Summary
ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。
Abstract
ミクログリアは、中枢神経系傷害への一次対応者です。しかし、多くの神経炎症の調節におけるその役割については不明のまま。ミクログリアは、炎症性ストレスを調査中で、マクロファージと同様に機能する中胚葉細胞です。古典（M1型）および代替（M2型）マクロファージの活性化にも良く、これらの表現型は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病などの神経炎症の状態で持っている根本的な相互作用を理解するための努力にミクログリアに拡張されました。 試験管内の実験では初代ミクログリアを利用生体内環境に拡張することができる迅速かつ信頼性の高い結果を提供しています。これはin vivoでの実験を超える明らかな利点ですが、最適な純度の十分な収量を達成しながら、ミクログリアを分離することが課題となっています。現在使用されている一般的な方法は、どちらかは、低回収率、低純度、またはその両方に苦しみます。ここで、我々はDEM時間の半分の量の高い細胞の回復と強化された純度を実現し、カラムフリーのCD11b磁気分離法の改善onstrate。私たちは、神経炎症および神経変性を研究する目的のための主要なミクログリアの分離の非常に有用なモデルとして、この最適化された方法を提案します。
Introduction
ミクログリアのc-kit + / CD45-から分化中胚葉起源のMybの非依存常駐マクロファージは、卵黄嚢1,2の血島前駆細胞をerythromyeloidれます。発生学的ミクログリアは、中枢神経系（CNS）のコロニーを形成した後、それらは、分枝形態3にアメーバからの遷移します。そのダイナミックな波及効果は、潜在的な侮辱4のための健全な脳実質を探るため、これらの成人ミクログリアは、監視者として分類されています。ミクログリアのみCNS細胞集団の約10％に寄与するものの、お互いの中のタイルへの能力は実質4、5の最大スキャンを保証します。そのようなαシヌクレイン6,7およびアミロイドβ8、又はP等の危険関連分子パターン（DAMPS）そのようなリポ多糖（LPS）9としてathogen関連分子パターン（のPAMPs）は、古典的アメーバ様活性状態への復帰及び一酸化窒素の産生、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン1βによって特徴付けられる炎症反応を促進するミクログリアを活性化（IL-1β）、IL-6、IL-12、およびケモカインCCモチーフリガンド2 9、10、11。病原αシヌクレインを蓄積してきたパーキンソン病などの神経炎症条件において、神経変性サイクルをさらにミクログリア7の古典的な活性化を促進し、より凝集αシヌクレインを放出するドーパミン作動性ニューロンの死から作成されます。周辺のマクロファージと同様に、ミクログリアはそれらに強力を与える、あるいは抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10の存在下で活性化する能力をも有していてもよいです神経の修復を促進し、炎症2、11の減衰IAL。別にCNSにおける免疫学的役割から、ミクログリアは、開発中のシナプスを剪定することにより、神経回路の重要な調節因子として記載されています。例えば、Cx3cr1- KOマウスは、低密度ミクログリア及び樹状突起棘、未熟シナプス、及び後進CNS 12の電気パターンの過剰につながる減少シナプス剪定を有します。 CNSの恒常性にこれらの生理学的な複雑さとミクログリアの多様な機能的役割を理解することは、神経変性疾患を標的に治療薬を探索するために重要です。
神経免疫学の分野では、in vitroの実験が原因機構研究のための大きな可能性を非常に望ましい、低メンテナンスコスト、およびより少ない時間と労働集約的であるために。 Furthermo再、細胞集団を単離する能力は、所定の条件の下で、それらの標的細胞の機能性を描くことが重要です。多数のミクログリアの分離方法が存在するが、それらは幅広い実験13、14、15のために比較的高い数値と純度を得る能力によって制限されています。例えば、分化11B（のCD11b）のクラスタは、単球、マクロファージおよびミクログリア16の一般的な表面マーカーです。 CD11bを利用することによって、磁気分離の方法は、第一〜99.5％の純度および新生児脳17あたり〜1.6×10 6ミクログリアを得たカラムベースの手法として説明しました。我々の研究室では、最近、我々はフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートモノクローナル抗体のCD11bをタグ付けすることによってポリスチレンチューブ中で行わカラムフリーのCD11b磁気分離法15を 、開発しました。二重特異性secondaPEとPEおよびデキストラン複合体にRY抗体。一度結合し、デキストラン被覆磁性粒子は抗体複合体のデキストラン端に結合する、導入されます。最後に、ポリスチレンチューブは、ミクログリアを単離するための磁石内に配置されます。このアプローチは、新生児の脳当たりしかし〜97％までの純度を低下させるコストで〜3.2×10 6ミクログリアの収量を倍増しました。
本明細書において、我々は、迅速かつ精製カラムフリーのCD11b磁気分離プロトコル（ 図1）を実証します。 CD11bを磁気分離キットの価格は同じであるので、この改良された方法は、私たちの元の列フリー法と同様に実現可能なまま。終了時間は、細胞生存および収率を最大に重要であることができる半分に低減されます。注目すべきは、この最適化された方法により達成純度は〜> 99％、当研究室が開発した15元の列のない方法で達成純度を超える顕著な改善です。最も重要なことは、CD11bを-PE光から離れるインキュベートする必要性を排除し、蛍光顕微鏡検査のために赤色チャネルの使用を可能にする、利用されません。最後に、元のCD11bの方法のように、高収率および高純度の星状細胞の画分は、この改良された方法で得られます。アストロサイトは、彼らの恒常性維持機能が病態生理学18との関係で不可欠であるという考えにつながる、CNSの中で最も多数のグリア細胞です。これらのグリア細胞は、神経膠に彼らの捜査の可能性を例示する、栄養サポートを提供し、血液脳関門を形成する神経伝達物質の恒常性の維持、傷害、神経保護に対応してグリアの傷を形成し、学習と記憶、および神経炎症などの多様な生理機能に役割を果たしています生物学19。ミクログリアとアストロサイトの形態と機能はG、共焦点顕微鏡、ウェスタンブロッティング、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を介して確認されていますriess亜硝酸塩アッセイ、およびルミネックス多重サイトカインアッセイ。このプロトコルにより提供される改良は、in vitroの実験のために重要であるすべては、ミクログリアやアストロサイトの純度、赤チャネルの利用可能性を持つ蛍光顕微鏡のより広範なアプリケーションに関連する自信を増加し、時間を節約できます提供しています。
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Protocol
動物やプロトコル手順の使用は、アイオワ州立大学（エイムズ、IA、USA）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、監督されました
1.混合グリア培養の成長
- 5.5インチのオペレーティングハサミで素早くの1- 2日齢の仔を刎ねる、そして氷上で50 mLチューブにすぐに頭を置きます。この断頭は、安楽死のモードであることに注意してください。
- 層流フードでは、頭蓋骨と4.5インチのストレートマイクロ解剖ハサミを使用して髄膜に小さな切開部を作ります。吻側端（鼻）に尾側端部から切断し始めます。断頭により形成された開口部を使用することによって皮膚の下に取得します。
- 切開をした後、側に半球の1を剥離。次いで、脳全体を除去するために、湾曲したまたはフックピンセットを使用します。
- 0.25％トリプシンethylenediaminetetraacetを含む新しい50mLチューブ中脳（複数可）を浸し37℃の水浴中で15分間、酢酸（EDTA）を食べました。脳あたりトリプシンEDTAの2ミリリットルを使用してください。
- 追加および除去することにより、新鮮な増殖培地（10％FBS、DMEM / F12、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム、および1％非必須アミノ酸）と脳（単数または複数）を洗浄メディア。この4倍を繰り返します。
- 各脳のために、増殖培地を含有する2つのT-75フラスコにプレート。そのため、チューブに脳あたりの成長培地の2ミリリットルを追加します。したがって、T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mLに等しくなります。
- 最大から最小にするために、異なる開口サイズのピペットと脳（複数可）を粉砕することによりホモジナイズします。脳組織は、次のピペットへの遷移を小さくなっていないことが表示されている場合。粉砕の最後に、懸濁液は可視チャンクと、明らかです。
- 25 mlピペット、5mLのピペット、次いで10mLのピペットを順次使用。
- 各homogを渡し単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通してenous脳サスペンション。
- 各ホモジナイズ脳、ステップ1.5（T-75フラスコ当たり増殖培地の8-9 mLでホモジナイズした脳の1 mL）に記載されているように、増殖培地を含むプレート2つのT-75フラスコのために。
- 6日後に増殖培地を変更し、16日目に分離するまでに成長。
ミクログリア細胞の単離2
- 16日後、フラスコから成長培地を除去し、新鮮な50mLチューブに入れ。各T-75フラスコに3mlの0.25％トリプシンEDTAを加えます。オービタルシェーカー上でRTで5分間フラスコを振ります。
- 遠心分離5分間0.4×gで除去し、増殖培地と後の工程でトリプシンEDTA反応を停止するために使用します。
- 5分間振とうした後、トリプシンEDTA反応を停止させる（新鮮または2.1.1から使用される媒体）増殖培地を4mLの最小値を加えます。
- 確実にするために粉砕すること、すべてのCellsは切り離されています。
- 粉砕後、単一細胞培養にそれを作るために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡す細胞計数を行い、次いで5分間0.4×gで細胞をスピンダウン。
- すべての100×10 6個の細胞（約15×T-75フラスコ）のために、細胞ペレットを再懸濁するために推奨培地（2％FBS、DPBS（カルシウム及び塩化マグネシウムを含まない）、1mMのEDTA）1mLのを使用。
注：すべての次のステップは、1 mLの分離に合わせて調整されています。 - 、5mLのポリスチレンチューブに乗り推奨メディアの1 mLを加え、メニスカスをマーク。 2.5 mlまでの推奨メディアを追加しても、このマークを付けます。推奨メディアを捨て、5mLのポリスチレンチューブに再懸濁した細胞を移します。
- 浮遊細胞のすべての1 mLのためのラット血清の50μLを追加します。 RTで5分間インキュベートします。
- これらのコンポーネントは、プロプライエタリである成分Aの25μLと成分Bを25μLを混合することにより選択カクテルを調製します。
- 50を追加1;細胞に選択カクテルL。 RTで5分間インキュベートします。
注：純粋な文化のために、繰り返しステップ2.9（推奨しますが、必須ではありません）。 - 45秒間ボルテックスマイクロスフェア。サンプルの1ミリリットルあたりのマイクロスフェアの80μLを追加します。 RTで3分間インキュベートします。
- 推奨メディアを追加することにより、ポリスチレンチューブに2.5mLの体積をもたらします。
- 室温で3分間磁石にチューブを入れてください。純度を高めるために、インキュベーションを調整します。ゆっくりと、まだポリスチレンチューブ中に磁石を15 mLのチューブに推奨メディアを注ぎます。
- 手順を繰り返し2.12 3回。追加の磁気インキュベーションは、純度を高めるために行うことができます。
- 増殖培地の3ミリリットルを追加し、細胞カウンターを用いて細胞の数を数えます。
- 従って、ポリ-D-リジン（PDL）の治療のためにコーティングされたプレートにプレート細胞。 inPDL被覆プレートに播種した後、細胞を48時間処置します。これは、細胞が分離のストレスから回復することができます。
注：チェ以前に15記載のように免疫細胞化学を用いて培養の純度をCK。 - 増殖培地中のT-75フラスコ中で、主にアストロサイトを含有する陰性画分を（15 mLチューブに回収）、プレート。
- 37℃のインキュベーター中でのインキュベーションの少なくとも6時間後、培地を変更し、それはO / Nを成長させ。治療のために次の日アストロサイトを分割します。
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Representative Results
ミクログリアはIIは、高純度を持っているのCD11b陽性選択キットを用いて単離し
初代マウスミクログリアは、上述したプロトコルを用いて単離し、単離の純度を確認するために、ポリ-D-リジンでコーティングしたカバースリップ上に播種しました。十千個の細胞をウェルあたり播種し、免疫細胞化学分析は、単離されたミクログリアの純度を確認するためにアストロサイトのマーカーとして小膠細胞およびグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のマーカーとしてのイオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1）を用いて行きました。単離された培養物は、培養物が純粋ミクログリアた単離されたことを示唆し、GFAPの発現（ 図2A）なしIBA1を発現しました。この方法を使用して〜97％の純度を達成し、プライマリミクログリアの分離のための他の以前に発表された方法とは異なり、我々は半分の時間で〜> 99％の純度を得ました。さらに番目の純度を検証するには文化があり、我々はIBA1およびGFAPのためのウエスタンブロット20を走りました。イムノブロット分析は、さらに、混合膠細胞培養からのこの分離は、ほぼ純粋なミクログリア培養物（ 図2B）であることが明らかになりました。
修飾された単離手順は、磁気ビーズから、任意の自己蛍光を有していません
ミクログリアの分離のための前のCD11b単離キットを使用する場合Gordon らによって述べたように、赤色チャネルは免疫細胞化学（ICC）のために使用することができません。なぜなら分離中PE標識の使用15。この新しいPEを含まない単離キットを用いて、我々は、免疫細胞化学的解析（ 図3）のための赤チャンネルを使用することができます。このICCから、この新しい方法は、フローサイトメトリーまたは他の蛍光イメージング研究のためのすべてのチャネルを使用することを可能にすることは明らかです。
ve_step」FO：キープtogether.within-ページは= "1">絶縁型ミクログリア培養は、機能的にLPS刺激に反応します単離されたミクログリアは、機能的に活性であることを確認するために、我々は、様々な前炎症性因子をプロービングする前に24時間、ミクログリアを活性化するLPS、広く使用されている刺激9で細胞を処理しました。クラシックミクログリアの活性化は、メディアへの亜硝酸塩と様々な前炎症性サイトカインの放出を伴います。そこで、私たちは孤立ミクログリアの機能的活性を確認するために、複数の補完的なアッセイを使用していました。まず、我々は、LPSが劇的に単離されたミクログリア（ 図4A）から亜硝酸塩分泌を誘導したことを示すために、グリースアッセイを使用します。さらに、単離されたミクログリアの活性を検証するために、我々は、定量RT-PCRは、NOS2、ミクログリア炎症の別の特徴のmRNAレベルを（メッセンジャーリボ核酸）を表示するために使用される、大幅に強化のWi第LPS処理（ 図4B）。次に、我々は、LPSが有意ミクログリア培養（ 図5A）からの炎症誘発性サイトカインの分泌を刺激したことを確認するために、ビーズベースの多重アッセイ、ルミネックス21を使用します。さらに、我々は、LPS処理は、IL-1βおよびTNFα（ 図5B）を含むいくつかの炎症性サイトカインの遺伝子発現レベルを増強することをQRT-PCR分析によって検証しました。全てのこれらのデータは、一緒に初代ミクログリアは、この新たに精製方法を用いて単離することを示唆している機能的に活性であり、初代ミクログリアは、以前に公開された方法を用いて単離と同様の活性化プロフィールを示します。
孤立ミクログリアは、研究をシグナリングに使用することができます
西洋BLOを実行し、ミクログリアの分離の従来の方法を使用してシグナリングの研究のためのtは、低い収率および純度に難しく、実現不可能でした。以前、我々はフュン島、Srcファミリーキナーゼは、ミクログリア細胞9にプロ炎症性シグナル伝達カスケードに関与していることが示されています。ここでは、12ウェルプレートに百万ミクログリア細胞を播種し、48時間後、私たちはネイティブフェーンのために、ウエスタンブロットを実行するために、細胞を収集し、Srcは、チロシン残基416（P-SRC-Y416）でリン酸化キナーゼ。我々は、この方法が研究をシグナリングするためのウェスタンブロッティング技術に適用可能であることを示し、我々の単離された小グリア細胞（ 図6）におけるFynおよびp-SRC-Y416の両方のレベルを検出することができました。
ミクログリアの分離からの負の割合は、研究をシグナリングに使用することができますアストロサイトが含まれています
アストロサイトは、神経炎症の重要なプレーヤーである、とASTRの背後にあるシグナル伝達機構を理解しますocytic炎症およびニューロン、星状細胞クロストークが重要である19。ここでは、ミクログリアの分離からの負の割合は、GFAP陽性アストロサイト細胞（ 図7A）が含まれていることを示しています。また、フュンP-SRC-Y416（ 図7B）のための私達のウェスタンブロット分析は、これらのタンパク質の両方が同様に陰性画分中で検出できることを示しました。これらの結果は、一緒に陰性画分は、炎症性シグナル伝達カスケードのために重要なタンパク質を同定することを目的とし、星状細胞の研究のための理想的な準備であることを示しています。
図1：1~2日、出生後の仔からミクログリア細胞の単離の概略 。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。
図2：ミクログリアIIは、純度が高いのCD11b陽性選択キットを用いて単離し。緑色チャネルにおける赤チャネルとIBA1にGFAPのためにプロービング単離されたミクログリア培養物の（A）免疫細胞化学。 （B）単離されたミクログリア培養物の免疫ブロットは、GFAP（〜51 kDaの）、IBA1（〜15 kDaの）およびβアクチン（〜42 kDaの）のためのプローブ。 =20μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：変更された単離操作は、磁気ビーズから任意の自家蛍光を持っていません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：LPS刺激はミクログリア培養中の亜硝酸塩産生を増加させました。 （A）単離された小グリア細胞を24時間に1μg/ mLのLPSで処理し、処理媒体は、グリースアッセイによる亜硝酸塩の放出を決定するために収集しました。 （B）24時間LPSで処理された単離されたミクログリアからNOS2ためのQ-RT-PCR。数値は、2以上の独立した実験からの平均±SEを表します。データは、（* Pスチューデントのt検定を用いて分析しました0; 0.05、** P <0.01、*** P <0.001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ミクログリア細胞からのLPS誘発炎症性サイトカインリリース。 （A）のLuminexマルチプレックスアッセイは、24時間に1μg/ mLのLPSで処理された単離されたミクログリア細胞から回収処理媒体上で実施しました。 （B）24時間LPSで処理された単離されたミクログリアからのIL-1βandTNFαのためのQ-RT-PCR。数値は、2以上の独立した実験からの平均±SEを表します。データは、スチューデントのt検定を用いて分析した（* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001）。 こちらをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。
図6：孤立ミクログリアはシグナリング研究のために使用することができます。ウエスタンブロット分析フュンP-SRC-Y416は、新しく洗練された方法を用いて単離したミクログリアから検出できることを示しています。
図7：ミクログリアの分離から陰性画分は、シグナリング研究のために使用することができるアストロサイトが含まれています。 （A）ウエスタンブロット法は陰性画分は、GFAP陽性細胞が含まれていることを示しています。 （B）ウエスタンブロット分析は、フュンP-SRC-Y416は、GFAP陽性細胞を検出することができることを示しています。ターゲット=「_空白」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| パラメーター | 現在の方法 | 修正方法 | |
| コスト | $ 620 | $ 620 | |
| 時間 | 55分 | 25分 | |
| 蛍光 | はい（赤チャンネル） | ノー | |
| 純度 | 〜97％ | 〜99％ | |
表1：精製ミクログリア分離法および単離の元のメソッドとの間の比較分析。
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Discussion
古いミクログリアの単離方法は、種々のタンパク質に適していない限られた回復を有するウェスタンブロットによって分析し、RNAは、定量RT-PCRにより解析します。差動付着および軽度のトリプシン処理の方法は、低ミクログリア収率13、14、15を有する2つの一般的なアプローチです。列ベースのCD11bのアプローチは、低い回収率を有しているが、差動付着および軽度トリプシン処理13、14、15、16、17を超える純度を達成します。独自のカラムフリーのCD11bアプローチは大幅タンパク質に適して、単離された収率を改善し、RNAは、例えば、ウェスタンブロット法およびQRT-PCR解析として、しかし減少純度15のコストで。
私たちの新しく変更された方法は保持します元の方法の収率および95から97パーセントへ〜> 99％〜からわずかに純度を増加させるが、細胞の生存に重要である半分の完了時間、です。プロトコル内の重要なステップは、最適ミクログリアアイソレーションを確保することができます。子犬をdecapitatingながら、ケアは氷の上で頭を維持し、5〜10分以内に層流室で解剖に注意する必要があります。長期の脳の切除時間は、ミクログリアの収量を損なう、それは周囲温度でその堅牢性を失い始めるので、それは難しい完全な脳を得ることになります。ステップ2.9は、少なくとも1回繰り返された場合、特に、純度および生存率の観察可能な増加が存在します。分離からの収率が低い場合、分離は、推奨メディア1mLあたり少ないフラスコを使用して繰り返すことができる、または分離（> 1 mL）中の体積を増加させることによって。一般に、細胞密集を減少させると、純度、生存率、および収率を改善します。磁気インキュベーション時間は、純度を高めるために、ステップ2.12で拡張することができます。これは、することができますミクログリアに取り付けられているマイクロスフェアの適切な磁気結合を保証します。さらに、追加の磁気インキュベーションは、純度および収率を増加させるためにステップ2.9で行ってもよいです。
プロトコルの実現可能性と同等または元のCD11bの方法よりも優れています。しかし、新しい方法は、洗練された短いです。この洗練された方法から得られる別の重要な利点は、元のメソッド（ 表1）15にPEによって占有されている蛍光顕微鏡、赤チャネルを利用するオプションがあります。我々は法とミクログリアの高い収率および純度を得るけれども、それはいくつかの線維芽細胞を保持するので、この分離から得たアストロサイトの収率はあまり純粋です。ステップ2.17に記載されているように、星状細胞をプレーティングし、6時間インキュベートした後、増殖培地を新鮮な培地と交換しなければなりません。線維芽細胞の多くはSUSPに残っている間星状細胞は、フラスコに付着する最初のものですension。メディアの交換は、一般的に混入した線維芽細胞の大部分を除去します。この技術は、星状細胞の高純度を保証しているが、より純粋な培養物を得るために、二次精製方法が保証されます。
全体として、この修飾のCD11bの単離方法は、短時間で高純度の一次ミクログリア細胞およびアストロサイトを生成します。短い分離時間は、一般的に、細胞の生存率を向上させます。これは、ミクログリアおよびアストログリア生物学の両方の根底にあるシグナル伝達機構を解明するために有用なモデル系を提供します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
NS088206とES026892：この作品は、国立衛生研究所（NIH）補助金によってサポートされていました。 AKにAGKとディーンズ教授職にW.ユージンとリンダ・ロイド寄附も認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
