Summary
Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.
Abstract
Difusa Intrínseca Pontine glioma (DIPG) é um tumor do tronco cerebral na infância que carrega um prognóstico universalmente fatal. Porque a ressecção cirúrgica não é uma estratégia terapêutica viável e biópsia não é rotineiramente realizado, a disponibilidade de amostras de doentes para a pesquisa é limitado. Consequentemente, os esforços para estudar esta doença foram desafiados por uma escassez de modelos de doenças fiéis. Para endereçar esta necessidade, descrevemos aqui um protocolo para o rápido processamento de amostras de tecido da autópsia post mortem, a fim de gerar modelos de cultura de células derivadas de pacientes duráveis que podem ser utilizados em ensaios in vitro ou in vivo de xenoenxertos de experiências ortotópicos. Estes modelos podem ser utilizados para pesquisar potenciais alvos de drogas e estudar processos pathobiological fundamentais dentro DIPG. Este protocolo pode ainda ser estendido para isolar e analisar as células tumorais e usando microambiente celular activada por fluorescência (FACS), que permite a análise subsequente do gene expression, a expressão da proteína, ou modificações epigenéticas do DNA na célula granel ou nível de uma única célula. Finalmente, este protocolo pode também ser adaptado para gerar culturas derivadas de pacientes de outros tumores do sistema nervoso central.
Introduction
DIPG é uma doença maligna nervoso central agressivo sistema que surge na ponte ventral, normalmente em meados de infância 1, 2. Apesar de décadas de ensaios clínicos, o tratamento corrente é limitada a radioterapia, o que proporciona uma melhoria temporária ou estabilização dos sintomas e só prolonga a sobrevivência mediana por uma média de 3 meses. Mesmo com a radioterapia, a sobrevida global mediana é de apenas 9 meses, com 90% das crianças que morrem da doença no prazo de 2 anos após o diagnóstico inicial. Devido à natureza infiltrante do tumor e as funções críticas do tronco cerebral, a ressecção cirúrgica não é possível. Além disso, nos Estados Unidos, a obtenção de biópsias cirúrgicas para DIPG não tem historicamente sido realizada 3, como análise histopatológica não tem nenhum papel corrente na orientação do tratamento clínico e diagnóstico pode tipicamente ser feita por neuroimagens sozinho. Assim, a disponibilidade de tecido de tumor fou o estudo é restrito, limitando os esforços para realizar pesquisas sobre as moléculas da droga candidatos e a biologia do tumor subjacente. Notavelmente, melhorias nas técnicas de neuroimagem e estereotaxia, têm permitido o desenvolvimento de biópsias seguros de DIPG nos últimos anos 4, que, quando combinado com avanços na biologia molecular, têm transformado nossa compreensão da doença. Atualmente, vários estudos clínicos com biópsia inicial e perfil molecular de DIPG para a individualização de planos de tratamento estão em curso (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG e outros gliomas de alto grau pediátricos representam doenças distintas de seus colegas de adultos com glioblastoma 6, 7 e modelos experimentais, assim, fiéis de DIPG são necessários para entender sua fisiopatologia única e descobrir estratégias terapêuticas eficazes. Nos últimos anos, concentrou esforços para obter tumor DIPG tproblema para a investigação no momento da autópsia ou, menos comumente, a biópsia revolucionaram a nossa compreensão e capacidade de estudar DIPG. Esforços de sequenciamento de todo o genoma revelou uma mutação recorrente na histona H3, 3A família (H3F3A) e cluster de histonas 1, H3b (HIST1H3B), o que representa o primeiro exemplo de doença humana causada por mutações no histona de codificação de proteínas 8, 9, 10, 11 . Além disso, um subconjunto de DIPGs expressa mutações no gene ACVR1, que não tenham sido previamente reportados em câncer, mas são idênticas às mutações encontradas no congênita infância developmental disorder fibrodisplasia ossificante progressiva 8, 9, 10, 11. Assim, as primeiras culturas de células DIPG derivadas de pacientes e mo xenotransplante ortotópicodels agora foram estabelecidos 1, 2, 12, 13, 14, bem como modelos de ratinho estabelecidas através do xenotransplante directa de células tumorais em ratinhos imunodeficientes para gerar os xenoenxertos de série 3, 14, 15. Esforços de pesquisa de fármacos iniciais utilizando esses modelos derivados do paciente identificaram novos agentes promissores para a tradução clínica 4, 14 e lançaram as bases para pelo menos um ensaio clínico (NCT02717455).
Estes primeiros passos no sentido do progresso são apenas o começo, e numerosas amostras de tecido derivadas de pacientes e modelos de cultura será necessário definir os subtipos da doença e desenvolver as estratégias terapêuticas mais eficazes. geneticamente motormodelos de rato recer de DIPG também facilitará estudos destinados a aprofundar a nossa compreensão básica da doença. Os esforços feitos para gerar modelos genéticos para DIPG será auxiliado pelos estudos genômicos fundamentais discutidos acima, mas, actualmente, um número limitado de opções estão disponíveis. Um tal modelo, o que gera os gliomas do tronco cerebral de alto grau histologicamente semelhantes, utiliza o viral RCAS / televisão de um sistema para dirigir a sobre-expressão de PDGF-B e perda INK4A-IRA em células nestina-positivas na fossa posterior de ratinhos neonatais 5, 16. Outra abordagem envolve recapitulando vários grandes mutações associadas à DIPG (mutação K27M histona H3.3, perda de p53 e ativação PDGFRA) em células precursoras neurais derivadas de células-tronco embrionárias humanas, o que é suficiente para tornar essas células tumorigénicas 6, 7, 17. A combinação de métodos genéticos e paciente-derivmodelos ed permitirá testes pré-clínicos e promover o desenvolvimento de terapias eficazes.
Para enfrentar os desafios à investigação DIPG detalhado acima, este protocolo de autópsia rápida foi desenvolvido para gerar culturas de células derivadas de pacientes para investigação 8, 9, 10, 11, 12, 14. O protocolo destina-se a proteger a viabilidade do tecido e maximizar a probabilidade de gerar culturas duráveis, apesar dos desafios associados com intervalos post mortem estendidos e tempo de transporte. Quando gerado com êxito, estas culturas DIPG pode ser usado em subsequentes manipulações in vitro e em experiências de xenoenxerto in vivo, permitindo a avaliação de potenciais moléculas terapêuticas sobre as células derivadas do paciente.
Protocol
Este protocolo foi realizada com a aprovação do nosso conselho de revisão institucional com adequada de-identificação de todos os dados do paciente e de acordo com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Obter toda a aprovação apropriada Institutional Review Board e consentimento informado de família do paciente antes de trabalhar com este protocolo.
1. obtenção de amostras de tecido
NOTA: Um elemento fundamental deste protocolo exige um tratamento adequado da doação do tecido começando imediatamente no momento da autópsia. A viabilidade global da amostra depende significativamente minimizando o intervalo pós-morte (PMI), imediatamente a transferência do tecido no meio frio apropriado suplementado com antibióticos / antimicóticos, mantendo a amostra em gelo húmido durante todo o transporte e manutenção técnica estéril durante todo o protocolo.
- Após a notificaçãode uma doação iminente, preparar um kit de coleta de amostra. Usando uma caixa de transporte com um recipiente isolado que pode ser usado diretamente para o transporte de retorno da amostra de tecido, incluir os seguintes materiais:
- Incluem materiais para preparação estéril, incluindo luvas estéreis, cortinas e bisturis.
- Incluir 8 - 10 estéreis de 50 mL tubos cônicos contendo 30 meios de transporte ml no recipiente isolado com gelo ou compressas frias.
NOTA: Embora qualquer meio de cultura de células padrão pode trabalhar, a melhor viabilidade amostra é obtida com Hibernate-A suplementado com antibiótico / antimicótico. - Incluem quaisquer tubos de amostra para outras análises (por exemplo, fixadores).
- Se a autópsia não será realizada no local do investigador, incluir um documento que indique claramente a forma de recolher a amostra de tumor. Isto inclui detalhes tais como a manutenção da esterilidade, mantendo os tubos de amostra em gelo molhado, e incluindo amostras do mesencéfalo e medula como TUmor células muitas vezes invadem essas regiões.
- Manter a esterilidade durante a autópsia. Considere o cérebro estéril dentro do crânio, por isso observar uma técnica estéril (incluindo mudança luvas) uma vez que o crânio é aberto. Evitar contaminação com a pele e o cabelo é crítica.
- Dissecar o tumor a partir do lado ventral (o "ventre" da ponte, ver Suplementar Figura 1). Com um bisturi estéril, cortar pequenos pedaços 1 cm do tumor e transferir imediatamente para o meio de transporte a frio (ver nota no passo 1.1.2) e colocar em gelo molhado. Colocar 10 ml de tecido a cada tubo, resultando num volume final de tecido e meios de comunicação em cada tubo de 40 ml.
NOTA: No caso de DIPG, o tumor difusamente infiltra ponte e frequentemente o resto do tronco cerebral. Como tal, recolher o máximo da amostra quanto possível, tipicamente incluindo 3 - 4 tubos (30 - 40 ml) de tecido de ponte e 1 - 2 tubos (10 - 20 ml cada) de tecido de mesencéfalo e medula. - Recolha sampios do mesencéfalo e medula justaposta à ponte, que muitas vezes contêm muitas células tumorais.
- Após a coleta da amostra, enviar as amostras O / N sobre gelo molhado no recipiente isolado. Não envie a amostra em gelo seco, como congelamento vai matar as células.
2. Preparação para o processamento da amostra
- Antes do início da preparação da amostra, esterilizar capuzes de cultura de tecidos juntamente com lâminas de barbear, pinças hemostáticas curvas, e quaisquer outros instrumentos não esterilizados sob luz UV durante 1 h. Executar todas as etapas seguintes, em condições estéreis para evitar contaminação das culturas.
- Preparar e soluções de filtros estéreis.
- Para preparar a solução 1,8 M de sacarose, dissolve-se 308,07 g de sacarose em 300 ml de água destilada. Adicionar 50 ml de 10x Hank's-tamponada Solução Salina (HBSS) sem magnésio ou cálcio e perfazer o volume total a 500 mL com água destilada. Armazenar a 4 ° C.
- Para preparar solução de digestão enzimática, tome 50 mL de HBSS com cálcio e magnésio para cada 10 mL de tecido moído e adicionar 500 mL de 5 mg / mL de desoxirribonuclease I (concentração final de 50 ug / ml), 500 ul de 2,5 mg / colagenase ml I / II e solução de dispase (concentração final 25 ug / ml), e 500 mL de 1 M de tampão HEPES. solução de digestão Pré-aquecer num banho de água a 37 ° C.
- Para preparar meios base do caule do tumor (TSM), misturar 250 ml Neurobasal-A, Modified Eagle Médium da 250 mL Dulbecco: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 mL de 100 x antibiótico-antimicótico, 5 mL de 200 mM de L-alanil-L- dipéptido glutamina (GlutaMAX-A), 5 mL de tampão de HEPES, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, e 5 mL de 100 x MEM aminoácidos não essenciais.
- Para preparar completa TSM com fatores de crescimento, adicione os seguintes suplementos para a base TSM: 50x B27 Suplemento Minus vitamina A (1:50), fator de crescimento epidérmico humano (H-EGF, 20 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos humanos (H- FGF, 20 ng / mL), AA humano derivado de plaquetas do factor de Crescimento (H-FCDP-AA, 10 ng / mL),humano derivado de plaquetas BB do Factor de Crescimento (H-FCDP-BB, 10 ng / mL), e solução de heparina (2 ug / mL).
- Pré-arref ecimento de uma centrifugadora de laboratório equipado com um rotor de balde a 4 ° C.
3. mecânica dissociação
- Transferir o tecido em um prato de paredes alta-100 mm x 20 milímetros de cultura de células. Remover restos de mídia a partir de transporte e substituir por 10 - 15 mL meio de cultura frio.
- Usando as hemostats curvas para agarrar uma lâmina de barbear, mediu o tecido finamente ao remover os vasos sanguíneos óbvios ou meninges.
NOTA: Os fragmentos de tecido finais deve ser inferior a 1 mm (ver Figura 1B). - Transferir o tecido para um tubo cónico limpo de 50 mL. Lave o prato de cultura de células com um 5 ml de meio de cultura frio adicionais e transferir para o tubo cônico. Repita este passo de lavagem, conforme necessário para transferir o tecido restante.
- Usando uma pipeta serológica 10 mL, triturar suavemente (4 - 5 vezes). Permitir TISS maioresfragmentos ue a depositar-se no fundo do tubo. Se necessário, Centrifugar brevemente a amostra durante 1 min (350 xg, 4 ° C).
- Recolher a fracção dissociado mecanicamente.
- Remover o sobrenadante e filtra-se através de um filtro de 100 um para um novo tubo cónico de 50 ml rotulados "mecânica dissociação." Inverter o filtro sobre o tubo cónico original e lava-se com meio de cultura para recuperar os fragmentos de tecido.
- Centrifugar a fracção "mecânica dissociação" durante 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Remover o sobrenadante a partir da fracção sedimentada "mecânica dissociação" e ressuspender o tecido em meio de cultura frio. Se houver mais do que 5 ml de tecido na "mecânica dissociação" tubo cónico, dividir o tecido em outros tubos cónicos de 50 mL de tal modo que nenhum tubo tem mais do que 5 ml de tecido.
- Armazenar a fracção dissociado mecanicamente em gelo até que o passo de centrifugação em gradiente de sacarose (SteP 5). Alternativamente, a fração mecanicamente dissociado pode prosseguir para a Etapa 5 durante o período de incubação de dissociação enzimática (Passo 4.4).
4. enzimática dissociação
- Se houver mais do que 5 ml de tecido no tubo contendo os restantes fragmentos de tecido maiores, dividir o tecido em outros novos tubos de 50 mL cónico de tal modo que nenhum tubo tem mais do que 5 ml de tecido.
- Centrifuga-se o tubo (s) cónico que contém os fragmentos de tecido restantes, durante 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Remover o sobrenadante e adicionar a solução de digestão enzimática pré-aquecida, de tal modo que há 5 mL de solução de digestão de cada tecido 1 ml (por exemplo, 25 mL de solução de digestão de 5 mL de tecidos).
- Selar as tampas tubo cónico com filme de laboratório e incubar a reacção num rotor a 37 ° C durante 30 min.
- Após a incubação, as amostras de triturar suavemente (ver Figura 1C).
- Usando uma pipeta serológica 10 mL,pipeta a amostra cima e para baixo 6 - 8 vezes. Evitar a geração de bolhas de ar em excesso.
- Adicionar uma ponta de pipeta 1000 uL à extremidade da pipeta e tritura-se um adicional de 6 - 8 vezes.
- Permitir que qualquer pedaços restantes para assentar no fundo do tubo. Remover o sobrenadante e filtra-se com as células ainda em suspensão através de um filtro de 100 um para um novo tubo cónico de 50 ml rotulados "dissociação enzimática" e armazenar em gelo.
- Se fragmentos de tecido significativos permanecem, adicione um adicional de 10 mL HBSS com cálcio e magnésio para os fragmentos e repita os passos 3.5.1 e 3.5.2. Filtrar esta solução final através de um filtro de 100 um para o tubo "dissociação enzimática".
- Centrifuga-se o tubo de "dissociação enzimática" durante 5 min (350 xg, 4 ° C) e continuar a centrifugação em gradiente de sacarose.
5. centrifugação em gradiente de sacarose
- Se as amostras ainda estão suspensas na solução, centrifuGE durante 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Remover o sobrenadante e ressuspender o tecido em 20 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio. Levar o volume até 25 mL total, com HBSS frio.
- Lentamente, adicionar mL 1,8 M solução a 25 sacarose e inverter o tubo para misturar. Isso resulta em um gradiente de 0,9 M de sacarose.
- Centrifugar sem travão durante 10 min (800 xg, 4 ° C). Usando um travão de centrifugação vai perturbar o gradiente e reduzir o rendimento (ver Figura 1D para um exemplo de uma amostra antes e após a centrifugação).
- Cuidadosamente aspirar detritos de mielina e, tanto quanto possível solução de sacarose. Lava-se a amostra por adição de 30 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio e misturando suavemente. Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C).
A lise celular 6. ACK Red Blood
- Remover o sobrenadante de lavagem. Adicionar 5 mL de tampão de lise ACK suavemente e ressuspender o sedimento de células, rodando o tubo durante 1 min à temperatura ambiente.
- Extingue-se a lysis por adição de 30 ml de HBSS fria, sem cálcio e magnésio.
- Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C).
7. Cultura de manutenção inicial
- Ressuspender as pelotas de células final em 10 - 15 mL quente TSM completa com fatores de crescimento e quantificar a densidade de células viáveis num hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano.
NOTA: O intervalo de células viáveis varia muito, dependendo das circunstâncias da doação do tecido, e quantificação pode ser difícil nesta fase inicial devido aos restos celulares restante. Em um caso ideal, ter o objectivo de um milhão de células vivas por amostra. Em casos onde os detritos excessivos permanece, em placas a uma densidade inferior num frasco T175. - Transferir as suspensões de células final para um novo frasco de cultura T75. Pico em factores de crescimento adicionais cada outro dia para manter os níveis gerais de factores de crescimento, e para monitorizar o desenvolvimento de neuroesferas de células tumorais (ver Figura 1E e Figura 2).
- Alternativamente, as células de processo enzimaticamente dissociada para análise posterior, incluindo citometria de fluxo e classificação de células activada por fluorescência.
- Após o desenvolvimento das neuroesferas (que leva em média 3 - 4 semanas, mas varia de poucos dias para tão longo como dois meses), inverter o filtro de amostra usando um filtro de malha de nylon de 100 fim de reduzir a quantidade de detritos.
NOTA: O filtrado devem ser mantidas em cultura em caso de células individuais viáveis ou pequenas esferas estão presentes. - Garantir a integridade e a pureza da cultura através da realização de impressões digitais de DNA enquanto passaging, em comparação com a amostra inicial do paciente.
Representative Results
O protocolo descrito pode ser resumido como um fluxo de trabalho de cinco passos com imagens de tecido em vários estágios de processamento da Figura 1. A amostra é primeiramente obtida através de rápida autópsia estéril. Durante a dissociação mecânica, o tecido é triturado durante a remoção das meninges e vasos sanguíneos a partir da amostra, e filtrou-se através de um filtro de malha de nylon de 100 um. Os restantes fragmentos de tecido são enzimaticamente dissociada em um forno de aquecimento. Em seguida, os resíduos são reduzidos através de centrifugação em gradiente de sacarose, o isolamento de uma camada distinta da mielina a partir da amostra. Além disso, a lise ACK reduz visivelmente a quantidade de glóbulos vermelhos presentes na amostra. Finalmente, as células são plaqueadas em meio isento de soro suplementado com factores de crescimento.
Suplementar Figura 1 é um exemplo do tumor após autópsia. O tumor cresce como uma infiltração difusa da uma ponted as regiões adjacentes do tronco cerebral. Durante as preparações de amostra, pequenos pedaços de ~ 1 cm x 1 cm deve ser cortado e colocado imediatamente em meios de transporte de água fria em gelo.
A Figura 2 mostra diversos exemplos de como as amostras podem aparecer a partir das fases iniciais de cultura de uma cultura durável. Inicialmente chapeado e culturas primitivas (A, B) muitas vezes não parecem conter muitas células sobreviventes. Além disso, agrupamentos de células precoces (C, D), muitas vezes não exibem o grau de contraste tipicamente associados com neuroesferas. Notavelmente, a duração de tempo em cultura antes do aparecimento de agregados de células pode levar semanas a alguns meses. No entanto, a passagem inicial destes aglomerados de células, combinado com filtragem inversa de cachos de células, pode isolar as células tumorais saudáveis que são capazes de formar esferas (F). O filtrado (E) normalmente contém restos de detritos; No entanto, recomendamos revestimento e mantendo o filtrado e monitoramento para o desenvolvimento de aglomerados de células. Estas amostras derivadas do paciente podem então ser mantidas em cultura durante várias passagens (G, H).
A Figura 3 demonstra a capacidade destas células para ser xenoenxertado em ratinhos. Em cada um destes casos, as células foram transfectadas com DIPG um repórter GFP-luciferase para monitorar o desenvolvimento dos tumores por meio de bioluminescência (A). Os tumores também podem ser analisados histologicamente, por exemplo, para observar o enxerto do tumor (B) ou a expressão de marcadores específicos (C). Estes modelos in vivo, combinados com os ensaios in vitro podem ser utilizados para avaliar os efeitos de várias drogas ou manipulações de genes (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 14).
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Figura 1. As amostras de tecido em vários estágios de processamento. (A) Obter a amostra através de procedimentos de autópsia estéreis e transporte de noite no gelo molhado. (B) Da esquerda para a direita: (linha 1) tubos contendo tecido tumoral em meio marítimo; tecido fresco em um prato de cultura de células de 100 milímetros x 20 mm; picagem do tecido inicial; (Linha 2) do tecido parcialmente picada; remoção de meninges e vasos sanguíneos; tamanho final das peças de tecido moído. (C) Da esquerda para a direita: (linha 1) tecidos incubados em uma mesa rotativa em um C forno de 37 °; (Linha 2) trituração do tecido através de uma ponta de pipeta 1000 mL ligado a uma pipeta de 10 mL; filtragem de tecido dissociado através de um filtro de malha de nylon de 100 um. (D) Da esquerda para a direita: tecido dissociado suspensas em solução 0,9 M de sacarose antes da centrifugação; tecido dissociado separado através de um gradiente de sacarose após a centrifugação; uma camada visível óf detritos mielina no topo do gradiente de sacarose; um sedimento celular final após lise ACK e lavagem. (E) A amostra final pode ser colocado em cultura ou utilizado em outras análises a jusante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens de culturas primárias e Células passagem precoce. (A - B) Culturas banhado imediatamente após dissociação (SU-DIPG-XXX, A), ou que não tenham crescido neurospheres ainda (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) aparecimento precoce de neurospheres em culturas primárias de SU-DIPG-XXVIII (C) e SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Primeira passagem da cultura primária a partir de D, utilizando um filtro de nylon de 100 um, com o filtrate (E) e filtrado inversa (F) banhado. (G - H) neurospheres maduros a partir da primeira passagem do SU-DIPG-XXVII (G) e a terceira passagem do SU-DIPG-XXV (H) que crescem na cultura. Barra de escala = 200 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. culturas de células derivadas do paciente pode Enxerte e formar tumores em camundongos. Imagens (A) bioluminescência de quatro culturas de células derivadas de pacientes diferentes transfectadas com um repórter GFP-luciferase. (B) Corte sagital de um xenotransplante de rato, mostrando células tumorais enxertados na ponte do mouse. Verde: GFP, Vermelho: proteína básica da mielina. Escala da barra = 1 mm. immunofluores (C) Exemploimagem cência mostrando células tumorais GFP enxertados em um cérebro de camundongo. Azul: DAPI, Verde: GFP, Vermelho: IGF2R. Barra de escala = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1. Amostra Autópsia de um tumor Pontine. Immediate aparência post-mortem de um glioma pontino intrínseca difusa. O tumor apresenta-se como uma grande massa, rico em mielina na superfície ventral da ponte. Por favor clique aqui para baixar esta imagem.
Discussion
Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de post-mortem doações de tecido de tumor para o desenvolvimento de culturas de células derivadas do paciente, que pode ser usada em uma variedade de ensaios in vitro ou in vivo. Devido à natureza de trabalhar com amostras de autópsia, mantendo a viabilidade da amostra representa um desafio significativo. Vários factores contribuem, incluindo o intervalo post mortem a autópsia ou o tempo necessário para o transporte do tecido, deve ser minimizado tanto quanto possível, mas muitas vezes são difíceis de controlar. Em nossa experiência, um intervalo pós-morte de menos de 6 - 8 h (desde o momento da morte até a hora que o tecido é colocado em transporte gelada e meios de transporte) rendeu a melhor chance de criar uma cultura de células durável. É melhor, então, receber o tecido no laboratório dentro de 24 h, e processá-lo para a cultura imediatamente após o recebimento.
Uma vez que a localização desses casos raros varia amplamente, ea qualidade da etapa de recuperação do tecido afecta fortemente a chance de sucesso, a logística de realizar a autópsia pode ser um desafio. Em muitos casos, a fim de atingir o período de tempo de 6-8 horas, não é viável para realizar a colheita de tecido num centro académico. Em vez disso, ter um serviço de recuperação de tecidos na chamada para recuperar o tecido do tumor na casa funerária no âmbito de um protocolo IRB-aprovado é muitas vezes mais conveniente para a recuperação de tecidos. Obtenção do consentimento informado antes da morte é recomendada e facilita o planejamento logístico. Preparar kits de autópsia independentes com instruções claras e completas e suprimentos estéreis para a recuperação do tecido (luvas, cortinas, bisturis) é fortemente recomendado. Além disso, o estabelecimento de pontos claras de comunicação entre o investigador, patologista, e funerária é crítica. Por exemplo, o investigador deve discutir o protocolo com o patologista antes da autópsia e destacar erros comuns. Esses erros incluem microcontaminação Bial (geralmente levedura) durante a recuperação de tecidos, insuficiência de escoar pela expedição e falha para enviar a amostra em gelo húmido suficiente em um recipiente thermoinsulated durante a noite / acelerada. Finalmente, recomendamos o uso de um serviço de correio porta-a-porta para a expedição da amostra para minimizar o tempo de transporte.
Cuidados também devem ser tomados durante a dissociação de tecidos para preservar a viabilidade celular. Por exemplo, o uso dos meios de comunicação concebido para preservar a saúde do tecido neural para o transporte (Hibernate-A suplementado com antibiótico / antimicótico) irá aumentar a chance de gerar uma cultura de sucesso. É também importante para manter a amostra a uma temperatura fria durante todo o protocolo de transferência sempre as amostras em gelo. Coleta de ambas as frações de dissociação mecânicos e enzimáticos, juntamente com minimizando trituração pode melhorar o sucesso do protocolo, como ambos os passos são traumáticas para as células. Em nossa experiência, enquanto a maioria das culturas bem sucedidas crescer fora de ambas as fracções, Tivemos casos em que apenas uma das duas preparações estabelecidas uma cultura durável, potencialmente, reflectindo a natureza delicada destas amostras. Outro passo traumática no protocolo é a trituração; uma estratégia que pode reduzir o grau de trituração é necessário para assegurar que as amostras são cuidadosamente triturada no início da preparação. Outros exemplos de aspectos do protocolo concebido para melhorar a viabilidade da amostra incluem tampões (por exemplo, adicionando, HEPES) ao longo do protocolo, o que é especialmente crítico durante a dissociação enzimática.
Uma possível modificação do presente protocolo para aumentar ainda mais a viabilidade das células é a remoção da etapa de lise de glóbulos vermelhos ACK. No entanto, neste caso, muitas vezes é então necessário efectuar uma etapa de lise ACK durante a primeira semana de cultura para eliminar as células vermelhas do sangue. Outro aspecto deste protocolo que pode ser modificado é a eliminação de mielina e detritos celulares usando uma densit sacarosegradiente y. Especificamente, outras estratégias que foram relatadas para melhorar a viabilidade celular de células microgliais também são possíveis nesta fase, tal como um gradiente descontínuo de Percoll 18 ou pérolas magnéticas de remoção da mielina.
Finalmente, a duração de dissociação entre o tecido inicial e o aparecimento de neuroesferas varia entre amostras e pode levar de uma semana a um mês ou mais. Uma vez que as culturas iniciais contêm tipicamente um grau significativo de células mortas e detritos celulares, pode ser um desafio para determinar se as células viáveis permanecem; a cultura deve ser mantida durante pelo menos 4 - 8 semanas (Figura 2). Uma estratégia para isolar as células que crescem a partir do resíduo restante é aqui apresentado (ie reverter filtragem grupos de células e re-plaqueamento em meio fresco). A decisão sobre se deve continuar a manter uma cultura é em última instância uma decisão caso a caso com base em fatores que cercam the autópsia (por exemplo, um prolongamento do intervalo post-mortem, os problemas durante o transporte do tecido), a dissociação de tecidos (por exemplo, sangue ou detritos excessivos), e como o exemplo aparece na cultura. Uma vez que uma cultura é estabelecida, a identidade deve ser validado por fingerprinting de DNA por meio de análise de repetições em cadeia curta ou um método semelhante, comparando a cultura de uma amostra do tumor original retido para esta finalidade. Recomendamos rotineiramente validar culturas por impressões digitais de DNA para assegurar que nenhuma contaminação por outras culturas ocorreu, por exemplo, a cada 3 - 6 meses.
A geração dessas culturas DIPG derivados de paciente representa um passo importante no desenvolvimento bem sucedido de terapias eficazes. A expansão dos modelos de culturas DIPG derivado do paciente e de xenotransplante disponíveis será fundamental para identificar as estratégias terapêuticas mais eficazes e, finalmente, superar esta doença devastadora.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio da Claire Foundation McKenna, Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS K08NS070926 e R01NS092597), Departamento de Defesa (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 e RN3-06510), Alex Lemonade Fique Foundation, The Cure Starts Now Foundation e DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Oncologia Pediátrica, Tumor Fundação Infância Cérebro, Matthew Larson Foundation, Fundação V, Fundo da família de Godfrey em memória de Fiona Penelope, o DIPG Fundação Wayland Villars, o Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, e Jennifer Fundos Memorial Kranz, Fundação N8, Virginia e do Fundo Ludwig DK for Cancer Research, criança Health Research Institute da Universidade de Stanford Anne T. e Robert M. Bass Endowed Faculdade de bolsas em Pediatric cancerosas e de sangue doenças.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
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