Summary
Здесь мы приводим протокол , чтобы изолировать микроглии от послеродовых щенков мышей (день 1) для экспериментов в пробирке. Этот импровизированный способ выделения генерирует и высокий выход и чистоту, значительное преимущество по сравнению с альтернативными методами, что позволяет широкий диапазон экспериментов для целей выяснения микроглии биологии.
Abstract
Микроглия являются основными ответчиками к центральной системе нервных инсультам; Однако, многое остается неизвестным об их роли в регулировании нейровоспаления. Микроглия являются мезодермальными клетками, которые функционируют так же, как в макрофаги съемки воспалительного стресса. активаций макрофагов классической (М1-тип) и альтернативный (М2-типа) также были распространены на микроглии в попытке лучше понять основные взаимодействие эти фенотипы имеют в нейровоспалительных условиях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и Хантингтона. В пробирке экспериментов с использованием первичной микроглии предлагает быстрые и надежные результаты , которые могут быть распространены на окружающую среду в естественных условиях. Хотя это является явное преимущество по сравнению с экспериментированием в естественных условиях, выделение микроглии при достижении достаточных урожаев оптимальной чистоты была проблемой. Общие методы в настоящее время используются либо страдают от низкого извлечения, низкой чистоты, или обоих. При этом, мы демonstrate уточнения в CD11b метода магнитной сепарации без колонн, что обеспечивает высокое восстановление клеток и повышенную чистоту в половине количества времени. Мы предлагаем этот оптимизированный метод как весьма полезную модель первичной микроглии изоляции для целей изучения нейровоспаления и нейродегенерации.
Introduction
Микроглия являются Myb-независимые макрофаги резидентов мезодермального происхождения, отличающие от с-Kit + / CD45- erythromyeloid клеток - предшественников в крови островках желточного мешок 1, 2. После того, как эмбриологические микроглии колонизировали на центральную нервную систему (ЦНС), они переходят из амебоидных к разветвленной форме 3. Эти взрослые микроглии классифицируются как Surveillant , поскольку их динамические последствия зондировать здоровую паренхиму мозга для потенциальных оскорблений 4. Хотя микроглии только способствуют примерно 10% населения ЦНС клеток, их способность плитки между собой обеспечивает максимальное сканирование паренхимы 4, 5. Опасность-ассоциированные молекулярные структуры (DAMPS), такие как альфа-синуклеин 6, 7 и амилоид-бета, 8 или рathogen-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs) , такие как липополисахариды (LPS) 9, классически активации микроглии для содействия воспалительного ответа , характеризующийся реверсии в активное состояние амебоидной и производство оксида азота, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО), интерлейкин 1 & beta ; (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, и хемокинов CC мотив лиганда 2 9, 10, 11. В нейровоспалительных условиях , таких как болезнь Паркинсона, в котором патогенные α-синуклеина накопил, нейродегенеративного цикл создается из смерти дофаминергических нейронов, которые высвобождают более агрегированный альфа-синуклеина, дальнейшее продвижение классической активации микроглии 7. Подобно периферических макрофагах, микроглии может также иметь возможность альтернативно активировать в присутствии анти-воспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, что дает им сильнодействующимIAL продвижения нейронную ремонта и ослабления воспаления 2, 11. Помимо своих иммунологических ролей в ЦНС, микроглии были описаны как жизненно важные регуляторы нейронной цепи, сокращая синапсов в процессе разработки. Так , например, у мышей KO Cx3cr1- имеет менее плотные микроглии и снижение синаптической обрезку, что приводит к переизбытку дендритных шипов, незрелых синапсов и электрофизиологических моделей неразвитого ЦНСА 12. Понимание этих физиологических сложностей и разнообразные функциональные роли микроглии в гомеостазе ЦНС имеет решающее значение для поиска терапевтических средств, ориентированных на нейродегенеративных расстройств.
В области нейроиммунологии, в пробирке эксперименты весьма желательны из - за большей возможности для механистических исследований, более низкие затраты на техническое обслуживание, а также за то , что меньше времени и трудоемким. Furthermoповторно, способность изолировать популяции клеток имеет решающее значение для очерчивания функциональных возможностей этих клеток-мишеней при заданных условиях. Существует множество способов микроглии изоляции, но они ограничены по своей способности получать относительно высоких количеств и чистоты для широких экспериментов 13, 14, 15. Например, кластер дифференцировки 11b (CD11b) является общим поверхностным маркером моноцитов, макрофагов и микроглии 16. При эксплуатации CD11b, метод магнитной сепарации был впервые описан как подход колонке на основе , которая давала ~ 99,5% чистоты и ~ 1,6 × 10 6 микроглии в неонатальном мозге 17. В нашей лаборатории недавно разработала CD11b магнитный метод разделения без колонн 15, который мы провели в полистирольной трубке, помечая CD11b с моноклональным антителом , конъюгированным с фикоэритрином (PE). Биспецифическое SecondaRy антитела к РЕ и декстран комплексы с ПЭ. После связывания, декстран покрытием магнитные частицы вводятся, которые связываются с декстрана конце комплекса антитела. Наконец, полистирола пробирку помещают в магнит для микроглии изоляции. Этот подход в два раза выход до ~ 3,2 × 10 6 микроглии в неонатальном мозге , но за счет снижения чистоты до ~ 97%.
В данном случае мы демонстрируем быстрый и рафинированный без колонн CD11b магнитной сепарации протокола (Рисунок 1). Этот усовершенствованный метод остается, насколько это возможно, как наш оригинальный метод без колонн, так как цена комплекта магнитной сепарации CD11b является то же самое. Время завершения уменьшается в два раза, что может иметь решающее значение для максимизации выживаемости клеток и выход. Следует отметить, что чистота достигается с этим оптимизированным метода составляет ~> 99%, значительное улучшение по чистоте , достигнутой от первоначального способа без колонн , разработанного нашей лабораторией 15. Самое главное, что CD11b-PEне используется, исключая необходимость инкубировать в защищенном от света и позволяет использовать красный канал для флуоресцентной микроскопии. И, наконец, как в оригинальном способе CD11b, астроциты фракции с высоким выходом и чистоты получается с этим усовершенствованным способом. Астроциты являются наиболее многочисленные глиальные клетки в ЦНС, что приводит к тому , что их гомеостатические функции являются обязательными в отношении патофизиологии 18. Эти глиальные клетки играют важную роль в различных физиологических функций, таких как формирование гематоэнцефалический барьер, обеспечивая питательную поддержку, поддерживая нейромедиатора гомеостаза, образуя глиальные рубцы в ответ на повреждение, нейропротекции, обучения и памяти, а также нейровоспаления, иллюстрирующих их следственную потенциал в глиальных биология 19. Морфология и функциональность микроглии и астроцитов уже было установлено с помощью конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга, количественное в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР QRT), GРисс анализа нитрита, а также мультиплексной цитокин анализа Luminex. Уточнение предусмотрено этот протокол обеспечивает повышенную уверенность , относящуюся к микроглии или астроцитов чистоты, более широкому применению флуоресцентной микроскопии с наличием красного канала, а также экономит время, все из которых имеет важное значение для экспериментов в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных и протокольные процедуры были утверждено и контролируется по уходу и использование комитет Институциональных животных (IACUC) в Университете штата Айова (Ames, IA, США) по
1. Выращивание смешанных глиальных культур
- Обезглавьте 1- 2 дневных щенков быстро с 5,5-дюймовыми работающими ножницами, и сразу же поместить головы в 50 мл пробирку на льду. Обратите внимание, что это обезглавливание является режим эвтаназии.
- В ламинарном воздушном потоке, сделать небольшой разрез в черепах и мозговых оболочках с использованием 4,5 - дюймовыми прямыми микро-рассечением ножницы. Начало резки от хвостового конца до конца рострального (нос). Получить под кожу, используя отверстие , образованное обезглавливание.
- После разреза, очистить один из полушарий в сторону. Затем с помощью пару изогнутого или загнутого пинцета, чтобы удалить весь мозг.
- Погрузить мозг (ы) в новом 50 мл пробирку, содержащую 0,25% трипсин-ethylenediaminetetraacetели кислоту (ЭДТА) в течение 15 мин в С водяной бане при 37 °. С помощью 2 мл трипсина-ЭДТА в мозге.
- Промыть мозг (ы) со свежей ростовой среде (10% FBS, DMEM / F12, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина, 1% пирувата натрия и 1% заменимых аминокислот) путем добавления и удаления СМИ. Повторите 4 раза.
- Для каждого мозга, пластины две Т-75 колбы, содержащей культуральную среду. Поэтому, добавляют 2 мл питательной среды в мозг к трубке. Таким образом, это будет эквивалент 1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды в Т-75 колбу.
- Однородный растиранием мозг (ы) с пипетками различных размеров диафрагмы, в порядке от наибольшего к наименьшему. Когда видно , что ткани мозга не уменьшается, переход к следующей пипетке. В конце растирания, подвеска должно быть ясно, без каких - либо видимых кусков.
- Используйте 25 мл пипетки, 5 мл пипетки, а затем 10 мл пипетки последовательно.
- Передайте каждый гомогенenous суспензии мозга через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы сделать его в одной клеточной культуре.
- Для каждого гомогенизированного мозга, пластинчатые две Т-75 колбы, содержащие культуральную среду, как описано на стадии 1.5 (1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды в Т-75 колбу).
- Изменение питательной среды после 6 дней и расти до изоляции на 16 - й день.
2. Выделение клеток микроглии
- Через 16 дней, удалить культуральную среду из колбы и поместите его в свежей пробирке 50 мл. Добавьте 3 мл 0,25% трипсин-ЭДТА к каждому Т-75 колбу. Встряхните колбы в течение 5 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
- Центрифуга удаляют ростовую среду при 0,4 мкг в течение 5 мин и использовать для остановки трипсина-ЭДТА реакции в последующей стадии.
- После встряхивания в течение 5 мин, добавляют минимум 4 мл среды роста (свежей или использованной среды из 2.1.1), чтобы остановить трипсина-ЭДТА реакции.
- Растирают, чтобы гарантировать, что все сгезов были отделены.
- После растирания, проходят клетки через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы сделать его в одной культуре клеток, выполнить подсчет клеток, а затем спином вниз клеток при 0,4 мкг в течение 5 мин.
- На каждые 100 × 10 6 клеток (примерно 15 х Т-75 колбы), используют 1 мл Рекомендуемый носитель (2% FBS, DPBS (кальций и магний хлоридов), 1 мМ ЭДТА) , чтобы ресуспендируют осадок клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги приспособлены для разделения 1 мл. - Возьмите 5 мл полистирола пробирку, добавляют 1 мл Рекомендованный СМИ, и отметьте мениск. Добавить Рекомендуемый носитель до 2,5 мл, и отметьте это, как хорошо. Отменить Рекомендуемый носитель и передавать ресуспендировали клетку к полистирольной трубке 5 мл.
- Добавьте 50 мкл сыворотки крысы на каждые 1 мл суспендированных клеток. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Приготовьте коктейль выбора путем смешивания 25 мкл компонента А и 25 мкл компонента В. Эти компоненты являются собственностью.
- Добавить 501; л выбора коктейля к клеткам. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Для получения более чистых культур, повторите шаг 2,9 (рекомендуется, но не обязательно). - Вихревые микросферы в течение 45 сек. Добавьте 80 мкл микросфер на 1 мл образца. Инкубирую в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Довести объем до 2,5 мл в пробирку полистирола путем добавления Рекомендуемый носитель.
- Поместите трубку в магните в течение 3 мин при комнатной температуре. Регулировка инкубации повысить чистоту. Медленно вылейте Рекомендуемый носитель в 15 мл трубки с магнитом еще в полистирольной трубке.
- Повторите шаг 2.12 еще три раза. Дополнительное магнитное инкубирование может быть выполнено, чтобы повысить чистоту.
- Добавьте 3 мл среды роста и подсчет количества клеток с использованием счетчика клеток.
- Пластина клетки, соответственно, в поли-D-лизине (PDL) для пластин -покрытия обработок. Относиться к клеткам через 48 ч после посева пластин inPDL-покрытия. Это позволяет клеткам восстановиться после стресса разделения.
Примечание: Cheск чистоты культуры с использованием иммуноцитохимии , как описано выше 15. - Пластинчатый негативную фракцию (собранную в 15 мл трубки), которая в основном содержит астроциты, в Т-75 колбах в среде роста.
- После того, как по меньшей мере 6 ч инкубации в 37 ° C инкубатор, изменить среду, и пусть растут O / N. Разделить астроциты на следующий день для лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроглия изолированы с использованием набора CD11b-позитивной селекции II, имеют высокую чистоту
Первичные микроглии мыши были выделены с использованием вышеуказанного протокола и высевали на покровные поли-D-лизин-покрытием, чтобы проверить чистоту изоляции. Десять тысяч клеток высевали на лунку и иммуногистохимический анализ проводили с использованием ионизированного кальцием-связывающим адаптер молекулы 1 (Iba1) в качестве маркеров микроглии и глиальные фибриллярный кислого белок (GFAP) в качестве маркеров астроцитов, чтобы проверить на чистоту выделенной микроглии , Изолированная культура экспрессируется только Iba1 без экспрессии GFAP (рис 2A), предполагая , что культура изолированных была чисто микроглии. В отличии от других ранее опубликованных методов для первичного отделения микроглии, которая достигла ~ 97% чистоты, с помощью этого метода мы получили чистоту ~> 99% за половину времени. Для дальнейшей проверки чистоты й культура, мы провели Вестерн - блот - 20 для Iba1 и GFAP. Иммуноблот - анализ показал , что в дальнейшем эта изоляции из смешанных глиальных культур была почти чистые микроглии культуры (фигура 2В).
Модифицированная процедура изоляции не имеет никакой автоматической флуоресценции от магнитных шариков
Красный канал не может быть использован для иммуноцитохимии (МУСА) при использовании предыдущего набора для выделения CD11b для разделения микроглии , как упомянуто Гордона и др. 15 из-за использования ПЭ маркировки во время разделения. Используя этот новый комплект изоляции PE-свободно, мы можем использовать красный канал для иммуногистохимического анализа (рисунок 3). Из этого МТП, очевидно, что этот новый метод позволяет нам использовать все каналы для проточной цитометрии или других флуоресцентных исследований изображений.
ve_step»ВОК: Keep-together.within-страницы = "1"> Выделенные микроглии культуры функционально отвечают на LPS стимулДля того, чтобы убедиться в том , что изолированные микроглии функционально активны, мы обрабатывали клетки с LPS, широко используемый стимулятором 9 для активации микроглии, в течение 24 ч перед зондированием для различных провоспалительных факторов. Классическая микроглии активация сопровождается выделением нитрита и различных про-воспалительных цитокинов в средствах массовой информации. Таким образом, мы использовали несколько дополнительных анализы, чтобы подтвердить функциональную активность нашей изолированной микроглии. Во- первых, мы использовали анализ Griess , чтобы показать , что ЛПС резко индуцированной секреции нитритов из изолированной микроглии (рис 4A). Для дальнейшей проверки активности изолированной микроглии, мы использовали QRT-ПЦР , чтобы показать (мессенджера рибонуклеиновой кислоты) уровни мРНК NOS2, другой отличительной чертой микроглии воспаления, значительно улучшена Wiго лечения ЛПС (Фиг.4В). Далее, мы использовали шарик на основе мультиплексного анализа, LUMINEX 21, чтобы проверить , что ЛПС значительно стимулировали секрецию провоспалительных цитокинов из микроглии культуры (фиг.5А). Кроме того, мы проверили с помощью анализа QRT-PCR , что обработка ЛПС усиливается уровни экспрессии гена нескольких провоспалительных цитокинов , включая IL-1 и ФНО (фиг.5В). Все эти данные вместе позволяют предположить, что первичные микроглии изолированы с помощью этого нового способа рафинированного функционально активны и показывать подобный профиль активации в качестве первичных микроглии выделяли с использованием ранее опубликованных методов.
Изолированные микроглии могут быть использованы для сигнализации исследования
Используя предыдущие методы микроглии изоляции, бег западные Лит для сигнальных исследований было трудно, и неосуществимы из-за низкий выход и чистоту. Ранее мы показали , что Fyn, семейство киназы Src, участвуют в провоспалительном сигнальном каскаде в клетках микроглии 9. Здесь мы высевали один миллион клеток микроглии в 12-луночный планшет и через 48 ч, мы собрали клетки для запуска вестерн-блоттинга для нативного Fyn и Src-киназ фосфорилированным по тирозину остатка 416 (р-Src-Y416). Мы смогли обнаружить уровни как Fyn и п-Src-Y416 в наших изолированных клеток микроглии (рисунок 6), показывает , что этот способ применим к Вестерн - блоттинга для сигнализации исследования.
Отрицательная фракция из микроглии разделения содержит астроциты, которые могут быть использованы для сигнализации исследования
Астроциты являются ключевыми игроками в нейровоспалении, и понимание механизмов сигнализации позади ASTRocytic воспаление и нейрон-астроцитов наводок важно 19. Здесь мы покажем , что отрицательная фракция из микроглии разделения содержит GFAP-позитивные астроциты клеток (рис 7А). Кроме того , наш Вестерн - блот - анализ для Fyn и п-Src-Y416 (рис 7В) , показали , что оба из этих белков могут быть обнаружены в отрицательной фракции , а также. Эти результаты показывают, что вместе отрицательная фракция является идеальной подготовкой к астроцитарным исследованиям, направленных на определение белков, важные для воспалительных сигнальных каскадов.
Рисунок 1: Схема Выделение клеток микроглии от 1-2 дней, послеродовых Pups. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версиюиз этой фигуры.
Рисунок 2: микроглии Изолированные с помощью CD11b-позитивного Kit Selection II , имеет высокую чистоту. (А) Иммуноцитохимическая изолированной микроглии культуры зондирования для GFAP в красном канале и Iba1 в зеленом канале. (Б) иммуноблот изолированной микроглии культуры зондирующего для GFAP (~ 51 кДа), Iba1 (~ 15 кДа) и бета-актина (~ 42 кДа). Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Модифицированная процедура изоляции не имеет какую - либо автофлуоресценцию из магнитных шариков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: LPS стимуляция Увеличения Нитритого производство в микроглии культуре. (A) Изолированные клетки микроглии обрабатывают 1 мкг / мл LPS в течение 24 ч и собирали среду обработки для определения нитрит высвобождения путем Грисса анализа. (В) Q-RT-PCR для Nos2 из изолированной микроглии , обработанной LPS в течение 24 ч. Цифры представляют собой средние значения ± SE от 2-х или более независимых экспериментов. Данные были проанализированы с использованием т-критерия Стьюдента (* р0; 0,05, ** р <0,01, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: ЛПС-индуцированный провоспалительная цитокина Освобождение от клеток микроглии. Анализ мультиплекса (А) Luminex проводили на среде обработки собранной из изолированных клеток микроглии , обработанных 1 мкг / мл LPS в течение 24 ч. (В) Q-RT-PCR для IL-1βand TNF & alpha ; с изолированной микроглии , обработанной LPS в течение 24 ч. Цифры представляют собой средние значения ± SE от 2-х или более независимых экспериментов. Данные были проанализированы с использованием т-критерия Стьюдента (* р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Изолированные микроглии могут использоваться для передачи сигналов исследований. Вестерн-блот-анализ показывает, что Fyn и п-Src-Y416 могут быть обнаружен из микроглии, выделенная с нашим новым рафинированным способом.
Рисунок 7: Отрицательный Фракция от микроглии разъединения Содержит астроциты , которые могут быть использованы для передачи сигналов исследований. (А) Вестерн - блоттинг показывает , что отрицательная фракция содержит GFAP-позитивные клетки. (В) Вестерн - блот - анализ показывает , что Fyn и п-Src-Y416 могут быть обнаружены из GFAP-позитивных клеток.целевых = «_blank»> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| параметры | Текущий метод | Модифицированный метод | |
| Стоимость | $ 620 | $ 620 | |
| Время | 55 мин | 25 мин | |
| флуоресценция | Да (красный канал) | нет | |
| чистота | ~ 97% | ~ 99% | |
Таблица 1: Сравнительный анализ между методом изоляции Рафинированных микроглий и оригинальным методом изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Старые способы микроглии изоляции имеют ограниченные извлечения, которые не подходят для различных белков анализов методом вестерн-блоттинга и РНК с помощью анализа QRT-PCR. Дифференциальное сцепление и мягкие методы трипсина два общих подход с низкими выходами микроглии 13, 14, 15. Колонки на основе CD11b подход также имеет низкий уровень восстановления, но достигает большую чистоту , чем дифференциальное присоединение и мягкий трипсин 13, 14, 15, 16, 17. Наш первоначальный без колонн CD11b подход значительно улучшил изолированные выходы, что делает его пригодным для белка и РНК , таких как анализ Вестерн - блоттинга и QRT-PCR, но за счет уменьшенного чистоты 15.
Наш недавно модифицированный метод сохраняетвыходы оригинального метода и немного увеличивает чистоту от ~ 95-97% до ~> 99%, но в половине времени завершения, который является критическим для выживания клеток. Решающие шаги в рамках протокола могут обеспечить оптимальную изоляцию микроглии. В то время как обезглавливание щенков, следует соблюдать осторожность, чтобы держать головы на лед и рассекать в ламинарном воздушной камере в течение 5-10 мин. Продолжительные раз мозга иссечения будет трудно получить полный мозг, потому что он начинает терять свою прочность при температурах окружающей среды, ущербе микроглии урожайности. Следует отметить, что если этап 2.9 повторяют, по меньшей мере, один раз, есть наблюдаемое увеличение чистоты и жизнеспособности. Если выход из разделения является низким, разделение может быть повторено с использованием меньшего количества колб на мл рекомендуемых сред, или путем увеличения объема разделения (> 1 мл). Уменьшение клеточной скученность, как правило улучшит чистоту, жизнеспособность, и выход. Магнитное время инкубации может быть продлено на этапе 2.12 повысить чистоту. Это можетобеспечить надлежащее магнитное связывание микросфер, которые прикреплены к микроглии. Кроме того, дополнительное магнитное инкубирование может быть выполнено на этапе 2.9 для повышения чистоты и выхода.
Осуществимость протокола эквивалентна или лучше, чем оригинальный метод CD11b; однако, новый способ усовершенствован и короче. Другое существенное преимущество , полученное из этого рафинированного метода является возможностью использования красного канала для флуоресцентной микроскопии, которая занята PE в оригинальном методе (таблица 1) 15. Хотя мы получаем высокий выход и чистоту микроглии с методом, астроциты выход, полученный из этого разделения является менее чистым, поскольку он сохраняет некоторые фибробласты. Как описано в шаге 2,17, после того, как покрытие на астроциты и инкубации в течение 6 ч, питательная среда должна быть заменена свежей средой. Астроциты являются первым прикрепиться к колбе, в то время как большая часть фибробластов остаются в SUSPension. Замена носителей обычно удалит большинство загрязняющих фибробластов. Хотя этот метод обеспечивает высокую степень чистоты, астроциты, вторичный способ очистки для достижения более чистых культур является оправданным.
В целом, это модифицированный метод CD11b-изоляция создает высокочистые первичные клетки микроглии и астроциты в коротком промежутке времени. Более короткое время изоляции в целом улучшает показатели выживаемости клеток. Это обеспечивает полезную модель систему для выяснения механизмов, лежащих в основе сигнальных как микроглии и астроглиальную биологию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья (NIH) гранты: NS088206 и ES026892. W. Eugene и Линда Ллойд Обеспеченный Председатель в АГК и деканы профессура АК также признал.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
