Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.
Abstract
Microglia são os principais respondedores a insultos do sistema nervoso central; no entanto, muito permanece desconhecido sobre o seu papel na regulação da neuroinflamação. Microglia s culas da mesoderme que funcionam de forma semelhante aos macrófagos na topografia de stress inflamatório. O (M1-type) clássica e alternativa (do tipo M2) ativações de macrófagos também foram estendidos para microglia em um esforço para melhor compreender a interação subjacente estes fenótipos têm em condições neuroinflamat�ios como Parkinson, Alzheimer e doença de Huntington. Em experiências in vitro, utilizando a microglia primário oferece resultados rápidos e fiáveis, que podem ser estendidos para o ambiente in vivo. Embora esta seja uma clara vantagem sobre a experimentação in vivo, isolando microglia ao conseguir rendimentos adequados de pureza óptima tem sido um desafio. Os métodos mais comuns actualmente em uso quer sofrem de baixa recuperação, baixo grau de pureza, ou ambos. Aqui, nós demmonstrar um refinamento do CD11b método de separação magnética sem colunas que atinge uma célula de recuperação elevado e pureza melhorada em metade da quantidade de tempo. Propomos este método otimizado como um modelo altamente útil de isolamento microglial primário para fins de estudar neuroinflamação e neurodegeneração.
Introduction
Microglia são macrófagos residentes Myb-independentes de origem mesodérmica, que diferenciam a partir de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores nas ilhas de sangue do saco vitelino 1, 2. Uma vez que a microglia embriológicos colonizaram o sistema nervoso central (SNC), que a transição de uma para uma forma amebóide ramificado 3. Estes microglia adultos são classificados como surveillant desde suas ramificações dinâmicas sondar o parênquima cerebral saudável para potenciais insultos 4. Embora microglia só contribuem para aproximadamente 10% da população de células do SNC, a sua capacidade de telha entre si assegura varrimento máxima do parênquima 4, 5. Padrões perigo-associados moleculares (amortece), tais como α-sinucleína 6, 7 e 8-amilóide β, ou ppadrões moleculares athogen-associados (PAMP), tais como lipopolissacáridos (LPS) 9, classicamente activar microglia para promover uma resposta inflamatória, caracterizada pela reversão para o estado activo amebóide e a produção de óxido nítrico, factor de necrose tumoral-α (TNF?), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, e o motivo de quimiocina CC 2 9, 10, 11. Em condições neuro-inflamatórias, tais como a doença de Parkinson, em que patogénico α-sinucleína acumulou, um ciclo neurodegenerativa é criada a partir da morte de neurónios dopaminérgicos, que libertam mais agregado α-sinucleína, promovendo ainda mais a activação de microglia clássica 7. Semelhante aos macrófagos periféricos, microglia pode também ter a capacidade para activar, alternativamente, na presença das citocinas anti-inflamatórias de IL-4 e IL-10, dando-lhes a potenteial de promover a reparação neural e atenuar a inflamação 2, 11. Para além das suas funções imunológicas no SNC, microglia foram descritos como reguladores vitais do circuito neuronal pela poda sinapses durante o desenvolvimento. Por exemplo, os ratinhos KO Cx3cr1- têm microglia menos densas e reduzida poda sináptica, o que leva a um excesso de espinhas dendriticas, sinapses imaturas, e os padrões electrofisiológicas de um CNS subdesenvolvida 12. Compreender estas complexidades fisiológicas e os diversos papéis funcionais da microglia na homeostase do SNC é crítica para a procura de agentes terapêuticos alvo desordens neurodegenerativas.
Na área de neuroimmunology, em experiências in vitro são altamente desejável por causa da maior viabilidade para estudos mecanicistas, os mais baixos custos de manutenção, e por ser menos tempo e trabalho intensivo. Furthermore, a capacidade para isolar populações de células é crítica para delinear a funcionalidade dessas células alvo sob condições prescritas. Existem numerosos métodos de isolamento microgliais, mas são limitadas pela sua capacidade para obter números relativamente elevados e pureza para a experimentação 13, 14, 15. Por exemplo, um aglomerado de diferenciação 11b (CD11b) é um marcador de superfície comum de monócitos, macrófagos, e microglia 16. Através da exploração de CD11b, um método de separação magnética foi descrito pela primeira vez como uma abordagem baseada em coluna que produziu ~ 99,5% de pureza e ~ 1,6 x 10 6 por microglia cerebral neonatal 17. O nosso laboratório desenvolvido recentemente um método de separação magnética CD11b livre de coluna 15, o que foi realizado num tubo de poliestireno por marcação CD11b com um anticorpo monoclonal conjugado com ficoeritrina (PE). A seconda biespec�icaanticorpo ry a PE e complexos de dextrano com o PE. Uma vez ligado, partículas magnéticas revestidas com dextrano são introduzidos, os quais se ligam ao fim de dextrano do complexo anticorpo. Por fim, o tubo de poliestireno é colocado em um íman para o isolamento da microglia. Esta abordagem duplicou o rendimento de ~ 3,2 x 10 6 por microglia do cérebro neonatal, mas à custa de reduzir a pureza de ~ 97%.
Aqui, demonstramos uma coluna isenta de CD11b protocolo de separação magnética rápida e refinado (Figura 1). Este método melhorado permanece como viável como o nosso método isento de coluna original já que o preço do kit de separação magnética CD11b é o mesmo. O tempo de conclusão é reduzido para metade, o que pode ser crucial para maximizar a sobrevivência das células e o rendimento. Notavelmente, a pureza conseguida por este método é optimizado ~> 99%, uma melhoria significativa sobre a pureza obtida a partir do método isento de coluna original desenvolvido pelo nosso laboratório 15. Mais importante ainda, CD11b-PEnão é utilizado, eliminando a necessidade de incubar ao abrigo da luz e permitindo o uso do canal de vermelho para a microscopia de fluorescência. Por último, tal como no método CD11b original, uma fracção astrocítica de elevado rendimento e pureza é obtida com este método melhorado. Os astrócitos são as mais numerosas células gliais no sistema nervoso central, levando à idéia de que as suas funções homeostáticas são indispensáveis em relação à fisiopatologia 18. Estas células gliais desempenhar um papel em diversas funções fisiológicas, tais como a formação da barreira sangue-cérebro, proporcionando suporte de nutrientes, mantendo neurotransmissor homeostase, formando cicatrizes gliais em resposta a uma lesão, a neuroproteco, a aprendizagem e a memória, e neuroinflamao, exemplificando o seu potencial de investigação no glial biologia 19. Morfologia e funcionalidade da microglia e astrócitos foram verificados através de microscopia confocal, transfercia de Western, quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR), Lensaio de nitritos Riess, e o ensaio multiplex citocina Luminex. O refinamento fornecida por este protocolo oferece maior confiança relativos à pureza da microglia ou astrócitos, a aplicação mais ampla da microscopia de fluorescência com a disponibilidade do canal de vermelho, e economiza tempo, todos os quais são importantes para experimentação in vitro.
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Protocol
O uso dos animais e procedimentos protocolares foram aprovados e supervisionados pela Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Estadual de Iowa (Ames, IA, EUA)
1. Crescimento de culturas gliais mistas
- Decapitar 1- filhotes de 2 dias de idade rapidamente com uma tesoura que operam 5,5 polegadas, e colocar as cabeças imediatamente em um tubo de 50 ml em gelo. Note que esta decapitação é o modo de eutanásia.
- Num capuz de fluxo de ar laminar, fazer uma pequena incisão no crânio e as meninges utilizando 4,5 polegadas rectas-dissecando micro tesouras. Começar a cortar a partir do final caudal à extremidade rostral (nariz). Obter por baixo da pele utilizando a abertura formada pela decapitação.
- Após a incisão, descascar um dos hemisférios até a lado. Em seguida, usar um par de pinças curvas ou em forma de gancho para remover todo o cérebro.
- Mergulha-se o cérebro (s) em um tubo de 50 ml novo, contendo 0,25% de tripsina-ethylenediaminetetraacetComeram ácido acético (EDTA) durante 15 min num banho de água a 37 ° C. Utilizam-se 2 ml de tripsina-EDTA por cérebro.
- Lavar o cérebro (s) com meio fresco de crescimento (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio, e 1% aminoácidos não-essenciais) através da adição e remoção do meios de comunicação. Repita este 4x.
- Para cada cebro, placa dois frascos T-75 contendo o meio de crescimento. Por isso, adicionar 2 ml de meio de crescimento por cérebro para o tubo. Assim, será um equivalente de 1 ml de homogeneizado cerebral com 9/8 mL de meio de crescimento por T-75 balão.
- Homogeneizar por trituração do cérebro (s) com pipetas de diferentes tamanhos de abertura, na ordem da maior para a menor. Quando é visível que o tecido cerebral não está ficando menor, a transição para a próxima pipeta. No final da trituração, a suspensão deve ser claro, sem pedaços visíveis.
- Usar uma pipeta de 25 mL, 5 mL de pipeta, e, em seguida, uma pipeta de 10 sequencialmente.
- Passe cada homogsuspensão cérebro enous através de um filtro de células de 70 ^ m a torná-lo em uma única cultura celular.
- Para cada cerebral homogeneizado, placa dois frascos T-75 contendo o meio de crescimento, tal como descrito no passo 1.5 (1 ml de homogeneizado cerebral com 9/8 mL de meio de crescimento por T-75 balão).
- Mudar o meio de crescimento depois de 6 d e crescer até isolamento no 16º dia.
2. Isolamento de células microgliais
- Após 16 dias, remover o meio de crescimento a partir do frasco e colocá-lo em um tubo de 50 ml fresco. Adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA a cada frasco T-75. Agitar os frascos de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital.
- Centrifugar o meio de crescimento removido em 0,4 xg durante 5 min e utilizar para parar a reacção de tripsina-EDTA no passo subsequente.
- Após agitação durante 5 min, adicionar um mínimo de 4 ml de meio de crescimento (fresco ou o meio utilizado a partir de 2.1.1) para parar a reacção de tripsina-EDTA.
- Triturar para garantir que todos os cells foram destacados.
- Após trituração, passar as células através de um coador de células de 70 ^ m a torná-lo em uma cultura de células individuais, realizar uma contagem de células, e depois girar para baixo as células a 0,4 x g durante 5 min.
- Para cada 100 x 10 6 culas (cerca de 15 x frascos T-75), 1 mL de usar materiais recomendados (2% de FBS, DPBS (cálcio e magnésio livre de cloreto), EDTA 1 mM) para ressuspender o sedimento celular.
NOTA: Todos os passos que se seguem foram concebidos para um mL de separação 1. - Tome um mL tubo de 5 poliestireno, adicionar 1 ml de materiais recomendados, e marcar o menisco. Adicionar mídia recomendada até 2,5 mL e marcar este também. Descartar a materiais recomendados e transferência das células ressuspensas para o tubo de polistireno de 5 ml.
- Adicionar 50 uL de soro de rato para cada 1 mL de células em suspensão. Incubar durante 5 min à TA.
- Prepare cocktail selecção por mistura de 25 uL de componente A e 25 mL de componente B. Estes componentes são proprietários.
- Adicionar 501; L de cocktail de selecção para as células. Incubar durante 5 min à TA.
NOTA: Para obter culturas puras, repita o passo 2.9 (recomendado, mas não obrigatório). - microesferas de vórtice durante 45 segundos. Adicionar 80 ul de microesferas por 1 ml de amostra. Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Levar o volume até 2,5 mL em tubo de poliestireno, adicionando a materiais recomendados.
- Colocar o tubo no íman durante 3 minutos à temperatura ambiente. Ajustar a incubação para aumentar a pureza. Lentamente, deitar fora a mídia recomendada para um tubo de 15 mL com o ímã ainda no tubo de poliestireno.
- Repita o passo 2,12 mais três vezes. incubações magnéticos adicionais podem ser realizadas para aumentar a pureza.
- Adicionar 3 ml de meio de crescimento e contar o número de células utilizando um contador de células.
- células da placa em conformidade em Poli-D-lisina (PDL) revestidas com placas de tratamentos. Tratar as células 48 h após a sementeira placas inPDL-revestidos. Isto permite que as células para recuperar do stress de separação.
NOTA: Check a pureza da cultura usando imunocitoquímica, tal como descrito anteriormente 15. - Placa da fracção negativa (recolhida num tubo de 15 mL), o qual contém principalmente os astrócitos, em frascos T-75 em meio de crescimento.
- Depois de pelo menos 6 horas de incubação em 37 ° C incubadora, mudar o meio e deixar crescer O / N. Dividir os astrócitos no dia seguinte para tratamentos.
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Representative Results
Microglia isolado utilizando o kit de CD11b selecção positiva II têm alta pureza
microglia primários de ratinho foram isolados utilizando o protocolo acima mencionado e plaqueadas em lamelas de poli-D-lisina-revestidas para verificar a pureza de isolamento. Dez mil células foram plaqueadas por cavidade e análise imunocitoquimica foi efectuada utilizando molécula de adaptador se liga a cálcio ionizado 1 (Iba1) como um marcador da microglia e proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como um marcador de astrócitos para verificar se a pureza da microglia isolado . A cultura isolado apenas expressou Iba1 sem expressão de GFAP (Figura 2A), sugerindo que a cultura foi isolada microglia puros. Ao contrário de outros métodos previamente publicados para a separação da microglia primário, o que conseguido ~ 97% de pureza, usando este método obteve-se ~> 99% de pureza em metade do tempo. Para validar ainda mais a pureza do th é a cultura, corremos um Western blot 20 para Iba1 e GFAP. A análise de imunotransferência revelou ainda que este isolamento a partir das culturas gliais mistas foi uma cultura da microglia quase puro (Figura 2B).
O processo de isolamento modificado não tem qualquer auto-fluorescência de esferas magnéticas
O canal vermelho não pode ser utilizado para a imunocitoquímica (ICC) quando utilizando o kit de isolamento anterior CD11b para separação da microglia, como mencionado por Gordon et al. 15, devido à utilização de rotulagem PE durante a separação. Usando este novo kit de isolamento de livre-PE, que pode utilizar o canal vermelho para análise imunocitoquímica (Figura 3). Deste ICC, é evidente que este novo método nos permite usar todos os canais de citometria de fluxo ou outros estudos de imagem fluorescentes.
ve_step" fo: manter-together.within-page = "1"> culturas microgliais isolados funcionalmente responder a LPS estímuloPara verificar que a microglia isolado são funcionalmente activo, que tratado as células com LPS, um estimulante amplamente utilizado 9 para activar microglia, durante 24 h antes de sondagem para vários factores pró-inflamatórios. activação microglial clássica é acompanhada pela libertação de nitrito e várias citocinas pró-inflamatórias para o meio. Por isso, utilizou-se vários ensaios complementares para confirmar a actividade funcional da nossa microglia isolado. Em primeiro lugar, utilizou-se o ensaio de Griess para mostrar que o LPS induzido drasticamente a secreção de nitrito a partir da microglia isolado (Figura 4A). Para validar ainda mais a actividade da microglia isolado, foi utilizado qRT-PCR para mostrar (mensageiro ribonucleico ácido) os níveis de ARNm de NOS2, uma outra característica da inflamação da microglia, wi significativamente melhoradath tratamento com LPS (Figura 4B). Em seguida, utilizou-se um ensaio multiplex com base em grânulo, Luminex 21, para verificar que o LPS estimulou significativamente a secreção de citoquinas pró-inflamatórias a partir da cultura da microglia (Figura 5A). Além disso, verificou-se através de análise de qRT-PCR que o tratamento com LPS aumentou os níveis de diversas citocinas pró-inflamatórias, incluindo a IL-1β e TNFa (Figura 5B) de expressão de genes. Todos estes dados sugerem em conjunto que a microglia primárias isolado utilizando este método recém-refinado são funcionalmente activos e apresentam um perfil de activação similar ao da microglia primárias isoladas utilizando métodos publicados anteriormente.
Isoladas microglia pode ser usado para a sinalização estudos
Utilizando os métodos anteriores de isolamento da microglia, executando blo ocidentaist para estudos de sinalização foi difícil e impraticável devido ao baixo rendimento e pureza. Anteriormente, mostrámos que Fyn, uma cinase da família Src, está envolvido numa cascata pró-inflamatória de sinalização em células microgliais 9. Aqui nós plaqueadas um milhão de células microgliais em uma placa de 12 poços e após 48 h, foram colhidos das células para executar transfercias de Western para Fyn nativa e Src quinases fosforilada no resíduo de tirosina 416 (p-Src-Y416). Fomos capazes de detectar níveis tanto Fyn e p-Src-Y416 nas nossas células microgliais isolado (Figura 6), mostrando que este método é aplicável a técnicas de transferência Western para a sinalização estudos.
A fracção negativa a partir da separação da microglia contém astrócitos que pode ser usado para a sinalização estudos
Os astrócitos são elementos fundamentais de neuroinflamação, e compreender os mecanismos de sinalização por trás astrinflamação ocytic e cross-talk neurônio-astrócito é importante 19. Aqui, mostramos que a fracção negativa a partir da separação da microglia contém células astrocíticos positivos para GFAP (Figura 7A). Além disso, a análise de Western blot para Fyn e p-Src-Y416 (Figura 7B) mostrou que ambas estas proteínas pode ser detectada na fracção negativa, bem. Estes resultados em conjunto demonstram que a fracção negativa é uma preparação ideal para estudos astrocíticos que visam identificar proteínas importantes para cascatas inflamatórias de sinalização.
Figura 1: Representação esquemática de Isolamento de células microgliais de filhotes de cachorro-1-2 dias pós-natais. Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.
Figura 2: Microglia isolada que usa o Kit Seleção CD11b positiva II têm alta pureza. (A) A imunocitoquímica de cultura microglial isolado sondagem para GFAP no canal vermelho e IBA1 no canal verde. (B) de imunotransferência da cultura da microglia isolado sondagem para GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) e β-Actina (~ 42 kDa). Escala da barra = 20 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O processo de isolamento Modified não tem nenhum Auto-fluorescência de esferas magnéticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: LPS Estimulação Aumento da produção de nitrito em Cultura microglia. Células microgliais Isolado (A) tratada com 1 ug / mL de LPS durante 24 horas e o meio de tratamento foram recolhidas para determinar a libertação de nitrito por ensaio de Griess. (B) Q-RT-PCR para NOS2 de microglia isolado tratado com LPS durante 24 h. Os números representam a média ± DP de 2 ou mais experiências independentes. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student (p *0; 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: LPS induzida por citocinas pró-inflamatórias de lançamento a partir de células microgliais. Ensaio multiplex (A) Luminex foi realizada no meio de tratamento, recolhidos a partir de células microgliais isolados tratados com 1 ug / mL de LPS durante 24 h. (B) Q-RT-PCR para IL-1βand TNFa de microglia isolado tratado com LPS durante 24 h. Os números representam a média ± DP de 2 ou mais experiências independentes. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Isolado Microglia pode ser usado para Estudos de sinalização. A análise Western blot mostra que Fyn e p-Src-Y416 pode ser detectada a partir da microglia isolados com o nosso método de recém-refinado.
Figura 7: A Fraction negativo da separação microglia Contém astrócitos que pode ser usado para Estudos de sinalização. (A) Western Blot mostra que a fracção negativo contém células positivas para GFAP. (B) Análise de transferência de Western mostra que Fyn e p-Src-Y416 pode ser detectada a partir das culas positivas para GFAP.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| parâmetros | método atual | método modificado | |
| Custo | $ 620 | $ 620 | |
| Tempo | 55 min | 25 min | |
| Fluorescência | Sim (canal vermelho) | Não | |
| Pureza | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabela 1: Análise comparativa entre o método de isolamento de refinado microglia e o método original de isolamento.
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Discussion
Mais antigos métodos de isolamento microgliais têm recuperações limitados que não são apropriados para diversas análises de proteína por transferência de Western e análise de RNA por qRT-PCR. A adesão diferencial e métodos tripsinização leves são duas abordagens comuns, com baixos rendimentos microgliais 13, 14, 15. A abordagem baseada em CD11b coluna também tem baixa recuperação, mas consegue uma maior pureza do que a adesão diferencial e tripsinização suave 13, 14, 15, 16, 17. A nossa abordagem original livre de coluna CD11b melhorou grandemente os rendimentos isolados, tornando-o adequado para a proteína e o ARN análises tais como Western blotting e qRT-PCR, mas à custa da diminuição da pureza 15.
O nosso método recentemente modificada retémos rendimentos do método original e aumenta a pureza ligeiramente de ~ 95-97% a ~> 99%, mas em metade do tempo de conclusão, que é crítico para a sobrevivência da célula. passos cruciais dentro do protocolo pode assegurar o isolamento da microglia óptima. Enquanto decapitar os filhotes, deve ser tomado cuidado para manter a cabeça em gelo para dissecar e numa câmara de fluxo laminar do ar dentro de 5-10 min. vezes excisão cérebro prolongados tornará difícil obter o cérebro completo porque começa a perder a sua solidez à temperatura ambiente, comprometendo os rendimentos microgliais. Nomeadamente, se o passo 2.9 é repetido pelo menos uma vez, há um aumento observável na pureza e viabilidade. Se o rendimento da separação é baixo, a separação pode ser repetido utilizando o menor número de frascos por mL de meio recomendado, ou pelo aumento do volume de separação (> 1 mL). Diminuindo aglomeração de células geralmente vai melhorar a pureza, viabilidade, e rendimento. O tempo de incubação magnético pode ser estendido no passo 2.12 a aumentar a pureza. Isso podeassegurar adequada magnético de ligação das microesferas que estão ligados aos microglia. Além disso, as incubações magnéticos adicionais podem ser realizadas no passo 2.9 para a causa do aumento da pureza e rendimento.
A viabilidade do protocolo é equivalente ou melhor do que o método de CD11b original; no entanto, o novo método é refinado e mais curto. Outra vantagem significativa obtida com este método refinado é a opção de utilizar o canal vermelho para microscopia de fluorescência, que é ocupada pela PE no método original (Tabela 1) 15. Embora nós obter um rendimento elevado e pureza da microglia com o método, o rendimento obtido a partir de astrócitos esta separação é menos puro, uma vez que retém alguns fibroblastos. Tal como descrito no passo 2.17, após o plaqueamento os astrócitos e incubou-se durante 6 h, o meio de crescimento deve ser substituído por meio fresco. Os astrócitos são os primeiros a anexar ao balão, enquanto grande parte dos fibroblastos permanecer em suspension. A substituição dos meios de comunicação em geral, irá remover a maioria dos fibroblastos contaminantes. Embora esta técnica assegura um elevado grau de pureza de astrócitos, um método de purificação secundário para atingir culturas puras é garantido.
Em geral, este método de isolamento CD11b modificado gera células microgliais primários altamente puros e astrócitos em um curto período de tempo. O tempo mais curto isolamento geralmente melhora as taxas de sobrevivência de células. Ele fornece um sistema modelo útil para elucidar os mecanismos de sinalização subjacentes tanto microglial e biologia astroglial.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Subvenções: NS088206 e ES026892. O W. Eugene e Linda Lloyd cadeira dotada para AGK e Deans Professorship para AK também são reconhecidas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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