Summary
여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.
Abstract
미세 아교 세포는 중추 신경계에 욕설 차 응답자이다; 그러나, 많은 신경 염증을 조절하는 역할에 대한 알 수없는 남아있다. 미세 아교 세포는 염증 스트레스를 측량에서 대 식세포 유사한 기능을 중배엽 세포이다. 고전 (M1 형) 및 대체 (M2 형) 대 식세포의 활성화는 더 나은 이러한 표현형은 파킨슨 병, 알츠하이머, 헌팅턴의 질병과 같은 신경 염증성 조건이 기본 상호 작용을 이해하기위한 노력의 일환으로 미세 아교 세포로 확장되었습니다. 시험관 실험에서 생체 환경에 확장 될 수있다 신속하고 신뢰할 수있는 결과는 차 미세 아교 세포를 제공 활용. 이것은 도전했다 최적 순도 적당한 수율을 달성하면서 미세 아교 세포를 단리 생체 실험을 통해 명백한 장점 않는다. 현재 사용중인 일반적인 방법 중 하나는 낮은 복구, 낮은 순도, 또는 두 가지 모두에서 고통 받고 있습니다. 여기서, 우리는 민주시간의 절반의 양으로 높은 세포 복구 및 순도 향상을 달성 열없는 CD11b를 자기 분리 방법의 구체화를 onstrate. 우리는 신경 염증과 신경 퇴행을 연구의 목적으로 차 미세 아교 분리의 매우 유용한 모델로이 최적화 방법을 제안한다.
Introduction
미세 아교 세포는 C-KIT + / CD45- 차별화 중배엽 기원 MYB 독립적 상주 식세포, 난황 1, 2의 혈액 섬 전구 세포를 erythromyeloid이다. 배아 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)을 식민되면, 그들은 분지 형태 3에 아메바에서 전환. 그들의 역동적 인 파급 효과가 잠재적 인 모욕 4 건강한 뇌 실질을 조사하고 있기 때문 성인 미세 아교 세포는 감시자로 분류됩니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계의 세포 인구의 약 10 %에 기여하지만, 서로의 사이에 타일에 대한 그들의 능력은 실질 4, 5의 최대 스캐닝을 보장합니다. 이러한 α-synuclein의 6, 7, 아밀로이드 β-8, P 등의 위험 - 관련 분자 패턴 (DAMPS)예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (9)와 같은 athogen - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)는 고전 아메바 액티브 상태로 복귀하고 산화 질소의 생산, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터루킨 1β 특징으로하는 염증 반응을 촉진하는 미세 아교 세포를 활성화 (IL-1β), IL-6, IL-12, 및 CC 케모카인 리간드 모티프 2 내지 9, 10, 11. 병원성 α-synuclein의 축적 가지고있는 파킨슨 병과 같은 신경 염증성 조건에서, 신경 퇴행성주기는 더 미세 아교 세포 (7)의 고전적인 활성화를 추진,보다 통합 된 α-synuclein의 출시 도파민 신경 세포의 죽음에서 생성됩니다. 주변 대 식세포와 마찬가지로, 미세 아교 세포는 대안 항 염증성 사이토 카인 IL-4 및 IL-10의 존재 하에서 활성화하는 능력을 갖고 그들에게 효능을 제공 할 수있다염증이 11 신경 수리를 장려하고 감쇠 IAL. 이외에도 CNS에서의 면역 학적 역할에서, 미세 아교 세포는 개발 과정에서 시냅스 가지 치기를하여 신경 회로의 중요 규제로 기술되었다. 예를 들어, Cx3cr1- KO 마우스는 저밀도 및 미세 아교 세포 돌기 쪽 미성숙 시냅스 및 미개발 CNS (12)의 전기 생리 패턴 넘쳐나 리드 감소 시냅스 치기를 갖는다. 중추 신경계의 항상성에 이러한 생리 학적 복잡성과 미세 아교 세포의 다양한 기능적 역할을 이해하는 것은 신경 퇴행성 질환을 대상으로 치료제에 대한 검색에 매우 중요합니다.
neuroimmunology의 영역에서 생체 외 실험 때문에 역학적 연구에 대한 더 큰 가능성의 매우 바람직하며, 낮은 유지 보수 비용과 시간이 적게 걸리고 힘이 덜 드는 것에 대해. Furthermo다시, 세포 집단을 분리하는 능력은 소정의 조건에 따라 그 표적 세포의 기능을 묘사하는 것이 중요하다. 수많은 소교 분리 방법이 존재하지만, 그들은 광범위한 실험 13, 14, 15에 대해 상대적으로 높은 번호 및 순도를 얻을 수있는 능력에 의해 제한된다. 예를 들어, 분화 (11b)의 클러스터 (는 CD11b)는 단핵구, 대 식세포와 미세 아교 세포 (16)의 공통 표면 마커이다. CD11b를 악용하여 자기 분리하는 방법은 제 17 뇌 신생아 당 열 기반 접근법 수득 ~ 99.5 % 순도 및 ~ 1.6 × 106 미세 아교 세포로서 설명 하였다. 본 연구실은 최근 우리가 피코 에리 트린 접합하는 모노클로 날 항체 (PE)와 CD11b를 태깅하여 폴리스티렌 튜브에서 수행되는 열없는 CD11b를 자성 분리 방법 (15)을 개발 하였다. 특이 적 secondaRY 항체 PE 및 PE와 덱스 트란 착물한다. 일단 결합 된 덱스 트란 - 코팅 된 자성 입자는 항체 복합체의 덱스 트란 단부에 결합되는 도입된다. 마지막으로, 폴리스티렌 튜브는 미세 아교 분리를위한 자석에 배치됩니다. 이 방법은에 수율을 두 배로 ~ 신생아 뇌 당 만 ~ 97 %로 순도 감소의 비용으로 3.2 × 10 (6) 미세 아교 세포.
여기서, 우리는 신속하고 세련된 열이없는 CD11b를 자기 분리 프로토콜 (그림 1)를 보여줍니다. CD11b를 자기 분리 키트의 가격이 동일하기 때문에 이러한 개선 된 방법은 오리지널 열없는 방법처럼 가능한 남아있다. 완료 시간은 세포 생존 및 수율을 최대화 결정적 일 수 절반으로 감소된다. 특히,이 최적화 된 방법에서 얻어지는 ~ 순도> 99 %, 15 실험실에서 개발 원래 열없는 방법에서 얻어지는 순도 이상 현저한 개선이다. 가장 중요한 것은, CD11b를-PE빛으로부터 배양의 필요성을 제거하고 형광 현미경에 대한 빨강 채널의 사용을 허용, 사용되지 않습니다. 마지막으로, 원래는 CD11b 방법에서와 같이, 높은 수율 및 순도의 성상 세포 분획이 개선 된 방법으로 얻어진다. 성상은 항상성 기능 병태 생리 (18)과 관련하여 필수 불가결하다는 생각을지도하는 CNS에서 가장 많은 신경 교세포이다. 이 아교 세포는 아교 자신의 조사의 가능성을 예시, 영양 지원을 제공, 혈액 - 뇌 장벽을 형성하는 신경 전달 물질의 항상성을 유지, 손상, 신경에 대한 응답으로 아교 흉터를 형성, 학습 및 메모리 및 신경 염증 등 다양한 생리 기능에 중요한 역할을 생물학 (19). 형태와 미세 아교 세포와 성상 세포의 기능은 공 초점 현미경, 웨스턴 블롯, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR), G를 통해 확인되었다RIESS 아질산 분석하고, 루미 넥스 다중 사이토 카인 분석. 이 프로토콜에 의해 제공되는 정제는 시험관 실험에 중요한 모두, 미세 아교 또는 성상 세포의 순도, 빨강 채널의 가용성과 형광 현미경의 폭 넓은 응용에 관한 신뢰를 증가하고, 시간을 절약 제공합니다.
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Protocol
동물 및 프로토콜 절차의 사용 승인과 기관 동물 케어 및 사용 아이오와 주립 대학위원회 (IACUC) (에임스, IA, USA)에 의해 감독되었다
1. 혼합 배양 성장 폐해
- 5.5 인치 운영 가위 1 이일 된 새끼 빨리 목을 베다, 얼음에 50 ML의 튜브에 즉시 머리를 놓습니다. 이 잘린 안락사의 모드입니다 있습니다.
- 층류 기류 후드, 두개골 및 4.5 인치의 직선 해부 마이크로 가위를 사용하여 수막에 작은 절개 부위를 만든다. 입쪽 끝 (코)로 꼬리 단부에서 절단 시작한다. 잘린 형성된 개구부를 사용하여 피부 아래에 가져옵니다.
- 절개 한 후 옆으로 반구 중 하나를 껍질. 그리고 뇌 전체를 제거하는 곡선 또는 후크 핀셋을 사용합니다.
- 0.25 % 트립신 - ethylenediaminetetraacet를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 뇌 (들)을 담가37 ° C의 물 중탕에서 15 분 동안 아세트산 (EDTA)를 먹었다. 뇌 당 트립신 EDTA의 2 용액을 사용합니다.
- 추가하고 제거하여 신선한 성장 배지 (10 % FBS, DMEM / F12, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민, 1 % 소듐 피루 베이트 및 1 % 비 필수 아미노산)가 뇌 (들)을 씻어 미디어. 이 배를 반복합니다.
- 각 뇌의 경우, 성장 배지를 함유하는 개의 T-75 플라스크 접시. 따라서, 튜브에 뇌 당 성장 미디어의 2 mL를 넣어. 따라서, T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 ㎖의 균질화 뇌 1 ㎖의 등가 일 것이다.
- 가장 작은 행하기 위해, 개구 크기가 상이한 피펫으로 뇌 (들)에 의해 분쇄하여 균질. 뇌 조직은 다음 피펫 전환을 작아지고 있지 않은지를 볼 수있는 경우. 분쇄의 끝에서, 서스펜션은 눈에 보이는 덩어리, 명확해야한다.
- 25 mL의 피펫, 5 ㎖ 피펫 한 다음 10 ㎖ 피펫을 순차적으로 사용한다.
- 각 homog 전달70 μm의 세포 여과기를 통해 enous 뇌 현탁액을 단일 세포 배양 물로 만들려면.
- (T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 mL로 균질화 뇌 1 ㎖) 단계 1.5에 기재된 바와 같이 각각의 뇌 균질 플레이트 개의 T-75 플라스크의 성장 배지를 함유.
- 6 D 후 성장 미디어를 변경하고 16 일 날에 분리 될 때까지 성장한다.
미세 아교 세포의 2. 분리
- 십육일 후, 플라스크에서 성장 미디어를 제거하고 신선한 50ml의 튜브에 넣습니다. 각각의 T-75 플라스크에 3 ㎖의 0.25 % 트립신 EDTA를 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 진탕 플라스크.
- 원심 분리 한 성장을 5 분 동안 0.4 XG에 용지 및 후속 단계에서 트립신 EDTA 반응을 정지 사용.
- 5 분 동안 진탕 한 후, 트립신 EDTA 반응을 정지 성장 (신선 또는 2.1.1에서 사용되는 매체) 미디어 4mL의 최소 추가.
- 보장하기 위해 씹다 그 모든 CELL 학생이 분리되어있다.
- 분쇄 후, 단일 세포로 배양을 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달 셀 카운트를 수행 한 다음 5 분 동안 0.4 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 각 100 × 106 세포 (약 15 X T-75 플라스크)를 위해, 세포 펠렛을 재현 탁하는 추천 미디어 (2 % FBS, DPBS (칼슘 및 마그네슘 클로라이드 무), 1 mM의 EDTA) 1 ㎖를 사용한다.
참고 : 모든 다음 단계는 1 ML의 분리에 맞게 조정됩니다. - , 5 ML의 폴리스티렌 튜브를 타고 권장 미디어의 1 mL를 넣어 반월 상 연골을 표시합니다. 2.5 mL의 최대 권장 미디어를 추가하고도이를 표시합니다. 권장 미디어를 폐기하고 5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브에 재 현탁 세포를 옮긴다.
- 부유 세포의 매 1 mL를 위해 쥐의 혈청 50 μL를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 성분 (A)의 25 μL와 성분 (B)의 25 μL 이들 컴포넌트 독점을 혼합하여 선택 칵테일을 준비한다.
- 50 추가(1) 상기 셀 선택 칵테일 L. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
참고 : 순수한 문화를 들어, 단계를 반복 2.9 (권장하지만 필수는 아닙니다). - 45 초 동안 소용돌이 미소. 시료 1 ㎖ 당 미립자의 80 μL를 추가한다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션.
- 권장 미디어를 추가하여 폴리스티렌 튜브에 2.5 ㎖의 부피를 준비한다.
- 실온에서 3 분 동안 자석에 튜브를 넣고. 순도를 높이기 위해 배양을 조정합니다. 천천히 폴리스티렌 튜브에 여전히 자석을 15 mL의 튜브에 권장 미디어를 붓는다.
- 단계를 반복 2.12 세 번 이상. 추가 인큐베이션은 자기 순도를 증가시키기 위해 수행 될 수있다.
- 성장 배지 3 mL를 첨가하고, 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산.
- 따라서, 폴리 D 라이신 (PDL) 치료를위한 코팅 된 플레이트에서 세포를 플레이트. inPDL - 코팅 된 플레이트를 세포 파종 후 48 시간 동안 처리한다. 이것은 세포 분리의 스트레스로부터 복구 할 수 있습니다.
참고 : 체앞서 설명한 바와 같이 면역 세포 (15)를 사용하여 배양 물의 순도 CK. - 대부분 성장 배지의 T-75 플라스크에서 아스트로 사이트를 포함 (15 ㎖의 튜브에 수집 된) 부의 일부를 접시.
- 37 ° C의 배양기에서 배양 중 적어도 6 시간 후, 배지를 변경하고 / N을 O 성장하자. 치료를 위해 다음날 성상 세포를 분할합니다.
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Representative Results
미세 아교 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 격리
기본 마우스 미세 아교 세포는 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여 절연 및 절연의 순도를 확인하는 폴리 D 라이신 코팅 커버 슬립에 도금했다. 만 개 세포를 단리 미세 아교 세포의 순도를 확인하기 위해 미세 아교 세포 및 성상 세포의 마커로서 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)의 마커로서 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1)를 사용하여 수행 하였다 웰 면역 분석 당 도말 . 단리 배양은 배양 된 미세 아교 세포는 순수했다 절연 것을 시사 GFAP 발현 (도 2A)없는 표현 Iba1. 이 방법을 이용하여 ~ 97 %의 순도를 달성 차 소교 분리 이전에 발행 된 다른 방법과 달리 우리는 시간을 반 ~> 99 % 순도를 획득. 더 일의 순도를 확인하려면 문화, 우리는 Iba1 및 GFAP에 대한 웨스턴 블롯 (20)를 달렸다. 면역 블롯 분석을 상기 혼합 신경교 배양 물에서이 분리가 거의 순수한 소교 배양 (도 2b)를 것을 알았다.
수정 된 격리 절차는 자기 구슬에서 어떤 자동 형광이없는
고든 등의 등에 의해 언급 된 바와 같이 소교 분리 이전 CD11b를 분리 키트를 이용하면 적색 채널은 면역 세포 화학 (ICC)를 사용할 수 없습니다. 때문에 분리시 PE 라벨의 사용 (15). 이 새로운 PE-무료로 분리 키트를 사용하여, 우리는 면역 분석 (그림 3)에 대한 빨강 채널을 사용할 수 있습니다. 이 ICC에서,이 새로운 방법은 우리가 흐름 세포 계측법 또는 다른 형광 이미징 연구를위한 모든 채널을 사용할 수 있음을 알 수있다.
ve_step "FO : 유지 - together.within 페이지는 ="1 "> 고립 된 미세 아교 문화는 기능적으로 LPS 자극에 반응분리 된 미세 아교 세포가 기능적으로 활성화되어 있는지 확인하려면, 우리는 다양한 염증성 요인 프로빙 전에 24 시간 동안, 미세 아교 세포를 활성화, LPS와 함께 널리 사용되는 자극제 9 세포를 처리 하였다. 클래식 미세 아교 활성화는 미디어에 아질산염 및 다양한 염증성 사이토 카인의 방출을 동반한다. 따라서, 우리는 우리의 고립 된 미세 아교 세포의 기능 활동을 확인하기 위해 여러 보완적인 분석을 사용했다. 먼저, LPS 극적 절연 미세 아교 세포 (도 4a)에서 아질산 분비를 유도하는 것을 보여주기 위해 Griess의 분석을 사용 하였다. 더 고립 된 미세 아교 세포의 활동을 확인하려면, 우리는 QRT-PCR은 NOS2, 미세 아교 염증의 또 다른 특징의 mRNA 수준을 (메신저 리보 핵산)를 표시하는 데 사용, 크게 향상된 WI제 LPS 처리 (도 4b). 다음에는 LPS 크게 소교 배양 (도 5a)에서 염증성 사이토 카인의 분비를 촉진하는 것이 확인 비드 기반 다중 분석, 루미 넥스 (21)를 사용했다. 더욱이, 우리는 LPS 처리는 IL-1β 및 TNFα (도 5b) 등 여러 가지 전 염증성 사이토 카인 유전자 발현 수준을 강화하는 것이 QRT-PCR 분석을 통해 확인 하였다. 이러한 모든 데이터는 함께 차 미세 아교 세포가 새로 정제 방법을 이용하여 분리하는 것이 좋습니다 기능적으로 활성 및 기본 미세 아교 세포가 이전에 출판 된 방법을 사용하여 격리와 유사한 활성화 프로필을 보여줍니다.
고립 된 미세 아교 세포 연구를 신호에 사용할 수 있습니다
서양 BLO을, 미세 아교 분리의 이전 방법을 사용하여 실행신호 연구를위한 t으로 인해 낮은 수율과 순도 어렵고 불가능했다. 이전에, 우리는 퓐하는의 Src 가족 키나제는, 미세 아교 세포 (9)의 염증성 신호 캐스케이드에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 12 웰 플레이트에 백만 미세 아교 세포를 도금 및 48 시간 후, 우리는 기본 퓐 서구 말을 실행하기 위해 세포를 수집의 Src는 티로신 잔류 물 416 (P-의 Src-Y416)의 인산화 키나제. 우리는이 방법이 연구 신호 웨스턴 블로 팅 기술에 적용 할 수 있음을 보여주는, 우리의 고립 된 미세 아교 세포 (그림 6)에 퓐 및 P-의 Src-Y416 모두 레벨을 감지 할 수 있었다.
소교 분리의 부정적 분획 시그널링 연구에 사용될 수 성상을 포함
성상 세포는 신경 염증에 중요한 선수이며, ASTR 뒤에 신호 메커니즘을 이해ocytic 염증과 신경 세포 성상 세포 크로스 토크가 중요 (19)이다. 여기에서는 소교 분리에서 제외 분획 GFAP 양성 성상 세포 (도 7A)에 포함되어 있음을 보여준다. 또한, Fyn에 그리고 P-Src에-Y416 (도 7b)에 대한 우리의 웨스턴 블롯 분석은이 단백질의 양뿐만 아니라 음의 부분에서 검출 할 수 있었다. 이들 결과는 함께 음의 분획 염증성 신호 전달 캐스케이드 중요한 단백질을 확인하는 목적으로 연구 성상 이상적인 제제임을 나타낸다.
도 1 : 1-2 일 - 산후 새끼들까지 잔치에서 소교 세포의 분리의 개략도. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의.
그림 2 : 미세 아교 세포 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여입니다. 녹색 채널에 빨강 채널과 IBA1에서 GFAP에 대한 프로빙 고립 된 미세 아교 문화의 (A) 면역 세포 화학. GFAP (~ 51 kDa의) IBA1 (~ 15 kDa의) 및 β 액틴 (~ 42 kDa의) 프로빙 절연 소교 배양 (B) 면역 블롯. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 수정 된 분리 절차 자석 구슬에서 어떤 자동 형광이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 미세 아교 문화 LPS 자극 증가 아질산염 생산. (A) 절연 된 소교 세포는 24 시간 동안 1 ㎍ / ㎖의 LPS로 처리하고, 처리 매체은 Griess 분석으로 아질산염 방출을 결정하기 위해 수집 하였다. 24 시간 동안 LPS로 처리 된 미세 아교로부터 격리 Nos2 대 (B) Q-RT-PCR. 수치는 2 개 이상의 독립적 인 실험에서 SE ± 평균을 나타냅니다. 데이터 학생의 t 테스트를 (사용하여 분석 하였다 * P0, 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 미세 아교 세포에서 염증성 사이토 카인 출시 LPS 유발. (A) 루미 다중 분석법을 24 시간 동안 1 ㎍ / ㎖의 LPS로 처리 격리 된 소교 세포에서 수집 처리 매체상에서 수행 하였다. 24 시간 동안 LPS로 처리 된 미세 아교 세포에서 IL 절연-1βand TNFα에 대한 (B) Q-RT-PCR. 수치는 2 개 이상의 독립적 인 실험에서 SE ± 평균을 나타냅니다. 데이터는 학생의 t-test를 이용하여 분석 하였다 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 여기를 클릭하십시오 이 도면의 확대보기.
그림 6 : 분리 된 미세 아교 세포는 신호 연구에 사용할 수 있습니다. 웨스턴 블롯 분석 퓐 및 P-의 Src-Y416가 새로 세련된 방법으로 분리 된 미세 아교 세포에서 감지 할 수 있음을 보여줍니다.
그림 7 : 미세 아교 분리의 부정적 분수는 신호 연구에 사용할 수 성상을 포함합니다. (A)는 웨스턴 블롯 네거티브 분획 GFAP 양성 세포가 포함되어 있음을 보여준다. (B) 웨스턴 블롯 분석 및 Fyn이 P-Src에-Y416는 GFAP 양성 세포에서 검출 될 수 있다는 것을 보여준다.target = "_ blank"> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 현재 방법 | 수정 방법 | |
| 비용 | $ (620) | $ (620) | |
| 시각 | 55 분 | 25 분 | |
| 형광 | 예 (빨강 채널) | 아니 | |
| 청정 | ~ 97 % | ~ 99 % | |
표 1 : 정제 된 소교 분리 방법 및 격리 원래 방법 간의 비교 분석.
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Discussion
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우리의 새로 수정 방법은 유지상기 원래있어서 수율 및 95-97 %의 ~> 99 % ~ 약간 순도를 증가 시키지만, 세포 생존에 중요한 반 완료 시간이다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 최적의 미세 아교 격리를 보장 할 수 있습니다. 새끼를 목이 동안 치료 얼음에 헤드를 유지하고 50-10 분 내에 층류 챔버 해부주의해야한다. 장기간의 뇌 절제 시간은 미세 아교 수율 저하, 그것은 주위 온도에서의 견고 함을 잃고 시작하기 때문에 어려운 전체 뇌를 얻을 수 있도록합니다. 단계 2.9 회 이상 반복되는 경우 특히, 순도 및 생존 능력의 관찰 증가가있다. 분리의 수율이 낮은 경우, 분리하거나 분리의 체적 (> 1 ml)로 증가하여 추천 미디어 1 ㎖ 당 적게 플라스크를 사용하여 반복 될 수있다. 감소 세포 군집은 일반적으로 순도, 생존 및 수율을 향상시킬 수 있습니다. 자기 배양 시간은 순도를 증가시키는 단계를 2.12으로 연장 될 수있다. 이 수미세 아교에 부착 된 미립자의 자기 결합 적절한 보장. 또한, 추가로 자기 인큐베이션 순도 및 수율 향상을 위해서 단계 290에서 수행 될 수있다.
프로토콜의 가능성은 원래는 CD11b 방법보다 더 나은 또는 동등하다; 그러나, 새로운 방법은 세련되고 짧습니다. 이 정제 방법으로부터 얻은 다른 중요한 장점은 기존 방법 (표 1) (15)에 의해 점유 PE 형광 현미경 용 적색 채널을 사용하는 옵션이다. 우리는 방법으로 미세 아교 세포의 높은 수율과 순도를 얻을 수 있지만 그것은 일부 섬유 아세포를 유지하기 때문에, 이러한 분리에서 얻은 성상 세포 수율은 덜 순수하다. 단계 2.17에 기재된 바와 같이, 성상 세포를 도금하고 6 시간 동안 배양 한 후, 성장 배지를 신선한 미디어로 대체되어야한다. 섬유 아 세포의 대부분은 SUSP에 남아있는 동안 성상은 플라스크에 부착 최초로ension. 미디어의 교체는 일반적으로 오염 섬유 아 세포의 대부분을 제거합니다. 이 기술은 성상 세포의 순도를 보장하지만, 순수 배양을 달성하는 이차 정제 방법은 보증된다.
전반적으로,이 변형 CD11b를 분리 방법은, 짧은 시간에 고순도의 차 미세 아교 세포 및 성상 세포를 생성한다. 짧은 시간 분리는 일반적으로 세포의 생존율을 향상시킨다. 그것은 미세 아교 및 astroglial 생물학 모두의 기초가되는 신호 메커니즘을 해명하기위한 유용한 모델 시스템을 제공한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
NS088206 및 ES026892 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 보조금에 의해 지원되었다. 더블유 유진과 린다 로이드 기증 의자 AGK하고 AK에 학장 교수도 인정된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
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