال الجراحي غير ممكن. وعلاوة على ذلك، في الولايات المتحدة، تاريخيا لم يتم إجراء الحصول على الخزعات الجراحية لDIPG 3، وتحليل الأنسجة ليس له دور الحالي في توجيه العلاج السريري والتشخيص وعادة ما يمكن أن تقدمه تصوير الأعصاب وحدها. وهكذا، فإن توافر ورم الأنسجة وأو يقتصر الدراسة، مما يحد من جهود لإجراء البحوث على جزيئات الدواء مرشح وبيولوجية الورم الأساسي. والجدير بالذكر أن سمحت التحسينات في تقنيات التصوير العصبي والمجسم لتطوير الخزعات الآمنة للDIPG في السنوات الأخيرة 4، والتي تشكل مجتمعة مع التقدم في البيولوجيا الجزيئية، حولت فهمنا للمرض. حاليا، والتجارب السريرية متعددة باستخدام خزعة مقدما والتنميط الجزيئي للDIPG لإضفاء الطابع الشخصي خطط العلاج هي مستمرة (NCT01182350، NCT02274987) 5.
DIPG وغيرها من الأطفال الاورام الدبقية عالية الجودة تمثل الأمراض تختلف عن نظيراتها ورم أرومي الكبار 6 و 7 و نماذج تجريبية وبالتالي المؤمنين DIPG ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية فريدة من نوعها واكتشاف استراتيجيات علاجية فعالة. في السنوات الأخيرة، ركزت الجهود للحصول على DIPG الورم رقضية للأبحاث في وقت تشريح الجثة أو، أقل شيوعا، خزعة أحدثت ثورة في فهمنا لوالقدرة على دراسة DIPG. وكشفت جهود تسلسل الجينوم على نطاق طفرة المتكررة في هيستون H3، 3A الأسرة (H3F3A) ومجموعة هيستون 1، H3B (HIST1H3B)، وهو ما يمثل أول مثال من الأمراض التي تصيب البشر التي تسببها طفرات في هيستون ترميز البروتينات 8، 9، 10، 11 . وعلاوة على ذلك، مجموعة فرعية من DIPGs تعبر عن طفرات في الجين ACVR1، التي لم يسبق ذكرت في السرطان ولكن متطابقة إلى حدوث طفرات وجدت في مرحلة الطفولة الخلقية التنموي اضطراب خلل التنسج الليفي المعظم المترقي 8، 9، 10، 11. كذلك، أول مزارع الخلايا DIPG المستمدة من المريض ومثلي مو طعم أجنبيوقد ثبت الآن ديل 1، 2، 12، 13، 14، وكذلك نماذج الماوس التي أنشئت من خلال زرع الأعضاء المباشر للخلايا السرطانية في الفئران العوز المناعي لتوليد xenografts مسلسل 3، 14، 15. وقد حددت الأولية جهود فحص المخدرات باستخدام هذه النماذج المستمدة من المريض وكلاء رواية واعد للترجمة السريرية 4 و 14 و قد وضعت الأساس لتجربة سريرية واحدة على الأقل (NCT02717455).
هذه الخطوات الأولى نحو التقدم ليست سوى البداية، وسوف العديد من عينات الأنسجة المستمدة من المريض ونماذج ثقافة يكون من الضروري تعريف أنواع فرعية من المرض وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. وراثيا المحركسوف نماذج الماوس الدو من DIPG تسهل أيضا الدراسات التي تهدف إلى تعزيز فهمنا الأساسي للمرض. سيتم ساعدت الجهود التي بذلت لتوليد نماذج وراثية لDIPG من الدراسات الجينومية التأسيسية التي نوقشت أعلاه، ولكن في الوقت الحاضر عدد محدود من الخيارات المتاحة. واحدة من هذه النموذج الذي يولد مماثلة تشريحيا الاورام الدبقية جذع الدماغ عالية الجودة، ويستخدم الفيروس تقييمات النتائج والكفاءات / التلفزيون نظام لدفع overexpression PDGF-B وفقدان Ink4a-ARF في الخلايا nestin إيجابي في الحفرة الخلفية من الفئران حديثي الولادة 5، 16. وتتضمن مقاربة أخرى تلخص عدة طفرات الرئيسية المرتبطة DIPG (هيستون H3.3 K27M الطفرة، وفقدان البروتين p53 وتفعيل PDGFRA) في الخلايا العصبية السلائف المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، وهو ما يكفي لجعل هذه الخلايا مكون للأورام 6 و 7 و 17. مزيج من الأساليب الوراثية والمريض الاوعيةسوف نماذج الطبعة تمكين اختبار قبل السريرية ويعزز تطوير علاجات فعالة.
لمعالجة التحديات التي تواجه البحوث DIPG المفصلة أعلاه، وقد تم تطوير هذا البروتوكول التشريح السريع لتوليد مزارع الخلايا المشتقة من المريض للتحقيق 8، 9، 10، 11، 12، 14. ويهدف البروتوكول إلى حماية سلامة الأنسجة وزيادة احتمال توليد الثقافات دائمة على الرغم من التحديات المرتبطة فترات ما بعد الوفاة طويلة ووقت النقل. عندما ولدت بنجاح، هذه الثقافات DIPG يمكن استخدامها في المختبر في التلاعب اللاحقة وفي التجارب المجراة طعم أجنبي، مما يسمح لتقييم الجزيئات العلاجية المحتملة على الخلايا المشتقة من المريض.
Protocol
وقد تم تنفيذ هذا البروتوكول مع موافقة من مجلس استعراضنا المؤسسي مع المناسبة دي تحديد جميع بيانات المرضى وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية، والدولية من أجل رفاهية الإنسان. الحصول على جميع الموافقات اللازمة المؤسسية مجلس المراجعة والموافقة المسبقة من عائلة المريض قبل العمل بهذا البروتوكول.
1. الحصول على عينات الأنسجة
ملاحظة: العنصر الحاسم في هذا البروتوكول يتطلب التعامل الصحيح مع التبرع الأنسجة تبدأ على الفور في وقت تشريح الجثة. العينة الجدوى الشاملة تعتمد إلى حد كبير على التقليل من بعد الوفاة الفاصل الزمني (PMI)، ونقل على الفور الأنسجة في الوسط البارد المناسب تستكمل مع المضادات الحيوية / antimycotics، والحفاظ على عينة على الجليد الرطب طوال النقل، والحفاظ على تقنية معقمة في جميع أنحاء البروتوكول.
- بناء على إخطارمن التبرع وشيك، وإعداد مجموعة جمع العينات. يستخدم مربع الشحن مع وعاء معزول التي يمكن استخدامها مباشرة لنقل عودة عينات الأنسجة، وتشمل المواد التالية:
- وتشمل المواد اللازمة لإعداد عقيمة، بما في ذلك القفازات المعقمة، والستائر، والمشارط.
- تشمل 8-10 العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية تحتوي على 30 وسائل الاعلام الشحن مل في حاوية معزولة مع الثلج أو حزم الباردة.
ملاحظة: في حين يمكن لأي وسائل الإعلام ثقافة الخلية القياسية العمل، ويتم الحصول على أفضل عينة الجدوى مع السبات-A تستكمل مع المضادات الحيوية / مضاد فطري. - تتضمن أي أنابيب العينات الأخرى لتحليلات أخرى (على سبيل المثال، مثبتات).
- إذا لن يتم تنفيذ عملية التشريح في موقع المحقق، وتشمل وثيقة تنص بوضوح على كيفية جمع عينة الورم. وهذا يشمل تفاصيل مثل الحفاظ على العقم، والحفاظ على أنابيب العينات على الجليد الرطب، وبما في ذلك عينات من المخ الأوسط والنخاع كما تومور خلايا في كثير من الأحيان تغزو هذه المناطق.
- الحفاظ على عقم خلال تشريح الجثة. النظر في الدماغ معقمة داخل الجمجمة، لذلك نلاحظ تقنية معقمة (بما في ذلك القفازات تغيير) مرة واحدة الجمجمة مفتوحة. تجنب التلوث مع الجلد والشعر أمر بالغ الأهمية.
- تشريح الورم من الجانب البطني ( "البطن" من بونس، انظر الشكل التكميلي 1). مع مشرط معقم، وقطع صغيرة 1 سم قطع من الورم ونقل على الفور إلى وسائل الإعلام الشحن البارد (انظر ملاحظة في الخطوة 1.1.2) ووضعها على الجليد الرطب. ضع 10 مل من الأنسجة في كل أنبوب، مما أدى إلى الحجم النهائي من الأنسجة وسائل الإعلام في كل أنبوب 40 مل.
ملاحظة: في حالة DIPG، الورم يخترق منتشرة بونس وكثيرا ما تبقى من الدماغ. على هذا النحو، وجمع أكبر قدر من عينة وقت ممكن، وعادة بما في ذلك 3-4 أنابيب (30 - 40 مل الأنسجة) من بونس و1-2 أنابيب (10-20 مل الأنسجة) كل من المخ الأوسط والنخاع. - جمع سامPLES من المخ الأوسط والنخاع جنبا إلى جنب إلى الجسر، والتي غالبا ما تحتوي على العديد من الخلايا السرطانية.
- بعد جمع العينة، شحن عينات O / N على الجليد الرطب في حاوية معزولة. لا شحن عينة على الثلج الجاف، وتجميد وقتل الخلايا.
2. إعداد لتجهيز العينات
- قبل بداية إعداد العينات، وتعقيم خزانات زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع شفرات الحلاقة، المرقأة منحنية، وأية أدوات أخرى غير معقمة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة. تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت ظروف معقمة لمنع التلوث من الثقافات.
- إعداد وحلول مرشح العقيمة.
- لإعداد 1.8 M حل السكروز، ويحل 308.07 ز السكروز في 300 مل من الماء المقطر. إضافة 50 مل 10X Hank's مخزنة المالحة الحل (HBSS) بدون الكالسيوم أو المغنسيوم وجلب الحجم الإجمالي إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر. تخزينها في 4 درجات مئوية.
- لإعداد حل الهضم الأنزيمي، واتخاذ 50 مل HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لكل 10 مل من الأنسجة المفروم وإضافة 500 ميكرولتر 5 ملغ / مل ديوكسي ريبونيوكلياز الأول (النهائي تركيز 50 / ميكروغرام مل)، 500 ميكرولتر 2.5 ملغ / مل كولاجيناز I / II وحل dispase (تركيز النهائي 25 ميكروغرام / مل)، و 500 ميكرولتر 1 عازلة M HEPES. حل الهضم Prewarm في 37 ° C حمام الماء.
- لإعداد الورم الجذعية وسائل الإعلام (TSM) قاعدة، مزيج 250 مل Neurobasal-A، 250 مل Dulbecco لتعديل النسر متوسطة: المغذيات خليط F12 (DMEM / F12)، 5 مل 100X المضادات الحيوية مضاد فطري، 5 مل 200 ملي L-ألانيل-L- ثنائي الببتيد الجلوتامين (GlutaMAX-A)، و 5 مل HEPES العازلة، 5 مل 100 ملي البيروفات الصوديوم، و 5 الأحماض الأمينية غير الأساسية مل 100X MEM.
- لإعداد كامل TSM مع عوامل النمو، إضافة المكملات الغذائية التالية إلى قاعدة TSM: 50X B27 الملحق ناقص فيتامين (أ) (01:50)، البشرة عامل النمو البشري (H-EGF، 20 نانوغرام / مل)، الخلايا الليفية الإنسان عامل النمو (H- جمعية جيل المستقبل، 20 نانوغرام / مل)، والإنسان AA عامل النمو المشتق من الصفيحات (H-PDGF-AA، 10 نانوغرام / مل)،الإنسان المستمدة من صفائح الدم عامل نمو BB (H-PDGF-BB و 10 نانوغرام / مل)، والحل الهيبارين (2 ميكروغرام / مل).
- Precool جهاز للطرد المركزي مختبر مجهز الدوار يتأرجح دلو إلى 4 درجات مئوية.
3. التفكك الميكانيكية
- نقل الأنسجة إلى 100 ملم × 20 ملم طبق الجدران العالية ثقافة الخلية. إزالة بقايا وسائل الاعلام من الشحن واستبدالها مع 10-15 مل سائل الإعلام والثقافة البارد.
- استخدام المرقأة منحنية لفهم شفرة حلاقة، واللحم المفروم ناعما الأنسجة أثناء إزالة الأوعية الدموية واضحة أو السحايا.
ملاحظة: يجب أن يكون شظايا الأنسجة النهائية أصغر من 1 ملم (انظر الشكل 1B). - نقل الأنسجة في أنبوب 50 مل المخروطية نظيفة. غسل الطبق الثقافة الخلية التي تحتوي على 5 وسائل الاعلام إضافية مل ثقافة الباردة ونقل إلى أنبوب مخروطي الشكل. كرر هذه الخطوة غسل اللازمة لنقل الأنسجة المتبقية.
- باستخدام الماصة المصلية 10 مل، يسحن بلطف (4-5 مرات). السماح TISS أكبرشظايا رق لتستقر في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة لمدة 1 دقيقة (350 x ج، 4 درجة مئوية).
- جمع جزء فصلها ميكانيكيا.
- إزالة طاف وتصفية من خلال تصفية 100 ميكرون إلى 50 أنبوب مل المخروطية الجديد المسمى "التفكك الميكانيكية". عكس تصفية أكثر من أنبوب مخروطي الشكل الأصلي ويغسل مع وسائل الإعلام والثقافة لاسترداد شظايا الأنسجة.
- الطرد المركزي "التفكك الميكانيكية" جزء لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 درجة مئوية).
- إزالة طاف من جزء "التفكك الميكانيكية" مكعبات و resuspend الأنسجة في وسائل الإعلام ثقافة البارد. إذا كان هناك أكثر من 5 مل من الأنسجة في "التفكك الميكانيكية" أنبوب مخروطي، وتقسيم النسيج إلى أخرى أنابيب 50 مل مخروطي بحيث لا أنبوب لديها اكثر من 5 الأنسجة مل.
- تخزين جزء فصلها ميكانيكيا على الجليد حتى خطوة الطرد المركزي التدرج السكروز (سانتص 5). بدلا من ذلك، يمكن للجزء فصلها ميكانيكيا انتقل إلى الخطوة 5 خلال فترة تفكك حضانة الأنزيمية (الخطوة 4.4).
4. الأنزيمية التفكك
- إذا كان هناك أكثر من 5 مل من الأنسجة في الأنبوب الذي يحتوي على أجزاء الأنسجة أكبر المتبقية، وتقسيم النسيج إلى أخرى أنابيب 50 مل المخروطية جديدة بحيث لا أنبوب لديها اكثر من 5 الأنسجة مل.
- أجهزة الطرد المركزي أنبوب مخروطي الشكل (الصورة) التي تحتوي على شظايا الأنسجة المتبقية لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 درجة مئوية).
- إزالة طاف وإضافة محلول الهضم الأنزيمي prewarmed، مثل أن هناك 5 مل من محلول الهضم لكل الأنسجة مل 1 (على سبيل المثال، 25 مل من محلول الهضم لمدة 5 مل الأنسجة).
- ختم الأغطية أنبوب مخروطي الشكل مع فيلم مختبر واحتضان رد فعل على محور دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الحضانة، ويسحن عينات بلطف (انظر الشكل 1C).
- باستخدام الماصة المصلية 10 مل،الماصة العينة صعودا وهبوطا 6-8 مرات. تجنب توليد فقاعات الهواء المفرطة.
- إضافة 1000 ميكرولتر طرف الماصة إلى نهاية الماصة ويسحن إضافي 6-8 مرات.
- السماح لأي مساحات المتبقية لتستقر في قاع الأنبوب. إزالة وتصفية طاف مع الخلايا لا تزال معلقة من خلال مرشح 100 ميكرون إلى 50 أنبوب مل المخروطية الجديد المسمى "الأنزيمية التفكك" وتخزينها على الجليد.
- إذا بقيت أجزاء الأنسجة كبيرة، إضافة إضافي 10 مل HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لشظايا وكرر الخطوات 3.5.1 و3.5.2. تصفية هذا الحل النهائي من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب "الأنزيمية التفكك".
- الطرد المركزي "الأنزيمية التفكك" أنبوب لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 ° C) ومواصلة الطرد المركزي التدرج السكروز.
5. السكروز التدرج الطرد المركزي
- إذا العينات لا تزال معلقة في الحل، centrifuجنرال الكتريك لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 درجة مئوية).
- إزالة طاف و resuspend الأنسجة في 20 مل HBSS الباردة دون الكالسيوم والمغنيسيوم. يصل حجم ما يصل الى 25 مجموع مل مع HBSS الباردة.
- ببطء إضافة 25 مل 1.8 M حل السكروز وعكس الأنبوب إلى المزيج. وينتج عن هذا الانحدار 0.9 M السكروز.
- أجهزة الطرد المركزي مع عدم وجود فرامل لمدة 10 دقيقة (800 x ج، 4 درجة مئوية). باستخدام الفرامل الطرد المركزي سيعطل التدرج وخفض العائد (انظر الشكل 1D للحصول على مثال لعينة قبل وبعد الطرد المركزي).
- نضح بعناية الحطام الميلين والكثير من محلول السكروز وقت ممكن. غسل العينة بإضافة 30 مل HBSS الباردة دون الكالسيوم والمغنيسيوم وخلط بلطف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 درجة مئوية).
تحلل الخلية 6. ACK الدم الحمراء
- إزالة طاف يغسل. إضافة 5 مل العازلة تحلل ACK و resuspend بلطف بيليه الخلية، يحوم الأنبوب لمدة 1 دقيقة في RT.
- إخماد ليسيس بإضافة 30 مل HBSS الباردة دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق (350 x ج، 4 درجة مئوية).
7. صيانة الثقافة الأولية
- Resuspend والكريات الخلية الأخيرة في 10-15 مل دافئ الكامل TSM مع عوامل النمو وقياس كثافة الخلايا القابلة للحياة على عدادة الكريات باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
ملاحظة: مجموعة من خلايا قابلة للحياة يختلف على نطاق واسع على ظروف التبرع الأنسجة، والقياس الكمي يمكن أن يكون صعبا في هذه المرحلة المبكرة بسبب الحطام الخلوي متبقية. في الحالة المثالية، والهدف أن يكون واحدا مليون خلية حية في العينة. في الحالات التي لا تزال الحطام المفرط، لوحة في مناطق ذات كثافة أقل في قارورة T175. - نقل تعليق خلية النهائية على قارورة ثقافة T75 الجديدة. ارتفاع في عوامل النمو إضافية كل يوم للحفاظ على مستويات عامل النمو الشاملة، ومراقبة تطوير neurospheres الخلايا السرطانية (انظر الشكل 1E) والشكل (2).
- بدلا من ذلك، عملية فصل الخلايا إنزيمي لمزيد من التحليل، بما في ذلك التدفق الخلوي ومضان تنشيط الفرز الخلية.
- بعد تطوير neurospheres (الذي يأخذ في المتوسط 3-4 أسابيع، ولكن تتراوح بين بضعة أيام إلى طالما 2 أشهر)، عكس مرشح العينة باستخدام 100 ميكرون تصفية شبكة من النايلون لتقليل كمية الحطام.
ملاحظة: يجب الإبقاء على الترشيح في الثقافة في حالة الخلايا واحدة قابلة للحياة أو مجالات صغيرة موجودة. - ضمان سلامة ونقاء الثقافة عن طريق إجراء بصمة الحمض النووي في حين الركض، مقارنة على عينة المرضى الأولية.
Representative Results
وتتلخص بروتوكول صفها بأنها سير العمل خمس خطوات مع الصور من الأنسجة في مراحل مختلفة من المعالجة في الشكل 1. يتم الحصول على العينة الأولى من خلال تشريح الجثة العقيمة السريع. خلال التفكك الميكانيكية، ومفروم الأنسجة أثناء إزالة الأوعية الدموية والسحايا من العينة، وتصفيتها من خلال 100 ميكرون تصفية شبكة من النايلون. ونأت المتبقية شظايا الأنسجة إنزيمي في فرن الاحتباس الحراري. بعد ذلك، يتم تقليل الحطام من خلال الطرد المركزي التدرج السكروز وعزل طبقة متميزة من الميلين من العينة. وبالإضافة إلى ذلك، ACK تحلل يقلل بشكل واضح من كمية خلايا الدم الحمراء الموجودة في العينة. وأخيرا، ومطلي الخلايا في وسائل الإعلام المصل خالية تستكمل مع عوامل النمو.
الشكل التكميلي 1 مثال الورم على تشريح الجثة. ينمو الورم بأنه تسلل منتشر في لبونزد المناطق المجاورة من جذع الدماغ. خلال الاستعدادات العينة، يجب أن تقطع صغيرة قطع ~ 1 سم × 1 سم وضعت على الفور في وسائل الاعلام الشحن الباردة على الجليد.
ويبين الشكل 2 أمثلة مختلفة لكيفية ظهور عينات من المراحل المبكرة من زراعة إلى ثقافة دائمة. في البداية مطلي والثقافات في وقت مبكر (A، B) في كثير من الأحيان لا يبدو أن تحتوي على العديد من الخلايا على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك، مجموعات الخلايا في وقت مبكر (C، D) في كثير من الأحيان لا تظهر درجة من التباين التي ترتبط عادة مع neurospheres. والجدير بالذكر أن مدة من الزمن في الثقافة قبل ظهور مجموعات الخلايا يمكن أن يستغرق أسابيع إلى بضعة أشهر. ومع ذلك، فإن مرور الأولي من هذه المجموعات الخلية، جنبا إلى جنب مع تصفية العكسية من مجموعات الخلايا، يمكن عزل الخلايا السرطانية صحية قادرة على تشكيل الكرات. (F). الراشح (E) عادة ما تحتوي على الحطام المتبقي. ومع ذلك، فإننا نوصي الطلاء والحفاظ على الترشيح والرصد ل تطوير مجموعات الخلايا. ويمكن بعد ذلك حافظت هذه العينات المستمدة من المريض في الثقافة لمقاطع متعددة (G، H).
الشكل (3) يوضح قدرة هذه الخلايا لتكون xenografted في الفئران. في كل من هذه الحالات، و transfected الخلايا DIPG مع مراسل GFP وسيفيراز لمراقبة تطور الأورام من خلال تلألؤ بيولوجي (A). ويمكن أيضا أن الأورام يتم فحص تشريحيا، على سبيل المثال لمراقبة engraftment الورم (B) أو التعبير عن علامات معينة (C). هذه في النماذج الحية، جنبا إلى جنب مع فحوصات في المختبر يمكن استخدامها لتقييم آثار مختلف الأدوية أو التلاعب الجيني (على سبيل المثال، 8، 9، 10، 11، 14).
ليه / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
الشكل 1. عينات الأنسجة في مراحل مختلفة من المعالجة. (أ) الحصول على عينة من خلال إجراءات التشريح معقمة والشحن بين عشية وضحاها على الجليد الرطب. (ب) من اليسار إلى اليمين: (صف 1) أنابيب تحتوي على أنسجة الورم في وسائل الإعلام الشحن. أنسجة جديدة في 100 مم × 20 مم طبق ثقافة الخلية؛ تنميق الأولي من الأنسجة. (الصف 2) الأنسجة المفروم جزئيا. إزالة السحايا والأوعية الدموية. الحجم النهائي للقطعة نسيج مفروم. (ج) من اليسار إلى اليمين: (صف 1) الأنسجة المحتضنة على طاولة دوارة في 37 درجة مئوية الفرن. (الصف 2) سحن من الأنسجة من خلال طرف الماصة 1000 ميكرولتر تعلق على الماصة 10 مل. تصفية الأنسجة فصلها من خلال 100 ميكرون تصفية شبكة من النايلون. (د) من اليسار إلى اليمين: فصل الأنسجة علقت في 0.9 M حل السكروز قبل الطرد المركزي. الأنسجة فصلها فصل عبر التدرج السكروز بعد الطرد المركزي. طبقة مرئية سالحطام و المايلين على رأس التدرج السكروز. بيليه خلية النهائي بعد ACK تحلل ويغسل. (E) يمكن أن توضع العينة النهائية في الثقافة أو استخدامها في التحليلات التحويلية الأخرى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور من الثقافات الأولية والخلايا مرور وقت مبكر. (A - B) الثقافات مطلي مباشرة بعد التفكك (SU-DIPG-XXX، A)، أو التي لم نمت neurospheres بعد (SU-DIPG-التاسعة والعشرين، B). (C - D) ظهور المبكر من neurospheres في الثقافات الأولية من SU-DIPG-الثامن والعشرون (C) وSU-DIPG-التاسعة والعشرين (D). (EF) مرور الأول للثقافة الأولية من D باستخدام فلتر النايلون 100 ميكرون، مع فايltrate (E) والترشيح العكسي (F) مطلي. (G - H) neurospheres الناضجة من مرور الأول من SU-DIPG-XXVII (G) ومرور الثالث من SU-DIPG-الخامس والعشرون (H) نموا في الثقافة. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. زراعات الخلايا المشتقة من المريض يمكن تدبر ونموذج الأورام في الفئران. الصور (A) ضوء بارد من أربعة أنواع مختلفة من مزارع الخلايا المشتقة من المريض transfected مع مراسل GFP وسيفيراز. (ب) قسم سهمي من طعم أجنبي الماوس، تظهر الخلايا السرطانية المغروسة في بونس الماوس. الأخضر: GFP، الأحمر: بروتين النخاعين الأساسي. شريط مقياس = 1 مم. immunofluores (C) مثالcence صورة تظهر الخلايا السرطانية GFP المغروسة في مخ الفأر. الزرقاء: دابي، الأخضر: GFP، الأحمر: IGF2R. شريط النطاق = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. عينة التشريح من ورم جسري. فوري ظهور بعد الوفاة لمنتشر الورم جسري جوهري. يظهر الورم على أنه، كتلة كبيرة المايلين الغنية على السطح البطني للبونس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذه الصورة.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة التبرعات أنسجة الورم لتطوير مزارع الخلايا المشتقة من المريض، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من في المختبر أو في التجارب المجراة. ونظرا لطبيعة العمل مع عينات التشريح، والحفاظ على استمرارية عينة يشكل تحديا كبيرا. العديد من العوامل المساهمة، بما في ذلك فترة ما بعد الوفاة لتشريح أو الوقت اللازم لنقل الأنسجة، وينبغي التقليل قدر الإمكان ولكن من الصعب التحكم في كثير من الأحيان. في تجربتنا، والفترة التالية للموت من أقل من 6-8 ساعة (من وقت الموت إلى الوقت الذي يتم وضع الأنسجة في الجليد الشحن البارد وسائل الاعلام وسائل النقل) قد حقق أفضل فرصة لإرساء ثقافة خلية دائمة. فمن الأفضل لثم تظهر الأنسجة في المختبر خلال 24 ساعة، ومعالجته للثقافة فور استلامها.
منذ الموقع من هذه الحالات نادرة يختلف على نطاق واسع، ونوعية خطوة استرجاع الأنسجة تؤثر بقوة على فرصة للنجاح، والخدمات اللوجستية على أداء تشريح الجثة يمكن أن يكون تحديا. في كثير من الحالات، من أجل تحقيق الإطار الزمني 6-8 ساعة، فإنه ليس من الممكن إجراء الحصاد الأنسجة في مركز الأكاديمي. بدلا من ذلك، وجود خدمة استعادة الأنسجة على الدعوة إلى استعادة الأنسجة السرطانية في جنازة الوطن في إطار بروتوكول افق الاتحاد الدولي للرجبي في كثير من الأحيان أكثر المناسب لاستعادة الأنسجة. الحصول على الموافقة المسبقة قبل الموت الموصى بها ويسهل التخطيط اللوجستي. إعداد مجموعات التشريح مكتفية ذاتيا مع تعليمات واضحة وشاملة واللوازم معقمة لاسترجاع الأنسجة (القفازات، والستائر، المشارط) ويوصى بشدة. بالإضافة إلى ذلك، وإنشاء نقاط اتصال واضحة بين المحقق، الطبيب الشرعي، وجنازة الوطن أمر بالغ الأهمية. على سبيل المثال، ينبغي للمحقق مناقشة بروتوكول مع الطبيب الشرعي قبل التشريح وتسليط الضوء على الأخطاء الشائعة. وتشمل هذه الأخطاء الصغيرةتلوث بيال (عادة الخميرة) خلال استرجاع الأنسجة، وفشل لشحن عن طريق الشحن بين عشية وضحاها / المعجل وفشل لشحن عينة على الجليد الرطب كافية في وعاء thermoinsulated. وأخيرا، فإننا نوصي باستخدام خدمة البريد السريع من الباب إلى الباب للشحن من العينة إلى تقليل الوقت اللازم للنقل.
وينبغي أيضا توخي الحذر أثناء تفكك الأنسجة للحفاظ على بقاء الخلية. على سبيل المثال، استخدام وسائل الإعلام تهدف إلى الحفاظ على صحة الأنسجة العصبية للنقل (السبات-A تستكمل مع المضادات الحيوية / مضاد فطري) سيزيد من فرصة لتوليد ثقافة ناجحة. ومن المهم أيضا للحفاظ على العينة في درجة حرارة باردة في جميع أنحاء البروتوكول عن طريق نقل دائما العينات على الجليد. جمع الصورتين تفارق الميكانيكية والأنزيمية جنبا إلى جنب مع التقليل من سحن يمكن أن تحسن نجاح البروتوكول، على حد سواء الخطوات هي مؤلمة للخلايا. في تجربتنا، في حين تنمو معظم الثقافات الناجحة من الصورتين، كان لدينا الحالات التي أنشئت واحد فقط من التحضيرات اثنين ثقافة دائمة، ويحتمل أن يعكس الطبيعة الحساسة لهذه العينات. خطوة مؤلمة أخرى في البروتوكول هو سحن. استراتيجية واحدة التي يمكن أن تقلل من درجة سحن الضروري هو ضمان مفروم العينات بدقة في بداية التحضير. وهناك أمثلة أخرى من جوانب البروتوكول يهدف إلى تحسين قابلية عينة مضيفا مخازن (على سبيل المثال، HEPES) في جميع أنحاء بروتوكول، وهو أمر بالغ الأهمية خلال تفارق الأنزيمية.
وهناك تعديل ممكن من هذا البروتوكول إلى زيادة قابلية الخلية هو إزالة الدم الحمراء خطوة خلية تحلل ACK. ومع ذلك، في هذه الحالة، غالبا ما يكون ذلك ضروريا لأداء خطوة ACK تحلل خلال الأسبوع الأول في الثقافة لإزالة خلايا الدم الحمراء. جانب آخر من هذا البروتوكول التي يجوز تعديلها هو القضاء على المايلين والحطام الخلوي باستخدام كثافه السكروزذ التدرج. على وجه التحديد، والاستراتيجيات الأخرى التي تم الإبلاغ عنها لتحسين بقاء الخلية من خلايا دبقية صغيرة من الممكن أيضا في هذه الخطوة، مثل متقطع Percoll كثافة التدرج 18 او الخرز إزالة المايلين المغناطيسية.
وأخيرا، فإن مدة بين تفكك النسيج الأولي وظهور neurospheres اختلافا بين عينات ويمكن أن تتخذ في أي مكان من أسبوع إلى شهر أو أكثر. منذ الثقافات الأولية تحتوي عادة على درجة كبيرة من الخلايا الميتة والبقايا الخلوية، فإنه يمكن أن يكون تحديا لتحديد ما إذا كانت الخلايا قابلة للحياة تبقى. ينبغي الحفاظ على ثقافة لا يقل عن 4 - 8 أسابيع (الشكل 2). استراتيجية واحدة لعزل خلايا متزايدة من الحطام المتبقي يرد هنا (أي عكس تصفية مجموعات الخلايا وإعادة الطلاء في وسائل الإعلام الطازج). قرار حول ما إذا كان سيستمر في الحفاظ على الثقافة هو في نهاية المطاف قرار كل حالة على حدة بناء على العوامل المحيطة عشرالبريد تشريح الجثة (على سبيل المثال، وهي الفترة التالية للموت لفترة طويلة، والقضايا أثناء النقل الأنسجة)، وتفكك النسيج (على سبيل المثال، الدم المفرط أو الحطام)، وكيف تظهر العينة في الثقافة. مرة واحدة يتم تأسيس ثقافة، يجب أن يتم التحقق من صحة الهوية عن طريق بصمة الحمض النووي باستخدام القصير تحليل جنبا إلى جنب تكرار أو طريقة مماثلة، ويقارن بين الثقافة لعينة من الورم الأصلي الاحتفاظ بها لهذا الغرض. نوصي التحقق بشكل روتيني الثقافات التي كتبها بصمة الحمض النووي للتأكد من عدم وجود تلوث من الثقافات الأخرى حدث، على سبيل المثال كل 3-6 أشهر.
جيل من هذه الثقافات DIPG المستمدة من المريض يمثل خطوة هامة في التنمية الناجحة للعلاجات فعالة. سوف توسع من النماذج المستمدة من المريض الثقافات DIPG وطعم أجنبي المتاحة ستكون حاسمة في تحديد الاستراتيجيات العلاجية الأكثر فاعلية والتغلب في نهاية المطاف هذا المرض المدمر.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
والكتاب الامتنان بدعم من مؤسسة كلير ماكينا، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS K08NS070926 وR01NS092597)، وزارة الدفاع (NF140075)، معهد كاليفورنيا للالطب التجديدي (CIRM RB4-06093 وRN3-06510)، عصير الليمون اليكس تقف المؤسسة، والعلاج يبدأ الآن مؤسسة وDIPG التعاونية، ومؤسسة ليلى النصولي، كشف أطفال السرطان، مؤسسة استئصال ورم من الدماغ في مرحلة الطفولة، ومؤسسة ماثيو لارسون، مؤسسة V، صندوق عائلة غودفري في ذاكرة فيونا بينيلوب، ومؤسسة ايلاندز فيلار DIPG، ديلان جويت ، كونور جونسون، زوي غانيش، ديلان فريك، الوصيفة جنسن، وصناديق التذكارية كرانز جنيفر، مؤسسة N8، فيرجينيا وDK صندوق لودفيج لأبحاث السرطان، معهد بحوث صحة الطفل في جامعة ستانفورد آن ت وروبرت باس هبوا كلية للمنح الدراسية في طب الأطفال السرطان وأمراض الدم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
