Summary
Ce protocole décrit une méthode pour le traitement rapide de la post-mortem diffuse des échantillons de gliome pontique intrinsèques pour l'établissement de modèles de culture de cellules provenant de patients ou la caractérisation directe des cellules tumorales et microenvironnement.
Abstract
Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG) est une tumeur du tronc cérébral de l'enfant qui porte un pronostic universellement fatale. Parce que la résection chirurgicale est pas une stratégie viable de traitement et la biopsie est pas systématiquement effectuée, la disponibilité des échantillons de patients pour la recherche est limitée. Par conséquent, les efforts visant à étudier cette maladie ont été contestées par un manque de modèles de maladies fidèles. Pour répondre à ce besoin, nous décrivons ici un protocole pour le traitement rapide d'échantillons de tissus d' autopsie post-mortem afin de générer des modèles de culture de cellules dérivées de patients durables qui peuvent être utilisés dans des essais in vitro ou in vivo des expériences de xénogreffe orthotopique. Ces modèles peuvent être utilisés pour dépister les cibles potentielles de médicaments et d'étudier les processus pathobiologiques fondamentaux au sein de DIPG. Ce protocole peut en outre être étendu à analyser et à isoler les cellules tumorales et à l'aide microenvironnement cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui permet une analyse ultérieure du gène expressure, l'expression des protéines ou des modifications épigénétiques de l'ADN dans la cellule en vrac ou au niveau de la cellule unique. Enfin, ce protocole peut être adapté pour générer des cultures provenant de patients pour d'autres tumeurs du système nerveux central.
Introduction
DIPG est une tumeur maligne nerveux central agressif du système qui se pose dans les pons ventraux, généralement au cours de la mi-enfance 1, 2. Malgré des décennies des essais cliniques, le traitement actuel est limité à une radiothérapie, ce qui apporte une amélioration ou une stabilisation temporaire des symptômes et seulement prolonge la survie médiane et une moyenne de 3 mois. Même avec la radiothérapie, la survie globale médiane est seulement 9 mois avec 90% des enfants meurent de la maladie dans les 2 ans suivant le diagnostic initial. En raison du caractère infiltrant de la tumeur et les fonctions critiques du tronc cérébral, la résection chirurgicale est impossible. En outre, aux États-Unis, l' obtention de biopsies chirurgicales pour DIPG a toujours pas été effectuée 3, que l' analyse histopathologique n'a aucun rôle actuel pour guider le traitement clinique et le diagnostic peut généralement être faite par neuroimagerie seul. Ainsi, la disponibilité du tissu tumoral fou de l'étude est limitée, ce qui limite les efforts pour mener des recherches sur les molécules de médicaments candidats et la biologie de la tumeur sous-jacente. Notamment, l' amélioration des techniques de neuroimagerie et stéréotaxiques ont permis le développement de biopsies sûres de DIPG au cours des dernières années 4, qui, lorsqu'il est combiné avec les progrès de la biologie moléculaire, ont transformé notre compréhension de la maladie. Actuellement, plusieurs essais cliniques utilisant la biopsie à l' avance et le profilage moléculaire de DIPG pour individualiser les plans de traitement sont en cours (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG et d' autres gliomes pédiatriques de haute qualité représentent les maladies distinctes de leurs homologues de glioblastome adulte 6, 7, et des modèles expérimentaux ainsi fidèles de DIPG sont nécessaires pour comprendre sa physiopathologie unique et découvrir des stratégies thérapeutiques efficaces. Ces dernières années, des efforts ciblés pour obtenir DIPG tumeur tquestion de la recherche au moment de l'autopsie ou, moins fréquemment, la biopsie ont révolutionné notre compréhension et notre capacité à étudier DIPG. Efforts de séquençage du génome entier a révélé une mutation récurrente dans l'histone H3, 3A famille (H3F3A) et cluster histone 1, H3b (HIST1H3B), ce qui représente le premier exemple de la maladie humaine causée par des mutations dans histone protéines 8, 9, 10, 11 codage . En outre, un sous - ensemble de DIPGs exprime des mutations dans le gène ACVR1, qui n'a pas été précédemment rapportées dans le cancer , mais sont identiques aux mutations trouvées dans l'enfance congénitale trouble du développement fibrodysplasie ossifiante progressive 8, 9, 10, 11. En outre, les premières DIPG cultures de cellules provenant de patients et orthotopique xénogreffe models ont été établies 1, 2, 12, 13, 14, ainsi que des modèles de souris établies par la xénotransplantation directe de cellules tumorales dans des souris immunodéficientes pour générer les xénogreffes série 3, 14, 15. Les efforts de dépistage des drogues initiales utilisant ces modèles de patients dérivés ont identifié des agents nouveaux prometteurs pour la traduction clinique 4, 14 et ont jeté les bases d'au moins un essai clinique (NCT02717455).
Ces premiers pas vers le progrès ne sont que le début, et de nombreux échantillons de tissus provenant de patients et des modèles de culture seront nécessaires pour définir les sous-types de la maladie et élaborer des stratégies thérapeutiques les plus efficaces. génétiquement moteurmodèles de souris Ered de DIPG également faciliter les études visant à approfondir notre compréhension de base de la maladie. Les efforts déployés pour générer des modèles génétiques pour DIPG seront aidés par les études génomiques fondamentales évoquées ci-dessus, mais actuellement un nombre limité d'options sont disponibles. Un tel modèle, qui génère des gliomes histologiquement similaires du tronc cérébral de haute qualité, utilise le RCAS / tv-un système viral pour conduire PDGF-B surexpression et la perte Ink4a-ARF dans les cellules nestine-positives dans la fosse postérieure de souris néonatale 5, 16. Une autre approche implique récapitulant plusieurs grandes mutations de DIPG-associés (histone H3.3 K27M mutation, perte de p53 et d' activation PDGFRA) dans les cellules précurseurs neurales dérivées de cellules souches embryonnaires humaines, ce qui est suffisant pour rendre ces cellules tumorigènes 6, 7, 17. La combinaison des méthodes génétiques et le patient Derivmodèles ed permettront essais précliniques et favoriser le développement de thérapies efficaces.
Pour relever les défis à la recherche de DIPG détaillé ci - dessus, ce protocole d' autopsie rapide a été développé pour produire des cultures de cellules provenant de patients aux fins d' enquête 8, 9, 10, 11, 12, 14. Le protocole est destiné à protéger la viabilité du tissu et de maximiser la probabilité de générer des cultures durables malgré les défis associés à des intervalles post-mortem étendues et le temps de transport. Lorsqu'il est produit avec succès, ces cultures DIPG peuvent être utilisés dans les manipulations ultérieures in vitro et in vivo de xénogreffes, permettant l' évaluation des molécules thérapeutiques potentiels sur les cellules dérivées de patients.
Protocol
Ce protocole a été réalisée avec l'approbation de notre conseil d'examen institutionnel de-identification appropriée de toutes les données du patient et conformément à toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Obtenir toutes les institutions d'approbation des commissions d'examen approprié et le consentement éclairé de la famille du patient avant de travailler avec ce protocole.
1. Obtenir des échantillons de tissus
NOTE: Un élément essentiel de ce protocole exige une manipulation appropriée du don de tissus à partir immédiatement au moment de l'autopsie. La viabilité globale de l' échantillon dépend de manière significative sur la réduction du Post-Mortem Interval (PMI), transférer immédiatement le tissu dans le milieu froid approprié complété avec des antibiotiques / antifongiques, en gardant l'échantillon sur de la glace tout au long du transport, et le maintien d'une technique stérile tout au long du protocole.
- Dès la notificationd'un don imminent, préparer un kit de prélèvement d'échantillon. Utilisation d'une boîte d'expédition avec un conteneur isolé qui peut être directement utilisé pour le transport de retour de l'échantillon de tissu, comprennent les matériaux suivants:
- Inclure des matériaux de préparation stérile, y compris des gants stériles, les rideaux, et scalpels.
- Inclure 8 - 10 stériles de 50 ml tubes coniques contenant 30 médias d'expédition mL dans le conteneur isotherme avec de la glace ou des compresses froides.
NOTE: Bien que tout milieu de culture cellulaire standard peut fonctionner, la meilleure viabilité de l'échantillon est obtenue avec Hibernate-A supplémenté avec un antibiotique / antimycosique. - Inclure tous les autres tubes d'échantillons pour d' autres analyses (par exemple, fixatifs).
- Si l'autopsie ne sera pas effectuée sur le site de l'enquêteur, inclure un document qui indique clairement comment recueillir l'échantillon de tumeur. Cela inclut des détails tels que le maintien de la stérilité, en gardant les tubes échantillons sur de la glace, et y compris des échantillons du mésencéphale et le bulbe rachidien que tumor cellules envahissent souvent ces régions.
- Maintenir la stérilité lors de l'autopsie. Considérons le cerveau stérile à l'intérieur du crâne, donc observer une technique stérile (y compris les gants changeants) une fois que le crâne est ouvert. Éviter la contamination avec la peau et les cheveux est critique.
- Disséquer la tumeur de la face ventrale (le "ventre" des pons, voir la figure supplémentaire 1). Avec un scalpel stérile, couper des petits morceaux de 1 cm de la tumeur et transférer immédiatement dans les médias à froid d'expédition (voir NOTE à l'étape 1.1.2) et de mettre sur la glace mouillée. Placer 10 ml de tissu dans chaque tube, résultant en un volume final de tissu et des médias dans chaque tube de 40 ml.
NOTE: Dans le cas de DIPG, la tumeur infiltrats diffuse les pons et fréquemment le reste du tronc cérébral. En tant que tel, recueillir autant de l'échantillon que possible, y compris généralement 3 - 4 tubes (30 - 40 ml) de tissus de pons et 1 - 2 tubes (10 - 20 de tissu mL) chacun de mésencéphale et le bulbe rachidien. - Collecter samples du mésencéphale et le bulbe rachidien juxtaposée aux pons, qui contiennent souvent de nombreuses cellules tumorales.
- Après la collecte des échantillons, expédier les échantillons O / N sur la glace mouillée dans le conteneur isolé. Ne pas expédier l'échantillon sur la glace sèche, que le gel va tuer les cellules.
2. Préparation pour le traitement de l'échantillon
- Avant de commencer la préparation des échantillons, stériliser les hottes de culture de tissus ainsi que des lames de rasoir, hémostatiques courbes, et d'autres outils non stériles sous lumière UV pendant 1 h. Effectuer toutes les étapes suivantes, dans des conditions stériles pour éviter la contamination des cultures.
- Préparer et solutions de filtration stériles.
- Pour préparer 1,8 M solution de saccharose, dissoudre 308,07 g de saccharose dans 300 ml d'eau distillée. Ajouter 50 ml de 10x Hank's une solution saline tamponnée Solution (HBSS) sans calcium ni magnésium et amener le volume total à 500 ml avec de l'eau distillée. Conserver à 4 ° C.
- Pour préparer la solution de digestion enzymatique, prendre 50 ml de HBSS avec du calcium et du magnésium pour chaque 10 ml de tissu haché et ajouter 500 ul de 5 mg / désoxyribonucléase ml I (concentration finale de 50 pg / ml), 500 ul de 2,5 mg / ml de collagénase I / II et de la solution de dispase (concentration finale de 25 ug / ml) et 500 ul 1 M de tampon HEPES. solution de digestion Préchauffer dans un bain d'eau C 37 °.
- Pour préparer la tumeur tige médias (TSM) de base, mélanger 250 ml Neurobasal-A, de 250 mL Dulbecco Modified Eagle Medium: éléments nutritifs Mélange F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiotique-antimycosique, 5 ml 200 mM de L-alanyl-L- dipeptide glutamine (GlutaMAX-A), un tampon HEPES 5 ml, 5 ml de pyruvate de sodium 100 mM, et 5 ml 100x MEM acides aminés non essentiels.
- Pour préparer complète TSM avec des facteurs de croissance, ajoutez les suppléments suivants à base de TSM: 50x B27 Supplément Minus vitamine A (01h50), facteur de croissance épidermique humain (H-EGF, 20 ng / mL), des fibroblastes humains Growth Factor (H- FGF 20 ng / mL), de l'homme AA facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-H-AA, 10 ng / mL),Dérivé des plaquettes BB du facteur de croissance (H-PDGF-BB, 10 ng / mL) humaines, et une solution d'héparine (2 mg / ml).
- Prérefroidissement une centrifugeuse de laboratoire équipé d'un rotor oscillant seau à 4 ° C.
3. Mechanical Dissociation
- Transférer le tissu dans un 100 mm x 20 mm plat haute paroi de culture cellulaire. Retirer les restes de médias de l'expédition et le remplacer par 10 - 15 ml de milieu de culture froide.
- En utilisant les pinces hémostatiques courbées pour saisir une lame de rasoir, mâche le tissu finement tout en éliminant les vaisseaux sanguins apparents ou meninges.
NOTE: Les fragments de tissus finaux devraient être inférieure à 1 mm (voir la figure 1B). - Transférer le tissu dans un tube propre mL 50 conique. Laver la boîte de culture cellulaire avec un ml de milieu de culture froid supplémentaires 5 et transférer au tube conique. Répétez cette étape si nécessaire de lavage pour transférer le tissu restant.
- En utilisant une pipette sérologique de 10 mL, triturer doucement (4 - 5 fois). Autoriser les grandes tissdes fragments Ue par rapport à déposer au fond du tube. Si nécessaire, centrifuger brièvement l'échantillon pendant 1 min (350 x g, 4 ° C).
- Recueillir la fraction dissociées mécaniquement.
- Eliminer le surnageant et le filtrer à travers un filtre de 100 um dans un nouveau tube de 50 ml conique étiqueté "dissociation mécanique". Inversez le filtre sur le tube conique originale et laver avec des milieux de culture pour récupérer des fragments de tissus.
- Centrifuger la fraction "dissociation mécanique" pendant 5 min (350 x g, 4 ° C).
- Retirer le surnageant de la fraction pastillé "Dissociation mécanique" et resuspendre le tissu dans les milieux de culture froide. S'il y a plus de 5 mL de tissu dans le tube conique "Dissociation mécanique", diviser le tissu dans 50 mL d'autres tubes coniques de telle sorte que le tube ne possède plus de 5 ml de tissu.
- Stocker la fraction mécaniquement dissociée sur la glace jusqu'à ce que l'étape de centrifugation de gradient de saccharose (Step 5). Alternativement, la fraction mécaniquement dissociée peut passer à l'étape 5 pendant la période d'incubation de dissociation enzymatique (étape 4.4).
4. Enzymatic Dissociation
- S'il y a plus de 5 ml de tissu dans le tube contenant les fragments de tissus plus gros restants, diviser le tissu dans d'autres nouveaux tubes de 50 ml coniques de telle sorte que le tube ne possède plus de 5 ml de tissu.
- Centrifuger le tube conique (s) contenant des fragments de tissus restants pendant 5 min (350 x g, 4 ° C).
- Eliminer le surnageant et ajouter la solution de digestion enzymatique préchauffée, de sorte qu'il y a une solution de digestion de 5 ml pour tous les tissus 1 ml (par exemple, une solution de digestion de 25 ml pour 5 tissu ml).
- Sceller les couvercles des tubes coniques avec un film de laboratoire et laisser incuber la réaction sur un agitateur à 37 ° C pendant 30 min.
- Après l'incubation, triturer les échantillons doucement (voir figure 1C).
- En utilisant une pipette sérologique de 10 mL,pipette l'échantillon et en baisse de 6 - 8 fois. Éviter de générer des bulles d'air excessives.
- Ajouter une pointe de pipette de 1000 pi à la fin de la pipette et triturer un supplément de 6 - 8 fois.
- Autoriser tous les morceaux restants de se déposer au fond du tube. Retirer et filtrer le surnageant avec les cellules encore en suspension à travers un filtre de 100 um dans un nouveau tube de 50 ml conique étiqueté "Enzymatic Dissociation" et de stocker sur la glace.
- Si des fragments de tissus importants demeurent, ajouter un supplément de 10 ml de HBSS avec le calcium et le magnésium pour les fragments et répéter les étapes 3.5.1 et 3.5.2. Filtrer cette solution finale à travers un filtre de 100 um dans le tube "Enzymatic Dissociation".
- Centrifuger le tube "Dissociation enzymatique" pendant 5 min (350 x g, 4 ° C) et continue à gradient de saccharose par centrifugation.
5. gradient de saccharose Centrifugation
- Si les échantillons sont toujours suspendues en solution, centrifuge pendant 5 min (350 x g, 4 ° C).
- Retirer le tissu du surnageant et remettre en suspension dans 20 ml de HBSS froid, sans calcium ni magnésium. Amener le volume à 25 ml au total avec HBSS froid.
- Ajouter lentement 25 M mL 1,8 solution de saccharose et le tube pour mélanger. Il en résulte un gradient de 0,9 M de saccharose.
- Centrifuger sans frein pendant 10 min (800 x g, 4 ° C). L' utilisation d' un frein de centrifugation va perturber le gradient et réduire le rendement (voir la figure 1D pour un exemple d'un échantillon avant et après centrifugation).
- Aspirer soigneusement les débris de myéline et autant une solution de saccharose que possible. Laver l'échantillon en ajoutant 30 mL froid HBSS sans calcium et de magnésium et en mélangeant doucement. Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 ° C).
6. ACK globules rouges Lysis
- Retirer le surnageant de lavage. Ajouter un tampon de lyse ACK 5 ml et remettre en suspension doucement le culot cellulaire, fait tourner le tube pendant 1 min à température ambiante.
- Stopper la lyse en ajoutant 30 mL froid HBSS sans calcium et le magnésium.
- Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 ° C).
7. Initial Maintenance Culture
- Remettre en suspension les culots cellulaires finales dans 10 - 15 ml chaud complet TSM avec des facteurs de croissance et de quantifier la densité de cellules viables sur un hémocytomètre en utilisant l'exclusion du bleu trypan.
NOTE: La gamme de cellules viables est très variable selon les circonstances du don de tissus, et la quantification peut être difficile à ce stade précoce en raison de débris cellulaires restants. Dans un cas idéal, le but d'avoir un million de cellules vivantes par échantillon. Dans le cas où un excès de débris reste, la plaque à une densité inférieure dans un flacon T175. - Transférer les suspensions cellulaires finales dans un nouveau flacon de culture T75. Pic de facteurs de croissance supplémentaires tous les jours pour maintenir le niveau global du facteur de croissance et de surveiller le développement de neurosphères de cellules tumorales (voir la figure 1E et figure 2).
- Sinon, le processus des cellules dissociées enzymatiquement pour une analyse plus poussée, y compris de cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence.
- Après le développement de neurosphères (qui prend en moyenne 3 - 4 semaines, mais varie de quelques jours à tant que 2 mois), le filtre inverse l'échantillon en utilisant un filtre à mailles de nylon de 100 um pour réduire la quantité de débris.
NOTE: Le filtrat doit être maintenu dans la culture en cas des cellules individuelles viables ou de petites sphères sont présentes. - Assurer l'intégrité et la pureté de la culture en réalisant des empreintes génétiques tout en repiquage, en comparant à l'échantillon initial du patient.
Representative Results
Le protocole décrit se résume comme un flux de travail en cinq étapes avec des images de tissus à différents stades de traitement de la figure 1. L'échantillon est d'abord obtenu par autopsie stérile rapide. Au cours de la dissociation mécanique, le tissu est hachée, tout en éliminant les vaisseaux sanguins et les méninges de l'échantillon, et filtré à travers un filtre à mailles de nylon de 100 um. les fragments de tissu restants sont dissociées par voie enzymatique dans un four de réchauffage. Ensuite, les débris sont réduits par centrifugation sur gradient de saccharose, l'isolement d'une couche distincte de la myéline à partir de l'échantillon. En outre, la lyse ACK réduit visiblement la quantité de globules rouges présents dans l'échantillon. Enfin, les cellules sont étalées dans du milieu sans sérum supplémenté avec des facteurs de croissance.
La figure 1 supplémentaire est un exemple de la tumeur à l' autopsie. La tumeur se développe comme une infiltration diffuse de l'pons uned les régions voisines du tronc cérébral. Pendant la préparation des échantillons, de petits morceaux ~ 1 cm x 1 cm doivent être coupés et immédiatement placés dans un milieu froid d'expédition sur la glace.
La figure 2 montre divers exemples de la manière dont les échantillons peuvent apparaître dès les premiers stades de la mise en culture d'une culture solide. Initialement plaqué et au début des cultures (A, B) souvent ne semblent pas contenir de nombreuses cellules survivantes. En outre, les amas cellulaires précoces (C, D) ne présentent pas souvent le degré de contraste généralement associés à des neurosphères. Notamment, la durée du temps dans la culture avant l'apparition des amas de cellules peut prendre des semaines à quelques mois. Cependant, le passage initial de ces amas de cellules, combinée à un filtrage inverse des amas de cellules, permet d'isoler les cellules tumorales en bonne santé qui sont capables de former des sphères (F). Le filtrat (E) contient typiquement restes de débris; cependant, nous vous recommandons de placage et de maintenir le filtrat et le suivi des le développement des grappes de cellules. Ces échantillons provenant de patients peuvent ensuite être maintenues en culture pendant plusieurs passages (G, H).
La figure 3 montre la capacité de ces cellules à être xénogreffe chez la souris. Dans chacun de ces cas, les cellules DIPG ont été transfectées avec un journaliste de la GFP-luciférase pour surveiller le développement des tumeurs par bioluminescence (A). Les tumeurs peuvent également être examinés histologiquement, par exemple pour observer la prise de greffe de la tumeur (B) ou l'expression de marqueurs spécifiques (C). Ces modèles in vivo, combinés avec des tests in vitro peuvent être utilisés pour évaluer les effets de divers médicaments ou de manipulations génétiques (par exemple, 8, 9, 10, 11, 14).
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Figure 1. Les échantillons de tissus à différentes étapes du traitement. (A) Obtenir l'échantillon grâce à des procédures d' autopsie stériles et expédition durant la nuit sur de la glace. (B) De gauche à droite: (rangée 1) des tubes contenant le tissu tumoral dans les milieux d'expédition; tissu frais dans x 20 mm boîte de culture cellulaire de 100 mm; émincer initiale du tissu; (Ligne 2) de tissu partiellement hachée; élimination des méninges et des vaisseaux sanguins; taille finale des morceaux de tissu émincé. (C) De gauche à droite: (rangée 1) tissus incubés sur une table rotative dans un four à 37 ° C; (Ligne 2) trituration du tissu à travers une pointe de pipette 1000 pi attaché à une pipette 10 ml; le filtrage du tissu dissocié à travers un filtre à mailles de nylon de 100 um. (D) De gauche à droite: un tissu dissocié en suspension dans 0,9 M solution de saccharose avant centrifugation; tissu dissocié séparés sur un gradient de saccharose après centrifugation; une couche visible of débris de myéline au-dessus du gradient de saccharose; un culot cellulaire final après ACK lyse et lavage. (E) L'échantillon final peut être placé dans la culture ou utilisé dans d' autres analyses en aval. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Images des cultures primaires et cellules Passage précoce. (A - B) Cultures ensemencées immédiatement après dissociation (SU-DIPG-XXX, A), ou qui ne sont pas encore poussé neurosphères (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) apparition précoce de neurosphères dans des cultures primaires de SU-DIPG-XXVIII (C) et SU-DIPG-XXIX (D). (EF) du premier passage de la culture primaire de D à l'aide d'un filtre en nylon de 100 um, avec le fifiltrat (E) et le filtrat inverse (F) plaqués. (G - H) neurosphères matures du premier passage du SU-DIPG-XXVII (G) et le troisième passage de SU-DIPG-XXV (H) de plus en plus dans la culture. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Cultures cellulaires dérivées de patients peuvent engraft et former des tumeurs chez les souris. Les images (A) bioluminescence de quatre cultures de cellules provenant de patients différents transfectées avec un rapporteur GFP-luciférase. (B) section sagittale d'une xénogreffe de souris, montrant des cellules tumorales greffées dans les pons de souris. Vert: GFP, Rouge: protéine de base myéline. Barre d'échelle = 1 mm. (C) Exemple immunofluoresl'image cence montrant les cellules tumorales GFP greffées dans le cerveau de la souris. Bleu: DAPI, Vert: GFP, Rouge: IGF2R. Barre d'échelle = 40 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1. Echantillon Autopsie d'une tumeur Pontine. apparition post-mortem immédiate d'un pontique intrinsèque gliome diffus. La tumeur apparaît comme une masse sur la face ventrale de la protubérance, la myéline riche. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette image.
Discussion
Ce protocole décrit un procédé de traitement rapide de la post-mortem des dons de tissus tumoraux pour développer des cultures de cellules dérivées du patient, qui peut être utilisé dans une variété d'études in vitro ou dans des expériences in vivo. En raison de la nature de travailler avec des échantillons d'autopsie, le maintien de la viabilité échantillon pose un défi de taille. Plusieurs facteurs, y compris l'intervalle post-mortem à l'autopsie ou le temps nécessaire pour le transport du tissu, doivent être réduits au minimum, autant que possible, mais sont souvent difficiles à contrôler. Dans notre expérience, un intervalle post-mortem de moins de 6 - 8 h (à partir du moment de la mort à la fois que le tissu est placé dans la glace expédition à froid et les médias de transport) a donné la meilleure chance d'établir une culture cellulaire durable. Il est préférable de recevoir ensuite le tissu dans le laboratoire dans les 24 h, et le traiter pour la culture dès réception.
Etant donné que l'emplacement de ces rares cas, est très variable, etla qualité de l'étape de récupération des tissus affecte fortement les chances de succès, la logistique de réaliser l'autopsie peut être difficile. Dans de nombreux cas, afin d'obtenir le laps de temps de 6-8 heures, il est impossible d'effectuer la récolte des tissus dans un centre académique. Au lieu de cela, d'avoir un service de récupération de tissus sur appel pour récupérer le tissu tumoral à la maison funéraire en vertu d'un protocole IRB approuvé est souvent plus utile pour la récupération des tissus. L'obtention du consentement éclairé à l'avance de la mort est recommandée et facilite la planification logistique. Préparation de kits d'autopsie autonomes avec des instructions claires et approfondies et des fournitures stériles pour le prélèvement de tissu (gants, des rideaux, des scalpels) est fortement recommandé. En outre, l'établissement de points de communication claires entre l'enquêteur, pathologiste, et la maison funéraire est critique. Par exemple, l'enquêteur doit discuter du protocole avec le médecin avant l'autopsie, et mettre en évidence les erreurs courantes. Ces erreurs comprennent microcontamination BIAL (habituellement de levure) lors de la récupération des tissus, le défaut de livrer jusqu'à l'expédition durant la nuit / accéléré et l'incapacité à expédier l'échantillon sur la glace mouillée suffisante dans un récipient métaliques. Enfin, nous vous recommandons d'utiliser un service de messagerie de porte-à-porte pour l'expédition de l'échantillon pour réduire au minimum le temps de transport.
Des précautions doivent également être prises lors de la dissociation des tissus pour préserver la viabilité des cellules. Par exemple, l'utilisation des médias visant à préserver la santé de tissu neural pour le transport (Hibernate-A complété par antibiotique / antimycosique) augmentera les chances de générer une culture réussie. Il est également important de garder l'échantillon à une température froide à travers le protocole en transférant toujours les échantillons sur la glace. Collecte les deux fractions de dissociation mécaniques et enzymatiques ainsi minimiser la trituration peut améliorer la réussite du protocole, car les deux étapes sont traumatisants pour les cellules. Dans notre expérience, alors que la plupart des cultures réussies se développent sur les deux fractions, Nous avons eu des cas où un seul des deux préparations mis en place une culture durable, potentiellement reflétant la nature délicate de ces échantillons. Une autre étape traumatique dans le protocole est trituration; une stratégie qui peut réduire le degré de trituration nécessaire est d'assurer que les échantillons soient bien hachés au début de la préparation. D' autres exemples d'aspects du protocole visant à améliorer la viabilité de l' échantillon comprennent des tampons d' addition (par exemple, HEPES) dans tout le protocole, qui est particulièrement critique lors de la dissociation enzymatique.
Une éventuelle modification de ce protocole pour augmenter encore la viabilité des cellules est l'élimination du sang rouge lyse cellulaire étape ACK. Cependant, dans ce cas, il est alors souvent nécessaire d'effectuer une étape de lyse ACK pendant la première semaine de culture pour éliminer les cellules sanguines rouges. Un autre aspect de ce protocole qui peut être modifié est l'élimination de la myéline et les débris cellulaires en utilisant un densit sucrosey dégradé. Plus précisément, d' autres stratégies qui ont été signalés pour améliorer la viabilité cellulaire des cellules microgliales sont également possibles à cette étape, comme un gradient discontinu de densité Percoll 18 ou magnétiques perles d'enlèvement de la myéline.
Enfin, la durée entre la dissociation initiale du tissu et l'apparition de neurosphères varie entre les échantillons et peut durer d'une semaine à un mois ou plus. Étant donné que les cultures initiales contiennent typiquement un degré important de cellules mortes et les débris cellulaires, il peut être difficile de déterminer si les cellules viables restent; la culture doit être maintenue pendant au moins 4 - 8 semaines (figure 2). Une stratégie pour isoler les cellules en croissance à partir des débris restants est présenté ici (c. -à inverser le filtrage des amas de cellules et re-placage dans des milieux frais). La décision sur l'opportunité de continuer à maintenir une culture est finalement une décision au cas par cas en fonction de facteurs environnants ee autopsie (par exemple, un intervalle post - mortem prolongée, des problèmes pendant le transport des tissus), la dissociation des tissus (par exemple, le sang excessive ou des débris), et comment l'échantillon apparaît dans la culture. Une fois que la culture est établie, l'identité doit être validée par les empreintes d'ADN en utilisant une analyse courte répétée en tandem ou un procédé similaire, en comparant la culture d'un échantillon de la tumeur d'origine conservé à cet effet. Nous vous recommandons de valider systématiquement les cultures par les empreintes génétiques pour garantir l'absence de contamination par d'autres cultures a eu lieu, par exemple, tous les 3 - 6 mois.
La génération de ces cultures de DIPG provenant de patients représente une étape importante dans le succès du développement de thérapies efficaces. L'expansion des modèles disponibles sur le patient provenant des cultures de DIPG et xénogreffes sera essentielle pour identifier les stratégies thérapeutiques les plus efficaces et de surmonter finalement cette maladie dévastatrice.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le soutien de la Fondation McKenna Claire, Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NINDS K08NS070926 et R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 et RN3-06510), Lemonade Alex Support Foundation, The Cure Starts Now Foundation et DIPG collaborative, Fondation Lyla Nsouli, Cancer pédiatrique Unravel, Tumor Foundation Enfance cerveau, Fondation Matthew Larson, Fondation V, Fonds de la famille Godfrey à la mémoire de Fiona Penelope, la Fondation Wayland Villars DIPG, Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, et Jennifer Kranz Fonds Memorial, Fondation N8, Virginie et Fonds Ludwig DK for Cancer Research, Institut de recherche sur la santé des enfants à Stanford Anne T. et Robert M. Bass Endowed Faculté de bourses d'études en pédiatrie Maladies cancéreuses et de sang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
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