Summary
Bu protokol, bir hastada elde edilen hücre kültürü modelleri ya da tümör ve mikro-hücrelerinin doğrudan karakterizasyonu kurulması için ölüm sonrası yaygın iç pontin glioma örnekleri hızlı işlem için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Diffüz İçsel Pontine Gliomu (DIPG) evrensel ölümcül prognozu taşıyan bir çocukluk beyin tümörü olduğunu. cerrahi rezeksiyon uygulanabilir bir tedavi stratejisi değildir ve biyopsi rutin olmadığından, araştırma hasta numunelerinin kullanılabilirliği sınırlıdır. Sonuç olarak, bu hastalığı incelemek için çabalar sadık hastalık modelleri azlığı meydan edilmiştir. Bu ihtiyacı karşılamak için, in vitro deneylerde ve in vivo ortotopik ksenograft deneylerinde kullanılabilen dayanıklı bir hastaya türetilmiş hücre kültürü modelleri oluşturmak için burada ölüm sonrası otopsi doku örneklerinin hızlı bir işlem için bir protokol açıklar. Bu modeller, potansiyel ilaç hedefleri için ekran ve DIPG içinde temel biyopatolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokol daha fazla analiz ve gen ex sonraki analiz sağlar (FACS) floresan aktive hücre kullanılarak tümör ve mikro-hücreleri izole etmek için uzatılabilirpression, protein ifadesi ya da dökme hücre veya tek hücre düzeyinde DNA epigenetik değişiklikler. Son olarak, bu protokol, aynı zamanda diğer merkezi sinir sistemi tümörleri hasta türetilen kültürler meydana getirmek için adapte edilebilir.
Introduction
DIPG genellikle orta çocukluk 1, 2 sırasında, ventral pons ortaya çıkan saldırgan santral sinir sistemi kanseridir. Klinik çalışmalarda yıllardır rağmen, mevcut tedavi geçici düzelme ya da semptomların stabilizasyon sağlayan radyoterapi, sınırlıdır ve sadece 3 ay ortalama medyan sağkalım uzanır. Hatta radyoterapi ile, medyan genel sağkalım ilk tanıda 2 yıl içinde hastalıktan ölen çocukların% 90 ile sadece 9 aydır. Çünkü tümör ve beyin sapı kritik fonksiyonların infiltratif doğası, cerrahi rezeksiyon mümkün değildir. Histopatolojik inceleme genellikle yalnız nörogörüntüleme yapılabilir klinik tedavi ve tanı rehberlik hiçbir geçerli bir role sahip Dahası, ABD'de DIPG cerrahi biyopsilerin tarihsel, 3 yapılmamıştır. tümör dokusu f Böylece, kullanılabilirlikveya çalışma aday ilaç moleküllerinin ve altta yatan tümör biyolojisi üzerine araştırma yapmak için çaba sınırlama sınırlıdır. Özellikle, beyin görüntüleme ve stereotaktik tekniklerindeki gelişmeler, moleküler biyoloji gelişmeler ile kombine edildiğinde, hastalığın anlayışımızı değiştirdi son yıllarda 4, içinde DIPG güvenli biyopsi gelişmesi için izin vermiş. Şu anda, tedavi planlarının bireyselleştirilmesi için ayarlıyoruz biyopsi ve DIPG moleküler profil kullanarak birden fazla klinik denemeler devam ediyor (NCT01182350, NCT02274987) 5 vardır.
DIPG ve diğer pediatrik yüksek dereceli gliomlar kendi yetişkin glioblastoma meslektaşları 6, 7 farklı hastalıkları temsil eder ve DIPG böylece sadık deneysel modeller eşsiz patofizyoloji anlamak için gerekli olan ve etkili tedavi stratejileri keşfetmek. Son yıllarda, DIPG tümör t elde etmek için çaba odaklıOtopsi sırasında araştırma için konu ya da, daha az sıklıkla, biyopsi bizim anlayış ve DIPG çalışma yeteneği devrim yarattı. Genom boyu sıralama çabaları H3 histon, aile 3A (H3F3A) ve histon küme 1 proteinleri 8, 9, 10, 11 kodlama histon mutasyonların yol açtığı insan hastalığın ilk örneğini temsil eden, H3bve (HIST1H3B), bir tekrarlayan mutasyon saptandı . Bundan başka, DIPGs bir alt kümesi, daha önce kanser bildirilmiştir, ancak konjenital çocukluk gelişim bozukluğu progresif ossifikan fibrodisplazi 8, 9, 10, 11 'bulunan mutasyonlara aynıdır edilmemiştir ACVR1 genindeki, ifade eder. Yanı sıra, ilk hasta kaynaklı DIPG hücre kültürleri ve ortotopik ksenograft moDELS Şimdi, 2, 12, 13, 14, bağışıklık yetersizliği olan farelere, tümör hücrelerinin doğrudan ksenonaklinin ile kurulan fare modelleri, seri ksenograftları üretmek için hem de 3, 14, 15 1 tespit edilmiştir. Bu hasta kaynaklı modeller kullanılarak ilk ilaç tarama çalışmaları klinik çeviri 4, 14 umut verici yeni ajanlar tespit ettik ve en az bir klinik çalışmada (NCT02717455) için zemin hazırlamıştır.
ilerleme yolunda Bunlar ilk adımlar sadece başlangıçtır, ve çok sayıda hasta kaynaklı doku örnekleri ve kültür modelleri en etkili tedavi stratejileri hastalığın alt tiplerini tanımlamak ve geliştirmek için gerekli olacaktır. genetiği motorDIPG ait ola- rak fare modelleri de hastalığın temel anlayış ilerletmeyi hedefleyen çalışmaları kolaylaştıracaktır. DIPG genetik modeller üretmek için yapılan çabalar yukarıda tartışılan temel genomik çalışmalar yardımıyla, ancak seçeneklerin halen sınırlı sayıda mevcuttur. Histolojik olarak benzer yüksek dereceli beyin sapı tümörü üretir böyle bir model, yenidoğan farelerin 5, 16 posterior fossada Nestin-pozitif hücrelerin PDGF-B aşırı ekspresyonu ve Ink4a-ABY kaybı sürücü viral RCAS / tv-sistemini kullanır. Diğer bir yaklaşım, 6, 7, 17 tümörijenik bu hücrelerin yok edilmesi için yeterli olan, insan embriyonik kök hücreleri, türetilen sinir öncü hücrelerin birkaç büyük DIPG ilişkili mutasyonlar (histon H3.3 K27M mutasyonu, p53 kaybı ve PDGFRA aktivasyonu) yansıtan içerir. Genetik yöntemler ve hasta-TÜREV kombinasyonued modelleri klinik öncesi testler etkinleştirmek ve etkili tedavilerin daha da geliştirmek olacaktır.
Yukarıda ayrıntılı DIPG araştırma sorunları gidermek için, bu hızlı otopsi protokolü inceleme 8, 9, 10, 11, 12, 14 hasta türetilen hücre kültürleri oluşturmak için geliştirilmiştir. protokol dokusunun canlılığını korumak ve genişletilmiş otopsi aralıklarla ve ulaşım süresi ile ilişkili zorluklara rağmen dayanıklı kültürleri üretme olasılığını maksimize etmek için tasarlanmıştır. Başarılı bir şekilde oluşturulmuş olduğunda, bu DIPG kültürleri hasta türetilen hücreler üzerinde potansiyel tedavi edici moleküllerin değerlendirilmesini sağlayan, daha sonra in vitro olarak manipülasyon ve in vivo ksenograft deneylerde kullanılabilir.
Protocol
Bu protokol, tüm hasta verilerinin uygun de-kimlik ile kurumsal inceleme kurulu ve insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslar arası kurallara uygun olarak onayı ile yapılmıştır. önce bu protokol ile çalışmak için hastanın ailesinden tüm uygun kurumsal inceleme kurulu onayı ve bilgilendirilmiş onam edinin.
1. Doku Örnekleri elde edilmesi
NOT: Bu protokolün önemli bir bileşeni otopsi sırasında hemen başlayan doku bağışı uygun kullanımını gerektirir. Genel örnek canlılığı, hemen antibiyotikler / antimikotik ile desteklenmiş uygun soğuk ortama doku transferi, Post-Mortem Aralığı (PMI) minimize ulaşım boyunca ıslak buz üzerinde örnek tutarak, ve protokol boyunca steril tekniği sürdürülmesine önemli ölçüde bağlıdır.
- bildirilmesi üzerineyakın bir bağış, bir örnek toplama kiti hazırlamak. aşağıda belirtilen maddeleri, doğrudan doku numunesinin geri taşınması için kullanılan bir yalıtılmış kap ile bir kargo kutusu içeren nin kullanımı:
- steril eldiven, örtüler ve neşter içeren steril hazırlanması için malzemeler arasında.
- buz veya soğuk paketleri ile yalıtılmış bir kapta 30 ml nakliye ortamı içeren 10 steril 50 ml konik tüpler - 8 arasındadır.
Not: herhangi bir standart hücre kültür ortamı mümkündür, ama en iyi Örnek canlılığı antibiyotik / antimikotik ile takviye hazırda-A elde edilir. - Diğer analizler (örneğin, fiksatif) için başka örnek tüplerini ekleyin.
- Otopsi araştırmacının sitesinde gerçekleştirilmez ise, açıkça tümör örnek toplamak için nasıl bildiren bir belge yer alıyor. Bu, tu olarak orta beyin ve medulla örnekler, sterilite korumak ıslak buz üzerinde örnek tüplerini tutarak ve dahil olarak ayrıntıları içerirmor hücreleri genellikle bu bölgeleri işgal.
- otopsi sırasında sterilite korumak. kafatası içinde steril beyin düşünün, bu yüzden kafatası açıldığında (değişen eldivenler dahil) steril tekniği gözlemleyin. cilt ve saç ile kirlenmesini önlemek önemlidir.
- Ventral yüzü tümörü teşrih (pons "göbek", Ek Şekil 1). steril bir bisturi ile tümörün küçük 1 cm parçaları kesilmiş ve hemen soğuk nakliye medya (adım 1.1.2 NOT bakınız) içine aktarmak ve ıslak buz koymak. 40 mL her bir tüp içinde doku ve ortamın bir son hacim elde her tüp içine doku 10 mL yerleştirin.
NOT: DIPG durumunda, tümör diffüz sık pons ve beyin geri kalanı infiltratlar. pons dan - (40 mL doku 30) ve 1-4 tüpler - orta beyin ve medulla - (20 mL doku 10) her 2 tüpler gibi, tipik olarak 3 de dahil olmak üzere, mümkün olduğunca örnek kadar toplamak. - Sam toplayınorta beyin ve medulla gelen ples genellikle birçok tümör hücreleri içeren pons, bitişik.
- Numune toplama sonra, yalıtılmış bir kapta ıslak buz üzerinde örnekleri O / N gemi. donma hücreleri öldürür gibi, kuru buz üzerinde örnek gemi yok.
Örnek İşleme 2. Hazırlık
- Önceki numune hazırlama başlamadan 1 saat UV ışığı altında Jilet, kavisli hemostatlarla ve diğer steril olmayan araçlarla birlikte doku kültürü davlumbaz sterilize edin. kültürlerin kirlenmesini önlemek üzere steril koşullar altında, aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirir.
- Hazırlayın ve steril filtre çözümleri.
- 1.8 M sukroz çözeltisi hazırlamak için, distile su, 300 mL 308,07 g sakroz çözülür. Ekle 50 ml 10x kalsiyum ve magnezyum içermeyen saline solüsyonu (HBSS) Hank's tamponlu ve damıtılmış su ile 500 mL toplam hacim getirmek. 4 ° C'de saklayın.
- enzimatik sindirim solüsyonu hazırlamak için, 5 almak0 ml kıyılmış doku, her 10 mL kalsiyum ve magnezyum ile HBSS, 500 uL 5 mg / ml deoksiribonükleaz I (nihai konsantrasyon 50 ug / ml), 500 uL 2.5 mg / mL kolajenaz I / II ve dispaz çözeltisi (nihai konsantrasyon 25 ekleme ug / mL) ve 500 uL 1 M HEPES tamponu. 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtılması sindirim çözeltisi.
- tümör kök ortamı (TSM) taban hazırlamak için, 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı karışımı: Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiyotik antimikotik, 5 ml 200 mM L-alanil-L- glutamin dipeptit (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES tamponu, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, ve 5 mL 100X MEM esansiyel olmayan amino asitler yer alır.
- TSM tabanına aşağıdaki ek ekleme, büyüme faktörleri ile birlikte TSM hazırlamak için: 50x B27 eki eksi Vitamini (1:50), insan epidermal büyüme faktörü (lH-EGF, 20 ng / ml), insan fibroblast büyüme faktörü (H- FGF, 20 ng / ml), insan trombosit türevli büyüme faktörü AA (lH-PDGF-AA, 10 ng / ml),insan platelet türevli büyüme faktörü BB (lH-PDGF-BB, 10 ng / ml) ve heparin çözeltisi (2 ug / ml).
- 4 ° C'ye kadar bir sallanma-kepçeli rotor ile donatılmış bir laboratuar tipi santrifüj ön soğutma.
3. Mekanik Ayrılma
- yüksek duvarlı 100 mm x 20 mm hücre kültür çanağı içine doku aktarın. nakliye gelen medya leftover çıkarın ve 10 ile değiştirin - 15 ml soğuk kültür ortamı.
- Kavisli hemostat kullanarak, bir tıraş bıçağı kavramak bariz kan damarları veya meninksler çıkarırken ince doku kıyma için.
NOT: Son doku parçaları, 1 mm'den daha küçük olmalıdır (Şekil 1B'ye bakınız). - temiz bir 50 ml konik tüp içine doku aktarın. ilave bir 5 mL soğuk kültür ortamı ile hücre kültürü bulaşık yıkama ve konik tüp aktarın. kalan doku aktarımı için gerekli bu yıkama işlemi tekrarlayın.
- (- 5 defa 4), 10 ml serolojik pipeti kullanarak, yavaşça Karışım. Büyük Tiss izinue fragmanları tüpün dibine yerleşmek için. Gerekirse, kısa bir süre 1 dakika boyunca (350 xg, 4 ° C) örnek santrifüj.
- Mekanik ayrışmış fraksiyonu toplayın.
- Süpernatantı ve etiketli yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre aracılığıyla filtre "Mekanik Ayrılma." Orijinal konik tüp üzerinde filtre ters çevirin ve doku parçaları kurtarmak için kültür ortamı ile yıkayın.
- 5 dakika (350 xg, 4 ° C) "Mekanik Ayrılma" fraksiyonu santrifüj.
- peletlenmiş "Mekanik Ayrılma" kısmından Süpernatantı ve soğuk kültür ortamı içinde doku tekrar süspansiyon. "Mekanik Ayrılma" konik tüp doku fazla 5 ml ise, herhangi bir tüp en fazla 5 ml doku sahip olduğu şekilde, diğer 50 ml konik tüp içine doku ayrıldı.
- (Sukroz gradient santrifüj adım kadar Ste buz üzerinde mekanik ayrışmış kısmını Mağazap 5). Alternatif olarak, mekanik olarak ayrışmış kesir enzimatik ayrılma inkübasyon süresi (Adım 4.4) sırasında Adım 5'e devam edebilirsiniz.
4. Enzimatik Ayrılma
- Geri kalan daha büyük bir doku parçaları ihtiva eden bir tüp içinde doku fazla 5 mL varsa, herhangi bir tüp en fazla 5 ml doku sahip olduğu şekilde diğer yeni 50 ml konik tüp içine doku ayrıldı.
- 5 dakika (350 xg, 4 ° C) kalan doku parçalarını içeren konik boru (lar) santrifüjleyin.
- Önceden ısıtılmış enzimatik sindirim çözeltisi Süpernatantı ve ekleme, her 1 ml doku 5 ml Sindirim solüsyonu olduğu şekilde (örneğin, 5 ml doku için 25 ml sindirim çözeltisi).
- laboratuar film ile konik tüp kapaklar kapatılır ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde reaksiyon inkübe edilir.
- İnkübasyondan sonra, (Şekil 1C bakınız) yavaşça örnekleri Karışım.
- 10 ml serolojik pipet kullanılarak,pipet örnek yukarı ve 6 aşağı - 8 kez. Aşırı hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
- pipetlemeyin sonuna kadar 1000 uL pipet ucu ekleme ve ek 6 çiğnemek - 8 defa.
- kalan parçaları tüpün dibine yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve hala "Enzimatik Ayrılma" etiketli yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre ile askıya hücreleri ile süpernatant filtre ve buz üzerinde saklayın.
- önemli doku parçaları kalırsa, fragmanlara kalsiyum ve magnezyum ile ek 10 ml HBSS ekleyin ve tekrar 3.5.1 ve 3.5.2 adımları. "Enzimatik Ayrılma" tüp içine 100 mikron filtre ile bu nihai çözüm Filtre.
- 5 dakika (350 xg, 4 ° C) "enzimatik ayrılma" tüp santrifüj ve sukroz gradyanlı santrifüjleme devam etmektedir.
5. Sükroz Gradyan Santrifüjü Geri
- Numuneler de Çözelti Santrifüj içerisinde süspanse halinde5 dakika (350 xg, 4 ° C) ge.
- Kalsiyum ve magnezyum olmadan 20 ml soğuk HBSS supernatant ve tekrar süspansiyon doku çıkarın. Soğuk HBSS ile 25 ml toplam hacim kadar getirin.
- Yavaş yavaş 25 ml 1.8 M sükroz çözeltisi ekleyip karıştırın tüp ters. Bu 0.9 M sukroz gradyanı ile sonuçlanır.
- 10 dakika (800 xg, 4 ° C) için bir fren santrifüjleyin. Degrade bozabilir ve verimi azaltır (öncesi ve santrifüj sonrası numunenin bir örnek için Şekil 1D bakınız) bir santrifüj fren kullanma.
- Dikkatle miyelin enkaz ve mümkün olduğunca sakaroz çözeltisini aspire. kalsiyum ve magnezyum olmadan 30 ml soğuk HBSS ekleme ve hafifçe karıştırılarak numune yıkanır. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) santrifüj.
6. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizis
- yıkama süpernatantı. 5 ml ACK lisiz tamponu ekleyin ve yavaşça oda sıcaklığında 1 dakika boyunca tüp dönen, hücre pelletini.
- l Söndürmekalsiyum ve magnezyum olmadan 30 ml soğuk HBSS ekleyerek Salman kararı.
- 5 dakika (350 xg, 4 ° C) santrifüj.
7. İlk Kültür Bakım
- büyüme faktörleri sıcak komple TSM 15 mL ve tripan mavi eksklüzyonu kullanılarak hemasitometre viyabl hücre yoğunluğu ölçmek - 10 son hücre pelletleri yeniden süspanse edin.
NOT: canlı hücre aralığı yaygın doku bağışı koşullara bağlı olarak değişir, ve miktar nedeniyle artık hücresel enkaz, bu erken aşamada zor olabilir. İdeal bir durumda, örnek başına bir milyon canlı hücreleri olması amaçlanmıştır. Aşırı artık bir T175 şişesi içinde daha düşük bir yoğunlukta, kalan plaka durumlarda. - Yeni T75 kültür şişesine son hücre süspansiyonları aktarın. Ek büyüme faktörlerini de başak toplam büyüme faktörü seviyeleri korumak ve tümör hücre neurospheres gelişimi izlemek için her gün (Şekil 1E ve Şekil 2).
- Seçenek olarak ise, akış sitometrisi ve floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama içeren, daha fazla analiz için proses enzimatik ayrışan hücreler.
- (Ortalama 3 alır - 4 hafta, ama sürece 2 ay gibi bir kaç gün arasında değişir) neurospheres geliştikten sonra, enkaz miktarını azaltmak için 100 mikron naylon örgü filtre kullanarak örnek filtresi ters.
NOT: Süzülen madde olarak tek hücre ya da küçük küreler olması durumunda, kültür içinde muhafaza edilmelidir. - İlk hasta örneği karşılaştırarak, Pasajlanması sırasında DNA parmak izi yaparak kültür bütünlüğünü ve saflığını sağlamak.
Representative Results
Açıklanan protokol Şekil 1'de işleme çeşitli aşamalarında doku görüntüleri ile beş adımlı bir iş akışı olarak özetlenmiştir. Numune ilk hızlı steril otopsi ile elde edilir. örnek kan damarları ve meninks kaldırılırken mekanik ayrıştırma sırasında doku kıyılmış ve 100 um naylon ağ filtre içerisinden filtre edilmiştir. Kalan doku parçaları enzimatik bir ısınma fırında ayrışmış bulunmaktadır. Daha sonra, moloz örnek miyelin ayrı bir tabaka izole sukroz gradyanlı santrifüjleme vasıtasıyla azaltılır. Buna ek olarak, ACK lisiz gözle örnek kırmızı kan hücrelerinin miktarını azaltır. Son olarak hücreler, büyüme faktörleri ile takviye edilmiş serumsuz ortamda kaplanmıştır.
Yan Şekil 1, otopsi sırasında tümör örneğidir. Tümör pons An dağınık infiltrasyon olarak büyürbeyin sapı d bitişik bölgeleri. Örnek hazırlıkları sırasında, küçük ~ 1 cm x 1 cm parçaları kesilmeli ve hemen buz üzerinde soğuk nakliye ortamı içine yerleştirilir.
Şekil 2 numuneler dayanıklı kültüre kültürleme erken aşamalarında ortaya çıkabilecek nasıl çeşitli örneklerini göstermektedir. Başlangıçta kaplama ve erken kültürler (A, B) genellikle birçok kalan hücreleri içeren görünmüyor. Ayrıca, erken hücre kümeleri (C, D) genellikle, tipik olarak neurospheres ile bağlantılı kontrast derecesini göstermezler. Özellikle, kültürde önce hücre kümeleri görünümünü zaman süresi bir kaç ay için hafta sürebilir. Ancak, hücre kümeleri, ters filtreleme ile birlikte bu hücre kümeleri, ilk kanalı, küreleri (F) oluşturabildiği sağlıklı tümör hücrelerini izole. Süzüntü (E), tipik olarak artık enkaz içerir; Ancak, kaplama ve süzüntü korumak ve izlenmesi tavsiye hücre kümeleri geliştirilmesi. Bu hasta türevi numuneler daha sonra birden fazla geçit (G, H) kültür içinde muhafaza edilebilir.
Şekil 3, fareye Aşılanmış için bu hücrelerin yeteneğini göstermektedir. Bu durumların her birinde, DIPG hücreleri biyolüminesans (a) 'dan tümörlerin gelişimini izlemek için bir GFP lusiferaz raportör ile transfekte edilmiştir. tümörler de tümör melezleme (B) ya da özel işaretleri (C) 'nin ifadesi gözlemlemek için, örneğin, histolojik olarak incelenebilir. In vitro tahliller ile birlikte bu in vivo modeller, çeşitli ilaç ya da gen manipülasyon etkilerini değerlendirmek üzere kullanılabilir (örneğin, 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
İşleme çeşitli aşamalarında Şekil 1. Doku Örnekleri. (A) Steril otopsi usul ve ıslak buz üzerinde gecede kargo yoluyla örnek alın. Soldan sağa (B): (satır 1) nakliye medyada tümör dokusu içeren tüpler; 100 mm x 20 mm hücre kültür çanağı taze doku; doku başlangıç kıyma; (Satır 2) kısmen kıyılmış doku; menenjlerin ve kan damarlarının kaldırma; Kıyılmış doku parçalarının son boyutu. Soldan sağa (C): (satır 1) 37 ° C bir fırında, bir döner tabla üzerinde inkübe doku; (Satır 2), 10 mL pipet bağlanmış bir 1000 uL pipet ucu ile doku toz haline getirilmesi; 100 mikron naylon örgü filtre ile ayrışmış doku filtreleme. Soldan sağa (D): Doku santrifüjtemeden önce 0.9 M sukroz çözeltisi içinde süspansiyon haline dissosiye; Santrifüj işleminden sonra bir sükroz gradyanı üzerinde ayrılmış ayrışan doku; görünür bir katman osakaroz degrade üst f miyelin enkaz; ACK lizis ve yıkama sonrasında nihai hücre topağı. (E) son numune kültüre yerleştirildi veya diğer alt analizlerde kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İlköğretim Kültürler ve Erken Geçiş Hücreleri 2. Görüntüleri Şekil. (A - B) Kültürler (SU-DIPG-XXX, A) ayrışma hemen sonra kaplama, ya da henüz neurospheres büyüdü değil (SU-DIPG-XXIX, B). (Cı - D), SU-DIPG-XXVIII (C) ve SU-DIPG-XXIX (D) birincil kültürlerinde neurospheres erken görünüm. fi (EF) 100 mikron naylon filtre kullanarak D birincil kültürünün ilk geçiş,ltrate (E) ve ters süzülen madde (F) kaplama. (G - H) kültüründe büyüyen SU-DIPG-XXVII (G) ve SU-DIPG-XXV (H) Üçüncü pasaj ilk geçit Olgun Neurospheres. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Hasta türetilen Hücre Kültürleri sokmak ve Farelerde Form Tümörleri Can. GFP-Lusiferaz raportör ile transfekte edilmiş, dört farklı hasta türetilen hücre kültürleri (A) Bio-ışıldama, ve görüntüler. Fare ponsta engrafted tümör hücreleri gösteren (B) fare ksenografttan Sagittal bölüm. Yeşil: GFP, Kırmızı: Miyelin bazik protein. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) Örnek immunofluoresBir fare beyninde engrafted GFP tümör hücrelerini gösteren artmasına neden olmuştur görüntüsü. Mavi: DAPI, Yeşil: GFP, Kırmızı: IGF2R. Ölçek çubuğu 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Company Şekil Bir Pontine Tümör 1. Otopsi Örnek. diffüz içsel pons glioma derhal ölüm sonrası görünüm. Tümör, pons ventral yüzeyi üzerinde büyük, miyelin zengin kütle olarak görünür. Bu resmi indirmek için tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, in vitro çeşitli in vivo deneylerde kullanılabilen hasta türetilen hücre kültürleri geliştirmek için ölüm sonrası tümör dokusu bağış hızla işlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Çünkü otopsi örnekleri ile çalışma niteliği, örnek canlılığı sürdürmek önemli bir sorun teşkil etmektedir. Otopsi ölüm sonrası aralık veya doku nakli için gereken süre de dahil olmak üzere çeşitli katkıda bulunan faktörler, mümkün olduğunca en aza ama çoğu zaman kontrolü zor olan olmalıdır. Bizim deneyim, az 6 bir otopsi aralığında - (doku buz nakliye ve taşımacılık medya yerleştirilir zaman ölüm zaman) 8 saat dayanıklı hücre kültürü oluşturulması en iyi şans vermiştir. Daha sonra 24 saat içinde laboratuarda doku almak ve aldıktan sonra hemen kültüre işlemek için en iyisidir.
Bu nadir durumlarda yeri, büyük farklılıklar yana veDoku alma aşamasının kalitesi kuvvetle başarı şansını etkileyen, Otopsiyi lojistik zor olabilir. Bir çok durumda, 6-8 saat süre elde etmek için, bir öğretim merkezinden doku hasat yapmak için uygun değildir. Bunun yerine, IRB onaylı protokol kapsamında cenaze evinde tümör dokusu kurtarmak için çağrı üzerine bir doku kurtarma hizmeti olan genellikle doku kazanımı için daha uygundur. Ölüm önceden bilgilendirilmiş onayını aldıktan tavsiye ve lojistik planlama kolaylaştırır. doku alma (eldivenler, örtüler, neşter) için açık ve kapsamlı talimatlar ve steril malzemeleri ile kendi kendine yeten otopsi kitleri hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, araştırmacı, patolog ve cenaze evi arasında iletişimin açık noktaları kurulması önemlidir. Örneğin, araştırmacı önce otopsi için patolog ile protokol tartışmak ve ortak hataları vurgulamak gerekir. Bu hatalar mikro dahilDoku alımı, gecede / hızlandırılmış nakliye ve thermoinsulated kapta yeterli ıslak buz üzerinde örnek gemi arızası ile gemi arızası sırasında bial kirlenme (genellikle maya). Son olarak, biz ulaşım süresini en aza indirmek için numune sevkiyatı için bir kapıdan-kapıya kurye hizmetini kullanmanızı öneririz.
Bakım, hücre canlılığını korumak için doku ayrıştırma sırasında alınmalıdır. Örneğin, tasarlanmış medya kullanımı taşınması için nöral doku sağlığını korumak için (Hazırda-A ile takviye antimikotik / antibiyotik), başarılı bir kültür oluşturma şansını artıracaktır. Her zaman buz üzerinde örnekleri aktararak protokol boyunca soğuk ısıda numuneyi tutmak da önemlidir. Her iki adımlar hücrelere travmatik olarak, protokol başarısını artırabilir öğütme minimize birlikte hem mekanik ve enzimatik ayrılma kesirler toplanıyor. Bizim tecrübelerimize göre, en başarılı kültürlerin hem fraksiyonların dışarı büyürkenBiz iki hazırlıkları tek potansiyel bu örneklerin hassas doğasını yansıtan, dayanıklı kültür tesis örnekleri vardı. protokolde başka travmatik aşama toz haline getirme olduğu; Gerekli öğütülmesinden derecesini azaltabilir bir strateji örnekleri iyice hazırlık başında kıyılır sağlamaktır. Örnek canlılığını artırmak için tasarlanmış protokol yönlerini diğer örnekleri enzimatik ayrılma sırasında özellikle kritik protokolü boyunca (örneğin, HEPES) ekleyerek tamponları bulunmaktadır.
ayrıca hücre canlılığı geliştirmek için bu protokol olası bir değişiklik ACK kırmızı kan hücre parçalama adımının kaldırılmasıdır. Bununla birlikte, bu durumda, kırmızı kan hücreleri çıkarmak için kültür içinde ilk hafta boyunca bir ACK lisiz aşamasını gerçekleştirmek için genellikle gerekli olmaktadır. değiştirilebilir Bu protokolün bir başka özelliği, bir sükroz Densit kullanılarak miyelin ve hücre kalıntılarının ortadan kaldırılmasıdıry degrade. Spesifik olarak, mikroglial hücreleri hücre canlılığını geliştirmek için bildirilen diğer stratejileri, süreksiz Percoll® yoğunluk gradyanı 18 ya da manyetik miyelin çıkarma boncuklar gibi bu aşamada da mümkündür.
Son olarak, ilk doku ayrılma ve neurospheres görünümü arasındaki süre numuneler arasında değişir ve bir ay veya daha fazla bir hafta sürebilir. İlk kültürler genellikle ölü hücrelerden ve hücresel enkaz önemli derecede içerdiğinden, canlı hücreler kalır olup olmadığını belirlemek için zor olabilir; 8 haftalık (Şekil 2) - kültürü en az 4 boyunca muhafaza edilmelidir. Burada sunulan kalan enkaz büyüyen hücrelerin izole etmek için stratejilerden biri (yani taze medya hücre kümeleri ve yeniden kaplama filtreleme ters). kültürünü korumak için devam etmek konusunda karar sonuçta th çevreleyen faktörlere dayanarak bir vaka-by-case karare otopsi (örneğin, uzun bir postmortem interval, doku taşıma sırasında sorunlar), doku ayrışma (örneğin, aşırı kan veya enkaz), ve nasıl örnek kültüründe görünür. bir kültür kurulduktan sonra, kimlik bu amaçla muhafaza orijinal tümör örnek kültür karşılaştırarak, kısa tandem tekrar analiz veya benzer bir yöntem kullanarak DNA parmak izi ile valide edilmelidir. 6 ay - Biz rutin her 3 örneğin, diğer kültürler tarafından kontaminasyon meydana geldi emin olmak için DNA parmak izi ile kültürleri doğrulayarak öneririz.
Bu hasta kaynaklı DIPG kültürlerin nesil etkili tedavilerin başarılı bir şekilde gelişmesinde önemli bir adımı temsil etmektedir. Mevcut hasta kaynaklı DIPG kültürleri ve ksenogreft modelleri genişleme en etkili tedavi stratejilerinin belirlenmesi ve sonuçta bu yıkıcı hastalığın üstesinden gelmek için önemli olacaktır.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle McKenna Claire Vakfı, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NINDS K08NS070926 ve R01NS092597) Ulusal Enstitüsü destek kabul, Savunma Bakanlığı (NF140075), Rejeneratif Tıp (CIRM RB4-06093 ve RN3-06510), Alex'in Limonata için California Institute Vakfı standı, Cure Fiona Penelope, Wayland Villars DIPG Vakfı, Dylan Jewett Anısına Şimdi Vakfı ve DIPG İşbirlikçi, Lyla Nsouli Vakfı, Unravel Pediatrik Kanser, Çocukluk Çağı Beyin Tümörü Vakfı, Matthew Larson Vakfı, V Vakfı, Godfrey Aile Fonu Başlıyor , pediatrik Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen ve Jennifer Kranz Memorial fonlar, N8 Vakfı, Virginia ve Kanser Araştırma DK Ludwig Fonu, Stanford Anne T. Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü'nün ve Robert M. Bass donatılmış Fakültesi Burs kanser ve Kan Hastalıkları.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
