Summary
Denne protokol beskriver en metode til hurtig behandling af post mortem diffuse iboende pontine gliom prøver for etablering af patient-afledt cellekultur modeller eller direkte karakterisering af tumor og microenvironmental celler.
Abstract
Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG) er en barndom hjernestammen svulst, der bærer en universelt fatal prognose. Fordi kirurgisk resektion er ikke en levedygtig strategi behandling og biopsi er ikke rutinemæssigt udføres, tilgængeligheden af patientprøver til forskning er begrænset. Derfor har indsatsen for at studere denne sygdom blevet udfordret af en mangel på trofaste sygdomsmodeller. For at løse dette behov, vi beskriver her en protokol for en hurtig behandling af post mortem autopsi vævsprøver for at generere holdbare patient-afledt cellekulturmodeller, der kan anvendes i in vitro-assays eller in vivo ortotopisk xenograft eksperimenter. Disse modeller kan anvendes til at screene for potentielle drug targets og til at undersøge grundlæggende patobiologiske processer inden DIPG. Denne protokol kan yderligere udvides til at analysere og isolere tumor og microenvironmental celler ved anvendelse Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), som muliggør efterfølgende analyse af gen expression, proteinekspression eller epigenetiske modifikationer af DNA ved hovedparten celle eller enkelt celle niveau. Endelig kan denne protokol også indrettet til at generere patient-afledte kulturer for andre tumorer i centralnervesystemet.
Introduction
DIPG er en aggressiv centralnervesystemet malignitet, der opstår i de ventrale pons, typisk i midten af barndommen 1, 2. Trods årtiers kliniske forsøg, nuværende behandling er begrænset til strålebehandling, som tilvejebringer midlertidig forbedring eller stabilisering af symptomerne, og kun strækker median overlevelse med gennemsnitligt 3 måneder. Selv med strålebehandling, mediane samlede overlevelse er kun 9 måneder med 90% af børnene dør af sygdommen inden for 2 år af første diagnose. På grund af den infiltrativ tumorens natur og de kritiske funktioner af hjernestammen, kirurgisk resektion er ikke mulig. Desuden i USA, at få kirurgiske biopsier for DIPG har historisk ikke udført 3, som histopatologisk analyse har nogen nuværende rolle i at vejlede klinisk behandling og diagnosticering kan typisk ske ved Neuroimaging alene. Således tilgængeligheden af tumorvæv feller studere er begrænset, begrænser bestræbelser på at gennemføre forskning i kandidat narkotika molekyler og den underliggende tumor biologi. Navnlig er forbedringer i Neuroimaging og stereotaktiske teknikker gav mulighed for udvikling af sikre biopsier af DIPG i de senere år 4, som i kombination med fremskridt i molekylær biologi, er transformeret vores forståelse af sygdommen. I øjeblikket, flere kliniske forsøg med upfront biopsi og molekylær profilering af DIPG for individualiserende behandling planer er i gang (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG og andre pædiatriske high-grade gliomer repræsenterer forskellige sygdomme fra deres voksne glioblastom modstykker 6, 7, og dermed trofaste forsøgsmodeller af DIPG er nødvendige for at forstå sin unikke patofysiologi og opdage effektive terapeutiske strategier. I de senere år fokuseret indsats for at opnå DIPG tumor tproblem for forskningen på tidspunktet for obduktion eller mindre almindeligt, biopsi har revolutioneret vores forståelse af og evne til at studere DIPG. Genom-dækkende sekventering indsats afslørede en tilbagevendende mutation i H3 histon, familie 3A (H3F3A) og histon klynge 1, H3B (HIST1H3B), som repræsenterer det første eksempel på menneskelig sygdom forårsaget af mutationer i histon kodning proteiner 8, 9, 10, 11 . Endvidere er en delmængde af DIPGs udtrykker mutationer i ACVR1 genet, som ikke tidligere er blevet rapporteret i cancer, men er identiske med mutationer fundet i medfødt barndommen udviklingsforstyrrelse fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11. Samt, de første patient-afledte DIPG cellekulturer og ortotopisk xenograft models er nu nedsat 1, 2, 12, 13, 14, samt musemodeller etableret ved direkte xenotransplantation af tumorceller i immunsvækkede mus til at generere serielle xenotransplantater 3, 14, 15. Indledende drug screening indsats ved hjælp af disse patient-afledte modeller har identificeret lovende nye stoffer til klinisk oversættelse 4, 14 og har lagt grunden til mindst et klinisk forsøg (NCT02717455).
Disse første skridt i retning af fremskridt er kun begyndelsen, og mange patient-afledt vævsprøver og kultur modeller vil være nødvendigt at definere undertyper af sygdommen og udvikle de mest effektive terapeutiske strategier. Genetisk motorob- musemodeller for DIPG vil også lette undersøgelser med henblik på at fremme vores grundlæggende forståelse af sygdommen. Bestræbelser for at generere genetiske modeller for DIPG vil blive hjulpet på vej af de fundamentale genomiske studier omtalt ovenfor, men i øjeblikket er et begrænset antal valgmuligheder er tilgængelige. En sådan model, som genererer histologisk lignende high-grade hjernestamme gliomer, bruger den virale RCAS / tv-et system til at køre PDGF-B overekspression og INK4a-ARF tab i nestin-positive celler i den bageste fossa af neonatale mus 5, 16. En anden tilgang indebærer den gentog flere store DIPG-associerede mutationer (histon H3.3 K27M mutation, p53 tab og PDGFRA aktivering) i neurale precursorceller afledt af humane embryonale stamceller, hvilket er tilstrækkeligt til at gøre disse celler tumorigene 6, 7, 17. Kombinationen af genetiske metoder og patient-derived modeller vil gøre det muligt for præklinisk afprøvning og fremme udviklingen af effektive behandlinger.
For at løse de udfordringer DIPG forskning beskrevet ovenfor, blev denne hurtige obduktion protokol udviklet til at generere patient-afledte cellekulturer til undersøgelse 8, 9, 10, 11, 12, 14. Protokollen har til formål at beskytte levedygtigheden af vævet og maksimere sandsynligheden for at generere holdbare kulturer på trods af de udfordringer, der er forbundet med større intervaller efter slagtning og transport tid. Når der genereres med succes, kan disse DIPG kulturer anvendes i efterfølgende in vitro manipulationer og in vivo xenograft eksperimenter, der giver mulighed for evaluering af potentielle terapeutiske molekyler på patient-afledte celler.
Protocol
Denne protokol er blevet udført med godkendelse fra vores institutionelle review board med passende de-identifikation af alle patientdata og i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd. Få alle relevante institutionelle gennemgang board godkendelse og informeret samtykke fra patientens familie forud for arbejdet med denne protokol.
1. Indhentning vævsprøver
BEMÆRK: En kritisk komponent i denne protokol kræver korrekt håndtering af vævet donation starter straks ved obduktion. Den samlede prøve levedygtighed afhænger væsentligt minimere post-mortem Interval (PMI), straks overføre vævet ind i den relevante kolde medium suppleret med antibiotika / antimykotika, holde prøven på våd is under hele transporten, og opretholdelse af steril teknik hele protokollen.
- efter anmeldelseaf en overhængende donation, forberede en prøve samling kit. Ved hjælp af en forsendelse boks med en isoleret beholder, der kan anvendes direkte til returnering transport af vævsprøve, omfatte de følgende materialer:
- Medtag materialer til sterile præparat, herunder sterile handsker, forhæng, og skalpeller.
- Medtag 8 - 10 sterile 50 ml koniske rør indeholdende 30 ml skibsfart medier i isoleret beholder med is eller kolde pakninger.
BEMÆRK: Mens enhver standard cellekulturmedier kan arbejde, er den bedste prøve levedygtighed opnået med Hibernate-A suppleret med antibiotika / antimykotika. - Medtag yderligere prøverør for andre analyser (f.eks fixatives).
- Hvis obduktionen ikke vil blive udført på investigators hjemmeside, omfatter et dokument, der klart, hvordan de skal indsamle tumorprøven. Dette omfatter detaljer såsom at opretholde sterilitet, holde prøverør på våd is, og med prøver fra midthjernen og medulla som tumor celler ofte invadere disse regioner.
- Opretholde sterilitet under obduktionen. Overvej hjernen sterile inde i kraniet, så observere steril teknik (herunder skiftende handsker) når kraniet er åben. Undgå forurening med hud og hår er kritisk.
- Dissekere tumor fra den ventrale side (den "mave" af pons, se Supplemental Figur 1). Med en steril skalpel, skæres små 1 cm bidder fra tumoren og straks overføre til kold skibsfart medier (se OBS i trin 1.1.2) og sat på våd is. 10 ml af væv i hvert rør, hvilket resulterer i et endeligt volumen af væv og medier i hvert rør på 40 ml.
BEMÆRK: I tilfælde af DIPG, tumoren diffust infiltrerer de pons og ofte resten af hjernestammen. Som sådan, indsamle så meget af prøven som muligt, typisk herunder 3 - 4 rør (30 - 40 ml væv) fra pons og 1 - 2 rør (10 - 20 ml væv) hver fra midthjernen og medulla. - Saml sampler fra midthjernen og medulla sammenstillet til pons, ofte indeholdende mange tumorceller.
- Efter prøvetagning, skib prøverne O / N på våd is i isoleret beholder. Du må ikke sende prøven på tøris, som frysning vil dræbe cellerne.
2. Forberedelse til Sample Processing
- Før begyndelsen prøveforberedelse, sterilisere vævskultur emhætter sammen med barberblade, buede hemostats og alle andre ikke-sterile redskaber under UV-lys i 1 time. Udfør alle følgende trin under sterile betingelser for at forhindre forurening af kulturerne.
- Forberede og sterile filterløsninger.
- For at forberede 1.8 M saccharoseopløsning opløses 308,07 g saccharose i 300 ml destilleret vand. Der tilsættes 50 ml 10x Hank's saltopløsning (HBSS) uden calcium eller magnesium og bringe samlet volumen til 500 ml med destilleret vand. Opbevares ved 4 ° C.
- For at forberede enzymatisk fordøjelse løsning, tage 50 ml HBSS med calcium og magnesium for hver 10 ml af hakket væv og tilsæt 500 pi 5 mg / ml deoxyribonuclease I (slutkoncentration 50 ug / ml), 500 pi 2,5 mg / ml collagenase I / II og dispase opløsning (slutkoncentration 25 ug / ml) og 500 pi 1 M HEPES-buffer. Forvarm fordøjelse opløsning i et 37 ° C vandbad.
- Til fremstilling tumor stamceller medier (TSM) base, blandes 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiotikum-antimykotikum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamin dipeptid (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-buffer, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, og 5 ml 100x MEM ikke-essentielle aminosyrer.
- For at forberede komplet TSM med vækstfaktorer, tilføje følgende supplementer til TSM basen: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (01:50), human epidermal vækstfaktor (H-EGF, 20 ng / ml), human fibroblast vækstfaktor (H- FGF, 20 ng / ml), human blodpladeafledt vækstfaktor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),human blodpladeafledt vækstfaktor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) og heparin-opløsning (2 pg / ml).
- Forkøling en laboratoriecentrifuge udstyret med en svingende spand-rotor til 4 ° C.
3. Mekanisk Dissociation
- Overfør vævet ind i en high-walled 100 mm x 20 mm cellekultur skål. Fjern medier levn fra skibsfart og erstatte med 10 - 15 ml kold kulturmedier.
- Brug af buede hemostats at forstå et barberblad, hakkekød vævet fint, mens du fjerner åbenlyse blodkar eller meninges.
BEMÆRK: De endelige vævsfragmenter bør være mindre end 1 mm (se figur 1B). - Overfør vævet i en ren 50 ml konisk rør. Vask cellekultur fad med yderligere 5 ml koldt dyrkningsmedier og overføre til den konisk rør. Gentag dette vasketrin efter behov for at overføre resterende væv.
- Ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette, tritureres forsigtigt (4 - 5 gange). Tillad større tissUE fragmenter at sedimentere til bunden af røret. Hvis det er nødvendigt, kortvarigt centrifugeres prøven i 1 min (350 xg, 4 ° C).
- Opsamling af dissocieret mekanisk fraktion.
- Fjern supernatanten og filtrere det gennem en 100 um filter over i en ny 50 ml konisk rør mærket "Mekanisk Dissociation." Vend filteret over oprindelige konisk rør og vask med dyrkningsmedier at genvinde væv fragmenter.
- Centrifugeres "Mekanisk Dissociation" fraktion i 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten fra det pelleterede "Mekanisk Dissociation" fraktion og resuspender væv i koldt kulturmedier. Hvis der er mere end 5 ml væv i "Mekanisk Dissociation" konisk rør, opdele vævet ind i andre 50 ml koniske rør, således at ingen rør har mere end 5 ml væv.
- Opbevar mekanisk dissocierede fraktion på is indtil sucrosegradientcentrifugering trin (Step 5). Alternativt kan den mekanisk dissocierede fraktion fortsætte til trin 5 under den enzymatiske dissociation inkubationstiden (trin 4.4).
4. Enzymatisk Dissociation
- Hvis der er mere end 5 ml væv i rør indeholdende de resterende større vævsfragmenter, opdele vævet ind andre nye 50 ml koniske rør, således at ingen rør har mere end 5 ml væv.
- Centrifugeres konisk rør (er), der indeholder de resterende vævsfragmenter i 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten og tilsæt forvarmet enzymatisk fordøjelse opløsning, således at der er 5 ml fordøjelse løsning for hver 1 ml væv (f.eks 25 ml fordøjelse opløsningen i 5 ml væv).
- Forsegl konisk rør låg med laboratoriefilm og inkuber reaktionen på en rotator ved 37 ° C i 30 minutter.
- Efter inkubationen tritureres prøverne forsigtigt (se figur 1C).
- Ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette,pipette prøven op og ned 6 - 8 gange. Undgå at generere store luftbobler.
- Tilføj et 1.000 pi pipettespids til enden af pipetten og tritureres yderligere 6 - 8 gange.
- Tillad eventuelle resterende klumper at sedimentere til bunden af røret. Fjern og filtrere supernatanten med cellerne stadig suspenderet gennem en 100 um filter over i en ny 50 ml konisk rør mærket "Enzymatisk Dissociation" og gemme på is.
- Hvis signifikante væv fragmenter tilbage, tilføje en ekstra 10 ml HBSS med calcium og magnesium til fragmenterne og gentag trin 3.5.1 og 3.5.2. Filter denne endelige løsning gennem en 100 um filter i "Enzymatisk Dissociation" rør.
- Centrifugeres "Enzymatisk Dissociation" rør i 5 min (350 xg, 4 ° C) og fortsætter med at sucrosegradientcentrifugering.
5. sucrosegradientcentrifugering
- Hvis prøverne stadig suspenderes i opløsning, centrifuge i 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten og resuspender væv i 20 ml kold HBSS uden calcium og magnesium. Bring volumen op til 25 ml i alt med kold HBSS.
- Tilsæt langsomt 25 ml 1,8 M saccharoseopløsning og invertsukker røret for at blande. Dette resulterer i en 0,9 M saccharosegradient.
- Centrifuge uden bremse i 10 minutter (800 xg, 4 ° C). Ved hjælp af en centrifugering bremse vil forstyrre gradienten og reducere udbyttet (se figur 1D for et eksempel på en prøve før og efter centrifugering).
- aspirere omhyggeligt myelin debris og så meget saccharoseopløsning som muligt. Vask prøven ved tilsætning 30 ml kold HBSS uden calcium og magnesium og forsigtig blanding. Centrifuger i 5 minutter (350 xg, 4 ° C).
6. ACK Red Blood Cell Lysis
- Fjern vask supernatanten. Tilsæt 5 ml ACK-lysepuffer og forsigtigt resuspender cellepelleten, hvirvlende røret i 1 min ved stuetemperatur.
- Stands lysis ved tilsætning 30 ml kold HBSS uden calcium og magnesium.
- Centrifuger i 5 minutter (350 xg, 4 ° C).
7. Indledende Culture Vedligeholdelse
- Resuspender den endelige cellepellets i 10 - 15 ml varm komplet TSM med vækstfaktorer og kvantificere levedygtige celledensitet på et hæmocytometer under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse.
BEMÆRK: Rækken af levedygtige celler varierer meget afhængig af omstændighederne i vævet donation, og kvantificering kan være svært på dette tidlige stadium grundet sidesten cellerester. I en ideel tilfælde, har til formål at have en million levende celler pr prøve. I tilfælde, hvor overdreven vragrester fortsat, plade ved en lavere tæthed i en T175 kolbe. - Overfør de endelige cellesuspensioner i et nyt T75 dyrkningskolbe. Spike i yderligere vækstfaktorer hver anden dag for at opretholde den samlede vækstfaktor niveauer og overvåge for udvikling af tumor celle neurosfærer (se Figur 1E og figur 2).
- Alternativt proces enzymatisk dissocierede celler til yderligere analyse, herunder flowcytometri og fluorescens-aktiveret celle sortering.
- Efter udviklingen af neurosfærer (der i gennemsnit tager 3 - 4 uger, men varierer fra et par dage til så længe som 2 måneder), revers filter prøven under anvendelse af en 100 um nylonnet filter til at reducere mængden af affald.
BEMÆRK: Filtratet bør opretholdes i kultur i tilfælde levedygtige enkeltceller eller små kugler er til stede. - Sikre integriteten og renheden af kulturen ved at udføre DNA fingeraftryk mens passage, sammenligne til den oprindelige patientprøve.
Representative Results
Den beskrevne protokol er opsummeret som en fem-trins arbejdsgang med billeder af vævet på forskellige stadier af forarbejdning i figur 1. Prøven først opnås gennem hurtig steril obduktion. Under mekanisk dissociation, er vævet hakket under fjernelse blodkar og meninges fra prøven, og filtreret gennem en 100 pm nylon mesh-filter. Resterende fragmenter væv enzymatisk dissocieret i en opvarmning ovn. Dernæst snavs reduceres ved sucrosegradientcentrifugering, isolering af en distinkt lag af myelin fra prøven. Desuden ACK lysis reducerer synligt mængden af røde blodlegemer til stede i prøven. Endelig udplades cellerne i serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer.
Supplerende Figur 1 er et eksempel på tumoren ved obduktion. Tumoren vokser som en diffus infiltration af pons end de tilstødende områder i hjernestammen. Under prøven præparater, bør små ~ 1 cm x 1 cm bidder skæres og øjeblikkeligt anbragt i koldt skibsfart medier på is.
Figur 2 viser forskellige eksempler på, hvordan prøverne kan fremgå af de tidlige stadier af dyrkningen til en varig kultur. Oprindeligt belagt og tidlige kulturer (A, B) ofte ikke synes at indeholde mange overlevende celler. Endvidere tidlige celleklynger (C, D) ofte ikke udviser den grad af kontrast typisk forbundet med neurosfærer. Især kan varigheden af tid i kultur før forekomsten af celleklynger tage uger til et par måneder. den indledende passage af disse celleklynger, kombineret med reverse filtrering af celleklynger, kan dog isolere raske tumorceller som er i stand til at danne kugler (F). Filtratet (E) indeholder typisk sidesten vragrester dog anbefaler vi plating og vedligeholdelse af filtratet og overvågning for udviklingen af celleklynger. Disse patient-afledte prøver kan derefter opretholdes i kultur i flere passager (G, H).
Figur 3 demonstrerer evnen af disse celler til at være xenotransplanteret i mus. I hvert af disse tilfælde blev DIPG cellerne transficeret med et GFP-Luciferase reporter til at overvåge udviklingen af tumorer gennem bioluminescens (A). Tumorerne kan også undersøges histologisk for eksempel at observere tumor indpodning (B) eller ekspression af specifikke markører (C). Disse in vivo-modeller, kombineret med in vitro-assays kan anvendes til at vurdere virkningerne af forskellige lægemidler eller gen manipulationer (f.eks, 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55.360 / 55360fig1.jpg "/>
Figur 1. vævsprøver på forskellige forarbejdningstrin. (A) Opnå prøven gennem sterile obduktion procedurer og overnight shipping på våd is. (B) Fra venstre til højre: (række 1) rør indeholdende tumorvæv i skibsfart medier; frisk væv i en 100 mm x 20 mm cellekultur skål; indledende hakning af væv; (Række 2) delvist hakket væv; fjernelse af meninges og blodkar; endelige størrelse af hakket vævsstykker. (C) Fra venstre til højre: (række 1) væv inkuberes på en roterende bord i en 37 ° C varm ovn; (Række 2) triturering af væv gennem en 1000 uL pipettespids fastgjort til en 10 ml pipette; filtrering af dissocieret væv gennem en 100 um nylon mesh-filter. (D) Fra venstre til højre: dissocieret væv suspenderet i 0,9 M sucroseopløsning før centrifugering; dissocieret væv adskilt over en sucrosegradient efter centrifugering; et synligt lag of myelin debris oven saccharosegradienten; en endelig cellepellet efter ACK lysis og vask. (E) Den endelige stikprøve kan anbringes i kultur eller anvendes i andre downstream analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billeder af primære kulturer og Tidlig Passage Cells. (A - B) Kulturer udpladet umiddelbart efter dissociation (SU-DIPG-XXX, A), eller som ikke har vokset neurosfærer endnu (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Tidlig udseende neurosfærer i primære kulturer af SU-DIPG-XXVIII (C) og SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Første passage af den primære kultur fra D under anvendelse af en 100 um nylonfilter, med fifiltratet (E) og omvendt filtrat (F) belagt. (G - H) Ældre neurosfærer fra den første passage af SU-DIPG-XXVII (G) og den tredje passage af SU-DIPG-XXV (H) vokser i kultur. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Patient-afledte cellekulturer indpode og danne tumorer i mus. (A) bioluminescens billeder af fire forskellige patientgrupper-afledte cellekulturer transficeret med et GFP-Luciferase reporter. (B) Sagittal sektion fra en mus xenotransplantat, der viser tumorceller indpodede i musen pons. Grøn: GFP, Rød: myelin basic protein. Scale bar = 1 mm. (C) Eksempel immunofluoresblomsterstand billede der viser GFP-tumorceller indpodede i en musehjerne. Blå: DAPI, Grøn: GFP, Rød: IGF2R. Scale bar = 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1. Autopsy Prøve af en Pontine Tumor. Øjeblikkelig post mortem udseende af en diffus iboende Pontine gliom. Tumoren fremstår som en stor, myelin-rige akseltryk på den ventrale overflade af pons. Klik her for at hente dette billede.
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til hurtig behandling af post mortem tumor vævsdonation udvikle patientorienterede afledt cellekulturer, som kan anvendes i en række forskellige in vitro eller in vivo forsøg. På grund af karakteren af arbejdet med obduktion prøver, vedligeholdelse levedygtigheden prøve udgør en betydelig udfordring. Flere medvirkende faktorer, herunder interval efter slagtning til de obduceres eller den tid, der kræves til transport af væv, bør minimeres så meget som muligt, men ofte er svære at styre. Det er vores erfaring, en post mortem interval på mindre end 6 - 8 timer (fra dødstidspunktet til den tid, at vævet er placeret i iskold forsendelse og transport medier) har givet den bedste chance for at etablere et holdbart cellekultur. Det er bedst at så modtage vævet i laboratoriet inden 24 timer, og behandle det for kultur straks efter modtagelsen.
Da placeringen af disse sjældne tilfælde varierer meget, ogkvaliteten af vævet hentning skridt kraftigt påvirker chancen for succes, kan logistikken i at udføre obduktion være udfordrende. I mange tilfælde er det for at opnå den 6-8 timers rammen, er det ikke muligt at foretage vævet høst på et akademisk center. I stedet har et væv recovery service på opfordring til at genvinde tumorvæv ved begravelsen hjemme under en IRB-godkendt protokol er ofte mere hensigtsmæssigt for væv opsving. Indhentning informeret samtykke forud for døden anbefales og letter den logistiske planlægning. anbefales kraftigt Forberedelse selvstændige obduktion kits med klare og grundige instruktioner og sterile forsyninger til væv hentning (handsker, forhæng, skalpeller). Derudover fastlægger klare punkter for kommunikation blandt investigator, patolog, og begravelse hjem er kritisk. For eksempel bør investigator diskutere protokol med patologen før obduktionen og fremhæve almindelige fejl. Disse fejl omfatter mikroBIAL forurening (normalt gær) under væv hentning, manglende skib gennem natten / fremskyndet forsendelse og manglende sende prøven på tilstrækkelig våd is i en thermoinsulated beholder. Endelig anbefaler vi at bruge en dør-til-dør kurertjeneste til forsendelse af prøven for at minimere transporttid.
Man skal også tages under væv dissociation at bevare cellernes levedygtighed. For eksempel til brug af medier designet bevare neuralt væv sundhed til transport (Dvale-A suppleret med antibiotisk / antimykotisk) vil øge chancen for at generere en vellykket kultur. Det er også vigtigt at holde prøven ved en kold temperatur under hele protokollen ved altid at overføre prøverne på is. Indsamling både mekaniske og enzymatiske dissociation fraktioner sammen med minimering findeling kan forbedre protokol succes, da begge trin er traumatisk for celler. Det er vores erfaring, mens de fleste succesfulde kulturer vokser ud af begge fraktionerVi har haft tilfælde, hvor kun én af de to præparater er etableret en varig kultur, potentielt afspejler den fine karakter af disse prøver. En anden traumatisk trin i protokollen er findeling; en strategi, der kan reducere graden af triturering nødvendigt, er at sikre prøverne grundigt hakket i begyndelsen af præparatet. Andre eksempler på aspekter ved protokollen designet til at forbedre prøven levedygtighed omfatter tilføje buffere (f.eks HEPES) i hele protokollen, hvilket er særligt kritisk under enzymatisk dissociation.
En eventuel ændring af denne protokol til yderligere at øge cellernes levedygtighed er fjernelse af ACK røde blodlegemer lyse trin. Men i dette tilfælde er det ofte så nødvendigt at udføre en ACK lysis trin i den indledende uge i kultur for at fjerne røde blodlegemer. Et andet aspekt af denne protokol, kan ændres er afskaffelsen af myelin og cellerester under anvendelse af en sucrose Density gradient. Specifikt andre strategier, der er blevet rapporteret at forbedre cellelevedygtighed mikrogliaceller er også muligt på dette trin, såsom en diskontinuert Percoll densitetsgradientcentrifugering 18 eller magnetiske myelin fjernelse perler.
Endelig varigheden mellem indledende væv dissociation og fremkomsten af neurosfærer varierer mellem prøverne og kan tage alt fra en uge til en måned eller mere. Da de oprindelige kulturer typisk indeholde en betydelig grad af døde celler og cellerester, kan det være en udfordring at bestemme, om levedygtige celler forbliver; kulturen bør opretholdes i mindst 4 - 8 uger (Figur 2). Én strategi til isolering voksende celler fra den resterende vragrester præsenteres her (dvs. omvendt filtrering celle klynger og re-plating i frisk medier). Beslutningen om, hvorvidt der skal fortsætte med at opretholde en kultur er i sidste ende en sag til sag-beslutning baseret på faktorer omkring the obduktion (fx en forlænget postmortem interval, problemer under væv transport), vævet dissociation (f.eks overdreven blod eller debris), og hvordan prøven vises i kultur. Når en kultur er etableret, bør identiteten valideres ved DNA-fingeraftryk under anvendelse af korte tandemgentagelse-analyse eller en lignende metode, der sammenligner kulturen til en prøve af den oprindelige tumor bevares til dette formål. Vi anbefaler rutinemæssigt validering kulturer ved DNA-fingeraftryk for at sikre, at ingen forurening med andre kulturer har fundet sted, for eksempel hver 3. - 6. måned.
Den generation af disse patient-afledt DIPG kulturer udgør et vigtigt skridt i den succesfulde udvikling af effektive behandlinger. Udvidelsen af de tilgængelige patient-afledte DIPG kulturer og xenograftmodeller vil være afgørende for at identificere de mest effektive terapeutiske strategier og i sidste ende overvinde denne ødelæggende sygdom.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtte fra McKenna Claire Foundation, National Institute of Neurologiske og Stroke (NINDS K08NS070926 og R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for regenerativ medicin (CIRM RB4-06093 og RN3-06510), Alex 'Lemonade Stand Foundation, The Cure Starter nu Foundation og DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Pediatric Cancer, Childhood Brain Tumor Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund i hukommelsen af Fiona Penelope, den Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, og Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia og DK Ludwig Fund for Cancer Research, Child Health Research Institute på Stanford Anne T. og Robert M. Bass Begavet Fakultet Scholarship i Pediatric Kræft og blodsygdomme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
