Summary
Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.
Abstract
Mikroglia merkezi sinir sistemi sıvı ataklarında birincil yanıt olarak; Ancak çok nöro-inflamasyonu düzenleyen rolleri hakkında bilinmiyor. Mikroglia inflamatuar stresi ölçme makrofajlar benzer şekilde işlev mezodermal hücrelerdir. Klasik (M1-tipi) ve alternatif (M2-tipi) makrofajlar aktivasyonlar da daha iyi bu fenotipleri böyle Parkinson, Alzheimer ve Huntington Hastalıkları gibi nöro koşullarda sahip altta yatan etkileşimi anlamak için bir çaba mikroglia uzatılmıştır. In vitro deney in vivo ortama uzatılabilir hızlı ve güvenilir sonuçlar birincil mikroglia sunmaktadır kullanılarak. Bu sorun olmuştur uygun saflıkta yeterli verimler elde ederken mikroglia izole in vivo deney üzerinde açık bir avantaj olmasına rağmen. Şu anda kullanımda olan Sık kullanılan yöntemler ya düşük kurtarma, düşük saflık veya her ikisi muzdarip. Bu yazıda, demlenmeyesürenin yarısı miktarda yüksek hücre kurtarma ve gelişmiş saflıkta elde kolonsuz CD11 manyetik ayırma yönteminin bir arıtma onstrate. Biz nöro-inflamasyonu ve nörodejenerasyonu okuyan amacıyla ana mikroglial izolasyonun son derece yararlı bir model olarak bu duruma getirilmiş yöntem önerilmektedir.
Introduction
Mikroglia c-kit + / CD45- ayırt mezodermal kökenli myb bağımsız yerleşik makrofajlar yolk kesesi 1, 2, kan Adaları progenitörleri erythromyeloid bulunmaktadır. Embriyolojik mikroglia merkezi sinir sistemini (CNS) kolonileştiklerinde, bir dallanmış formda 3'e bir amoeboid geçiş. Dinamik yansımaları potansiyel hakaretler 4 için sağlıklı beyin parankimi soruşturma beri Bunlar yetişkin mikroglia surveillant olarak sınıflandırılır. Mikroglia sadece MSS hücre nüfusunun yaklaşık% 10'una katkıda rağmen, kendi aralarında döşemek için yetenekleri parankimindeki 4, 5 maksimal tarama sağlar. Örneğin α-sinüklein 6, 7 ve amiloid-P 8 ya da p tehlikesi ile bağlantılı moleküler yapılar (DAMPS),lipopolisakarid (LPS) ile 9 olarak athogen ilişkili moleküler yapılar (PAMP), klasik amoeboid etkin duruma reversiyon ve nitrik oksit üretimi, tümör nekroz faktörü-α (TNFa), interlökin 1β ile vasıflandırılan enflamatuar bir tepki teşvik etmek mikroglia aktive (IL-1β), IL-6, IL-12 ve kemokin CC motifi ligandı 2 9, 10, 11. Patojenik α-sinüklein birikmiş olan Parkinson hastalığı gibi nöro koşullarında, bir nörodejeneratif döngüsü ayrıca mikroglia 7 klasik aktivasyonunu teşvik, daha birleşik α-sinükleinin serbest dopaminerjik nöronların ölümden oluşturulur. periferal makrofajlar benzer şekilde, mikroglia da alternatif olarak, anti-enflamatuar sitokinlerin IL-4 ve IL-10 varlığında aktive etme yeteneğine sahip onları etkili verecek şekilde olabiliriltihap 2, 11 sinir tamirinin geliştirilmesi ve hafifletme ial. Kenara CNS'de immünolojik rolleri, mikroglia gelişim sırasında sinaps budama nöronal devrenin hayati düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. Örneğin, Cx3cr1- KO fareleri, daha az yoğun mikroglia ve dendritik dikenler, olgunlaşmamış sinaps ve gelişmemiş bir CNS 12 elektrofizyolojik desen bir çok artışına neden düşük sinaptik budama sahiptir. CNS homeostazında bu fizyolojik karmaşıklığını ve mikroglia farklı işlevsel roller anlama nörodejeneratif bozuklukların hedefleyen terapötikler araştırılmasında için çok önemlidir.
Nöroimmünoloji alanında, in vitro deneyler için mekanik çalışmalar için daha fizibilite yüksek ölçüde istenebilecektir, düşük bakım maliyeti, daha az zaman ve emek-yoğun olduğu için. Furthermoyeniden hücre popülasyonlarının izole edilmesi yeteneği öngörülen koşullar altında, bu hedef hücrelerin işlevini tarif etmek önemlidir. Çok sayıda mikrogliyal izolasyon yöntemleri mevcuttur, ancak bunlar geniş bir deney 13, 14, 15 için nispeten yüksek bir sayı ve saflık elde etme kabiliyetleri ile sınırlıdır. Örneğin, farklılaşma 11b, bir küme (CD11), monositler, makrofajlar, ve mikroglia 16 ortak bir yüzey markörüdür. CD11b yararlanarak, manyetik ayırma, bir yöntem, ilk olarak neonatal beyin 17 başına bir sütun tabanlı vermiştir yaklaşım ~% 99.5 saflık ve ~ 1.6 x 10 6 mikroglia olarak tarif edilmiştir. Laboratuvar son zamanlarda fikoerıtrinle konjüge edilmiş bir monoklonal antikor (PE) CD11b etiketleyerek bir polistiren tüp içinde gerçekleştirilen bir kolonsuz CD11 manyetik ayırma yöntemi 15, geliştirdi. Bir bispesifik secondary antikor PE ve PE ile dekstran kompleksleri. Bir kez bağlanmış, dekstran-kaplı manyetik parçacıklar antikor kompleksinin dekstran ucuna bağlama yapan, tanıtılmaktadır. Son olarak, polistiren tüp mikroglial izolasyonu için bir mıknatıs yerleştirilir. Bu yaklaşım için verim iki ~ neonatal beyin başına ancak ~% 97 saflıkta azaltılması pahasına 3.2 x 10 6 mikroglia.
Burada, hızlı ve rafine kolonsuz CD11 manyetik ayırma protokolü (Şekil 1) göstermektedir. CD 11 b manyetik ayırma kiti fiyatı aynı olduğu için bu iyileştirilmiş yöntem orijinal kolonsuz metodu kadar hala mümkün. tamamlanma süresi, hücre hayatta kalması ve verimi maksimize etmek önemli olabilir yarısında, azaltılır. Özellikle, bu optimize yöntemden elde saflık ~>% 99, laboratuvarımızda 15 tarafından geliştirilen özgün kolonsuz yönteminden elde saflık üzerinde belirgin bir düzelme sağlanır. En önemlisi, CD11-PEIşıktan uzak kuluçkaya ihtiyacını ortadan kaldırarak ve floresan mikroskobu için kırmızı kanalının kullanımına izin veren, kullanılmaz. Son olarak, orijinal CD11b yönteminde olduğu gibi, yüksek verim ve saflıkta bir astrositik fraksiyonu, bu geliştirilmiş bir yöntem ile elde edilir. Astrositler onların homeostatik fonksiyonları patofizyolojisi 18 göre vazgeçilmezdir fikrine yol açan, CNS içinde en çok glial hücrelerdir. Bu glial hücreler, glial kendi soruşturma potansiyel örneklendiren, besin desteği sağlayan, kan-beyin bariyeri oluşturan nörotransmiter homeostazın korunması hasarı, nöro-yanıt glial yara izi oluşturma, öğrenme ve hafıza, ve Nöro gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynar biyoloji 19. Morfoloji ve mikroglia ve astrositlerin işlevselliği konfokal mikroskopi, Western kurutma nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT PCR), G aracılığıyla tespit edilmiştirRiess nitrit deneyi, ve Luminex multipleks sitokin deneyi. Bu protokolü tarafından sağlanan arıtma in vitro deneyler için önemli olan, tüm bunların mıkroglıal veya astrositik saflık, kırmızı kanalın kullanılabilirliği ile floresan mikroskobu geniş uygulamasına ilişkin güveni arttı ve zaman tasarrufu sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan ve protokol prosedürlerinin kullanılması onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Iowa State Üniversitesinde Komitesi (IACUC) (Ames, IA, ABD) tarafından denetlenen edildi
1. Karışık glial Kültürlerin yetiştirilmesi
- 5.5 inç işletim makasla 1- 2 günlük bir yavrular hızlı başını kesmek, ve buz üzerinde bir 50 ml tüp içinde hemen kafaları yerleştirin. Bu decapitation ötenazi modu olduğunu unutmayın.
- Laminar hava akımı kaput, kafatası ve 4.5 inç düz mikro sistemleri kesme makasları kullanılarak meningeste küçük bir kesi yapmak. Rostral ucunun (burun) kaudal ucundan kesme başlayın. Kafaları kesilmek suretiyle oluşturulan açıklığı kullanarak derinin altına alın.
- Kesme işleminden sonra, yan hemisferlerin bir soyun. Daha sonra, bütün beyin kaldırmak için kıvrık ya da çengel cımbız kullanın.
- % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacet içeren yeni bir 50 ml tüp içinde beyin (ler) daldırın37 ° C bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca asit (EDTA), yedi. beyin başına tripsin-EDTA 2 mL kullanın.
- ekleme ve kaldırma taze büyüme ortamı (% 10 FBS, DMEM / F12,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 sodyum piruvat ve% 1 temel olmayan amino asitler) ile beyin (ler) yıkayın medya. Bu 4x tekrarlayın.
- Her beyin için, büyüme ortamı içeren iki T-75 balonları plaka. Bu nedenle, boruya beyin başına büyüme ortamının 2 ml. Bu nedenle, bu T-75 şişe başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL'lik bir eşdeğer olacaktır.
- En küçüğüne amacıyla, açıklık farklı boyutlarda pipetler ile beyin (ler) öğütülerek homojenize edilir. Beyin dokusu, sonraki pipet geçişi küçülüyor olmadığını görünür olduğunda. Toz haline sonunda, süspansiyon hiçbir görünür topakları, açık olmalıdır.
- 25 ml pipet, 5 ml pipet ve daha sonra 10 mL'lik bir pipet ardışık kullanım.
- Her homog geçirin70 um'lik bir hücre süzgecinden Venöz beyin süspansiyonu tek bir hücre kültürü dönüştürebilmek için.
- (T-75 balonuna başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL) adım 1.5 de tarif edildiği gibi, her homojenize beyin için, plaka, iki T-75 şişeler, büyüme ortamını ihtiva eden.
- 6 günden sonra büyüme ortamı değiştirin ve 16 inci günde tecrit kadar büyür.
Mikroglial Hücreler 2. İzolasyon
- 16 gün sonra, şişeden büyüme ortamını çıkarın ve yeni bir 50 mL tüp içine koyun. Her T-75 balonuna 3 mL,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çalkalama cam deney şişesinin.
- Santrifüj çıkarıldı büyüme 5 dakika süre ile 0.4 x g'de ortam ve bir sonraki aşamada tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için kullanılır.
- 5 dakika çalkalandıktan sonra tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için büyüme (taze veya 2.1.1 kullanılan ortam) ortam 4 mL, en az ekleyin.
- sağlamak için toz haline getirin hepsi carşın müstakil edilmiştir.
- ezildikten sonra, tek bir hücre kültürüne yapmak için bir 70 um'lik bir hücre süzgecinden hücrelere geçme bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve daha sonra 5 dakika süre ile 0.4 x g'de hücreleri aşağı döndürün.
- Her 100 x 10 6 hücre (kabaca 15 x T-75 şişeler), hücre topağı tekrar süspansiyon için tavsiye edilen ortam (% 2 FBS, DPBS (kalsiyum ve magnezyum klorür içermeyen), 1 mM EDTA) içinde 1 mL kullanın.
Not: Aşağıdaki bütün işlemler, bir 1 ml ayrılması için tasarlandı. - Bir 5 ml polistiren tüp al Önerilen Medya 1 mL ekleyin ve menisküs olarak işaretlemek. 2.5 mL kadar Önerilen Medya ekle ve de bu işaretleyin. Önerilen Ortam atın ve 5 ml polistiren tüp yeniden süspansiyon haline hücreleri transferi.
- asma hücrelerinin her 1 ml sıçan serumu, 50 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- bileşen A'nın 25 uL ve bileşen B için 25 uL Bu bileşenler özel olarak karıştırılarak seçimi kokteyli hazırlanır.
- 50 ekle1 'dir; hücreleri seçim kokteyl L. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
NOT: daha saf kültürler için tekrarlayın adım 2.9 (önerilir, ancak zorunlu değil). - 45 saniye boyunca Girdap mıkrokürecikler. örnek 1 mL başına mikrosferler 80 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın.
- Önerilen Ortam eklenerek polistiren tüpü içinde 2.5 mL hacim getirin.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca mıknatıs tüp koyun. saflığını arttırmak için inkübasyon ayarlayın. Yavaş yavaş polistiren tüp içinde hala bir mıknatıs ile bir 15 ml tüp içine Önerilen Ortam dökmek.
- Adımı tekrarlayın 2.12 üç kere daha. Ek manyetik inkübasyonlar saflığını arttırmak için gerçekleştirilebilir.
- Büyüme ortamının 3 mL ekleyin ve bir hücre sayacı kullanılarak hücre sayısı.
- buna göre Poli-D-Lisin (PDL) tedaviler için ıslah edilmiş plakalarda plakası hücreleri. inPDL-kaplanmış plakalar tohumlamadan sonra hücreler 48 saat maruz bırakınız. Bu hücreler ayrılık stresten kurtarmak için izin verir.
NOT: CheDaha önce tarif edildiği gibi 15 immünsitokimya kullanarak kültür saflığı ck. - Çoğunlukla büyüme aracı madde içinde T-75 şişelerinde, astrositler içeren (15 ml bir tüp içinde toplanmıştır) negatif kısmını, Plate.
- 37 ° C inkübatör içinde inkübe en azından 6 saat sonra, orta değiştirmek ve / N O büyümesine izin. tedaviler için ertesi gün astrositler bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroglia II yüksek saflığa sahip CD11 pozitif seçim kiti kullanılarak izole
Primer fare mikroglia yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edilmiş ve izolasyon saflığını kontrol etmek için poli-D-lizin kaplı lamelleri kaplandı. On bin hücreleri izole mikroglia saflığı kontrol etmek için mikroglia ve astrositler bir işaretçi olarak glial fibriler asidik protein (GFAP) 'in bir işaretleyici olarak iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir kuyu ve imünositokimyasal analizler başına kaplandı . Izole edilmiş kültür sadece kültür saf mikroglia olarak izole düşündüren, GFAP ekspresyonu (Şekil 2A) olmadan Iba1 ifade edilmiştir. Bu yöntem kullanılarak ~% 97 saflıkta elde ana mikroglial ayrılması için diğer daha önce yayımlanmış yöntemlerden farklı olarak, yarım sürede ~>% 99 saflıkta elde edilmiştir. ayrıca th saflığını doğrulamak için kültürdür, biz Iba1 ve GFAP bir Western blot 20 koştu. Bağışıklık beneklenme analizi ayrıca karışık glial kültürlerden bu izolasyon hemen hemen saf mikroglial kültürü (Şekil 2B) olduğunu ortaya çıkarmıştır.
modifiye izolasyon prosedürü manyetik boncuk bir otomatik floresan bulunmamaktadır
Gordon ve diğerleri tarafından belirtildiği gibi mikrogliyal ayrılması için önceki CD11b izolasyon kiti kullanılarak kırmızı kanal immunositokimya (ICC) için kullanılamaz. Çünkü ayrılması sırasında PE etiketleme kullanım 15. Bu yeni PE içermeyen izolasyon kiti kullanarak, immünositokimyasal analizi (Şekil 3), kırmızı kanalını kullanabilir. Bu ICC bakıldığında, bu yeni yöntem bizi flow sitometri veya diğer floresan görüntüleme çalışmaları için tüm kanalları kullanmanızı sağlar olduğu aşikardır.
ve_step" fo: keep-together.within sayfa = "1"> İzole mıkroglial kültürler işlevsel LPS uyaranlara cevapİzole mikroglia fonksiyonel olarak aktif olduğunu doğrulamak için, çeşitli pro-enflamatuar faktörler için tarama önce 24 saat süre ile, mikroglia aktif hale getirmek için, LPS ile yaygın olarak kullanılan bir uyarıcı 9 hücreleri tedavi. Klasik mikrogliyal aktivasyonun ortamına nitrit ve çeşitli pro-enflamatuar sitokinlerin salınması eşlik eder. Bu nedenle, biz izole mikroglia fonksiyonel aktivitesini teyit etmek için çok sayıda tamamlayıcı deneyleri kullanılır. İlk olarak, LPS önemli ölçüde izole edilmiş mikroglia (Şekil 4A) nitrit salınmasına neden olduğunu göstermek için, Griess deneyi kullanılmıştır. Ayrıca, izole edilmiş bir mikroglia aktivitesini doğrulamak için, qRT-PCR NOS2 mikroglial inflamasyon bir ayar damgası mRNA seviyelerini (haberci ribonükleik asit) göstermek için kullanılır, önemli ölçüde geliştirilmiş wiinci LPS muamelesi (Şekil 4B). Daha sonra, LPS anlamlı mikroglial kültürü (Şekil 5A), pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını stimüle doğrulamak için bir tane bazlı çoklu deneyi, Luminex 21 kullanılır. Ayrıca, LPS tedavisinin IL-1 p ve TNFa (Şekil 5B) dahil olmak üzere birçok iltihap öncesi sitokin gen ekspresyon seviyelerini artırdığını QRT-PCR analizi ile doğrulanmıştır. Bütün bu veriler biraraya birincil mikroglia bu yeni rafine yöntemi kullanılarak izole düşündürmektedir işlevsel olarak aktif olan ve primer mikroglia daha önce yayınlanmış yöntemler kullanılarak izole edilene benzer bir aktivasyon profilini göstermektedir.
İzole mikroglia çalışmaları sinyalizasyon için de kullanılabilir
Batılı blo, mikroglial izolasyonun önceki yöntemleri kullanarak çalışanİşaret çalışmalar t, düşük verim ve saflıkta zor ve olası olmayan oldu. Daha önce, Fyn, Src familyasına ait kinaz, mikroglial hücreleri 9 bir pro-inflamatuar sinyal akışında yer olduğunu göstermiştir. Burada 12-çukurlu plaka içinde bir milyon mikroglial hücrelerinde kaplanmıştır ve 48 saat sonra biz doğal Fyn için Western blotları çalıştırmak için hücreler toplandı ve Src tirozin kalıntısı ve 416 (p-Src Y416) fosforile kinaz. Bu yöntem çalışmaları sinyal için Western blot teknikleri uygulanabilir olduğunu gösterir eden izole edilmiş mikroglial hücreleri (Şekil 6) Fyn ve p-Src Y416 hem seviyelerini tespit etmek mümkün oldu.
mikroglial ayırma negatif fraksiyon çalışmaları sinyal için de kullanılabilir astrositler içeren
Astrositler nöroenglamasyonla kilit oyuncular oldular ve astr arkasında sinyal mekanizmalarını anlamakocytic inflamasyon ve nöron astrosit çapraz konuşma önemli 19'dur. Burada, mikroglial ayırma negatif fraksiyon GFAP-pozitif astrosit hücreleri (Şekil 7A) içerdiğini göstermektedir. Ayrıca, Fyn ve p-Src Y416 (Şekil 7B) için Western blot analizi, bu proteinlerin her ikisi de hem de negatif fraksiyon tespit edilebileceğini göstermiştir. Bu sonuçlar, birlikte, negatif fraksiyon inflamatuar sinyal kaskadlarında önemli proteinleri tanımlamak amacıyla astrositik çalışmalar için ideal bir preparat olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: 1-2 Gün-doğum sonrası yavrularından Mikroglial Hücrelerinin İzolasyonu şematik. Büyük halini görmek için buraya tıklayınBu rakam.
Şekil 2: Mikroglia II Yüksek Saflık mı CD11-pozitif Seçim Kiti kullanılarak İzole. Yeşil kanal kırmızı kanal ve IBA1 GFAP sondalama izole mikroglial kültür (A) İmmünositokimya. GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) ve β-aktin (~ 42 kDa) için tarama izole mikroglial kültür (B) İmmünoblot. Ölçek çubuğu 20 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Modifiye İzolasyon Prosedürü Manyetik Boncuk herhangi Otomatik floresan var etmez. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroglial Kültür LPS Stimülasyon Artan nitrit üretimi. (A) izole edilmiş mikroglial hücreler 24 saat süreyle 1 ug / ml LPS ile işlemden geçirildi ve tedavi ortamı Griess deneyi ile nitrit açığa bırakılmasını tespit etmek için toplandı. 24 st için LPS ile muamele izole mikroglia NOS2 (B) q-RT-PCR. Şekil 2 ya da daha fazla bağımsız deneyden ± SE ortalamasını temsil etmektedir. Veriler Student t-testi (kullanılarak analiz edildi * p0, 0.05, ** p <0.01, *** P <0.001). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikroglial Hücreler Pro-inflamatuar sitokin Release LPS-kaynaklı. (A), Luminex multipleks deneyi, 24 saat boyunca 1 ug / ml LPS ile işlemden izole mikroglial hücreleri toplanan muamele ortamı üzerinde gerçekleştirilmiştir. 24 st için LPS ile muamele izole mikroglia IL-1βand TNFa (B) q-RT-PCR. Şekil 2 ya da daha fazla bağımsız deneyden ± SE ortalamasını temsil etmektedir. Veriler Student t-testi kullanılarak analiz edildi (* p <0.05, ** p <0.01, *** P <0.001). Için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 6: İzole mikroglia Sinyal Çalışmaları kullanılabilir. Western blot analizi, Fyn ve p-Src Y416 bizim yeni rafine yöntemi ile izole mikroglia tespit edilebilir olduğunu göstermektedir.
Şekil 7: Mikroglial Ayırma Negatif Fraksiyon Sinyal Çalışmaları kullanılabilir astrositleri içerir. (A), Western lekeleme negatif fraksiyon GFAP-pozitif hücreler olduğunu gösterir. (B), Western blot analizi, Fyn ve p-Src Y416 GFAP-pozitif hücrelerden tespit edilebileceğini gösterir.target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametreler | Güncel yöntem | Modifiye yöntem | |
| Maliyet | $ 620 | $ 620 | |
| Zaman | 55 dakika | 25 dakika | |
| floresan | Evet (kırmızı kanal) | Yok hayır | |
| Saflık | ~% 97 | ~% 99 | |
Tablo 1: Rafine Mikroglial İzolasyon Yöntemi ve İzolasyonu orjinal yöntem arasındaki karşılaştırmalı analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eski mikroglial izolasyon yöntemleri, çeşitli protein Western blot analizleri ve RNA QRT-PCR ile analiz için uygun değildir sınırlı geri kazanımları sahiptir. Diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon yöntemler düşük mikroglial verim 13, 14, 15 sahip iki genel yaklaşım vardır. Sütun tabanlı CD11b yaklaşım aynı zamanda düşük bir iyileşme, ancak diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon 13, 14, 15, 16, 17 daha büyük saflık elde edilir. Orijinal kolonsuz CD11b yaklaşım büyük ölçüde protein için uygun hale izole edilmiş verimi geliştirilebilir ve RNA Batı beneklemesi ve qRT-PCR gibi analizler, ancak maliyet saflığı 15 azalmıştır.
Bizim Yeni değiştirilen yöntem korurOrijinal yöntemin verimi ve 95-97% için ~>% 99 ~ biraz saflığı artırır ancak hücrenin hayatta kalması için kritik olan yarı tamamlanma süresi içinde. protokol dahilinde Önemli adımlar optimum mikrogliyal izolasyonunu temin ederim. yavrular decapitating ederken, bakım buz üzerinde başlarını tutmak ve 5-10 dakika içinde laminar hava akışı odasında teşrih alınmalıdır. Uzun süreli beyin eksizyon kez mikroglial verim ödün, çevre sıcaklıklarında sağlamlığını kaybetmeye başlar, çünkü zor tam beyin elde etmek için yapacaktır. adım 2.9 en az bir kez tekrarlanır halinde Özellikle, saflık ve canlılığı gözle görülür bir artış vardır. ayırma verimi düşük olduğu takdirde, ayırma veya ayırma hacmini (> 1 ml) artan tarafından ortam ml başına daha az şişeleri kullanılarak tekrar edilebilir. Azalan hücre dışlama genel saflık, yaşayabilirliği ve verimi artıracaktır. Manyetik kuluçka süresi saflığını arttırmak için adım 2.12 uzatılabilir. Bu canmikroglia bağlı olan mikro kürelerin bağlanmasını uygun manyetik sağlamak. Bundan başka, ek manyetik inkübasyonlar saflığı ve veriminin arttırılması uğruna Aşama 2.9 gerçekleştirilebilir.
protokol fizibilitesi orijinal CD11b yöntemi ya da daha iyi bir etkiye sahiptir; Bununla birlikte, yeni bir yöntem, rafine ve daha kısadır. Bu rafine yöntemi elde diğer önemli avantajı, orijinal bir yöntem (Tablo 1) 15 PE tarafından işgal edilmiş floresan mikroskobu, kırmızı kanalı kullanan bir seçenektir. Biz yöntemle mikroglia yüksek verim ve saflıkta elde rağmen bazı fibroblastlar tuttuğundan, bu ayırma elde edilen astrosit verim daha saftır. Adım 2.17 tarif edildiği gibi, astrositler kaplama ve 6 saat boyunca inkübe edildikten sonra, büyüme ortamı, taze ortam ile değiştirilmesi gerekir. fibroblastların çok asmalar içinde kalırken Astrositler, balona eklemek ilk olarakension. medyanın yedek genellikle kirleten fibroblastların çoğunluğunu kaldıracaktır. Bu teknik, astrositlerin, yüksek saflıkta sağlar, ancak saf kültürleri elde etmek için ikinci bir arıtma yöntemi garanti edilir.
Genel olarak, bu değiştirilmiş CD11b izolasyon yöntemi kısa bir miktarda yüksek derecede saf ana mikroglial hücreleri ve astrositler oluşturur. kısa izolasyon süresi genellikle hücre hayatta kalma oranlarını arttırır. Bu mikroglia ve Astroglial biyoloji iki temel sinyal mekanizmalarını ortaya çıkması için yararlı bir model sistemi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
NS088206 ve ES026892: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleriyle desteklenmiştir. W. Eugene ve Linda Lloyd bahşedilmiş Sandalye AGK ve AK Dekanlar Profesörlük da kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
