Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere mikroglia fra postnatale museunger (dag 1) for in vitro forsøk. Denne improvisert fremgangsmåte med isolering genererer både høyt utbytte og renhet, en betydelig fordel i forhold til alternative fremgangsmåter som gjør det mulig lang rekke forsøk med henblikk på å belyse, mikroglia biologi.
Abstract
Mikroglia er de primære respondere til sentralnervesystemet fornærmelser; imidlertid fortsatt mye ukjent om deres rolle i regulering av nevroinflammasjon. Mikroglia er mesodermal celler som fungerer på samme måte makrofager i kartlegging inflammatorisk stress. Den klassiske (M1-type) og alternativ (M2-type) aktiveringer av makrofager er også blitt utvidet til mikroglia i et forsøk på å bedre forstå de underliggende samspillet disse fenotyper har i neuroinflammatoriske sykdommer som Parkinsons, Alzheimers og Huntingtons sykdommer. In vitro-forsøk ved anvendelse primære mikroglia tilbyr raske og pålitelige resultater som kan forlenges til in vivo miljøet. Selv om dette er en klar fordel i forhold til in vivo eksperimentering, å isolere mikroglia samtidig oppnå tilfredsstillende utbytter av optimal renhet har vært en utfordring. Vanlige metoder som for tiden er i bruk enten lider av lav utvinning, lav renhet, eller begge deler. Heri DEM vionstrate en avgrensning av kolonnen frie CD11b magnetisk separasjon metode som oppnår en høy cellegjenvinning og forbedret renhet i halvparten av tiden. Vi foreslår denne optimaliserte fremgangsmåte som et svært nyttig modell av primær microglial isolasjon for formålene med å studere nevroinflammasjon og neurodegenerering.
Introduction
Mikroglia er Myb-uavhengige resident makrofager av mesodermal opprinnelse, som skiller fra c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorer i blod øyene i plommesekken 1, 2. Når embryologiske mikroglia har kolonisentralnervesystemet (CNS), de går over fra et amoeboid til en forgrenet skjema 3. Disse voksne microglia er klassifisert som surveillant siden deres dynamiske konsekvenser sondere sunn hjernen parenchyma for potensielle fornærmelser 4. Selv mikroglia bare bidra til omtrent 10% av det CNS-cellepopulasjon, deres evne til flis blant hverandre sikrer maksimal avsøkning av parenchyma 4, 5. Fare-assosierte molekylære mønstre (demper), slik som α-synuclein 6, 7 og amyloid-β 8, eller p-athogen-assosierte molekylære mønstre (PAMPs) så som lipopolysakkarid (LPS) 9, klassisk aktivere mikroglia for å fremme en inflammatorisk respons som er karakterisert ved reversjon til den amoeboid aktiv tilstand og produksjon av nitrogenoksid, tumornekrosefaktor-α (TNFa), interleukin 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, og den kjemokine CC-motivet ligand 2 9, 10, 11. I neuroinflammatoriske sykdommer som Parkinsons sykdom, i hvilke patogene α-synuclein har akkumulert, er en nevrodegenerativ syklus opprettet fra død av dopaminerge nevroner, som slipper mer aggregert α-synuclein, som ytterligere fremmer klassisk aktivering av mikroglia 7. I likhet med perifere makrofager, kan mikroglia også ha muligheten for alternativt å aktiveres i nærvær av anti-inflammatoriske cytokiner IL-4 og IL-10, noe som gir dem den potenteial for å fremme nerve reparasjon og dempning av inflammasjon 2, 11. Bortsett, fra sine immunologiske roller i CNS, og har mikroglia blitt beskrevet som viktige regulatorer av neuronal kretser ved beskjæring synapser i løpet av utviklingen. For eksempel, Cx3cr1- KO-mus har mindre tette mikroglia og redusert synaptisk beskjæring, noe som fører til et overskudd av dendrittutløperne, umodne synapser, og de elektro mønstre av en underutviklet CNS 12. Forståelse disse fysiologiske kompleksiteten og de ulike funksjonelle roller av mikroglia i homeostasen i CNS er kritisk for søk etter terapeutiske midler målrettet mot neurodegenerative forstyrrelser.
I området av neuroimmunology, in vitro eksperimenter er meget ønskelig på grunn av den større muligheten for mekanistiske undersøkelser, lavere vedlikeholdskostnader, og for å være mindre tids- og arbeidskrevende. Furthermore, er evnen til å isolere cellepopulasjoner kritisk for å avgrense funksjonaliteten av disse mål-celler under foreskrevne betingelser. Tallrike mikrogliaceller isoleringsmetoder eksisterer, men de er begrenset av deres evne til å oppnå forholdsvis høye tall og renhet for bred eksperimentering 13, 14, 15. For eksempel, en klynge av differensiering 11b (CD11b) er et vanlig overflatemarkør av monocytter, makrofager, og mikroglia 16. Ved å utnytte CD11b, ble en fremgangsmåte for magnetisk separasjon først beskrevet som et kolonne-basert tilnærming som ga ~ 99,5% renhet og ~ 1,6 x 10 6 mikroglia pr neonatale hjerne 17. Vårt laboratorium har nylig utviklet en kolonne fritt CD11b magnetisk separasjonsmetode 15, som vi utført i et polystyrenrør med tagging CD11b med et monoklonalt antistoff konjugert til fykoerytrin (PE). En bispesifikke secondaRy antistoff til PE og dextran komplekser med PE. Når det er bundet, er dekstran-belagte magnetiske partikler innført, som binder til dekstran enden av antistoff-komplekset. Til slutt, er polystyren-rør plassert i en magnet for microglial isolasjon. Denne tilnærmingen doblet utbyttet til ~ 3,2 x 10 6 mikroglia per neonatale hjerne, men på bekostning av å redusere renhet til ~ 97%.
Heri viser vi en hurtig og raffinert kolonne-fri CD11b magnetisk separasjon protokoll (figur 1). Denne forbedrede fremgangsmåte fortsatt som mulig som vår opprinnelige kolonnen frie metode, fordi prisen på CD11b magnetisk separasjon sett er den samme. Kompletteringstiden reduseres i to, noe som kan være avgjørende for å maksimere celle overlevelse og utbyttet. Spesielt er renheten oppnås fra denne optimaliserte fremgangsmåte er ~> 99%, en markert forbedring i forhold til renhet oppnås fra den opprinnelige kolonnen frie metode som er utviklet av vårt laboratorium 15. Viktigst, CD11b-PEikke utnyttes, noe som eliminerer behovet for å inkubere borte fra lys og å tillate bruk av den røde kanal for fluorescens mikroskopi. Til slutt, som i den opprinnelige CD11b fremgangsmåte blir en astrocytic fraksjon av høyt utbytte og renhet oppnås med denne forbedrede metode. Astrocytter er de mest tallrike gliacellene i CNS, fører til ideen om at deres homeostatiske funksjoner er uunnværlig i forhold til patofysiologi 18. Disse gliaceller spille en rolle i forskjellige fysiologiske funksjoner slik som å danne blod-hjerne-barrieren, og gir næringsstøtte, opprettholde neurotransmitter homeostase, forming gliale arr som respons på skade, nevrobeskyttelse, læring og hukommelse, og nevroinflammasjon, eksemplifiserer deres investigatory potensial i glial biologi 19. Morfologi og funksjonalitet av microglia og astrocytter har blitt konstatert via konfokalmikroskopi, Western blotting, kvantitativ real-time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR), GRiess nitritt-analyse, og den Luminex multipleks cytokin-analyse. Avgrensningen følger av denne protokollen gir økt trygghet knyttet til microglial eller astrocytic renhet, bredere anvendelse av fluorescens mikroskopi med tilgjengeligheten av den røde kanalen, og sparer tid, som alle er viktige for in vitro eksperimentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av dyr og protokoll prosedyrer ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Iowa State University (Ames, Iowa, USA)
1. Dyrking av Mixed Glial kulturer
- Fremrykning 1- 2 dager gamle pups raskt med 5,5 tommers opererer sakser, og plassere hodene umiddelbart i et 50 ml rør på is. Merk at dette halshogging er modusen for aktiv dødshjelp.
- I en laminær luftstrøm hette, lage et lite snitt i hodeskallen og hjernehinnene som bruker 4,5 tommers rette mikro-dissekere saks. Begynne å skjære fra haleenden til rostral enden (nese). Komme under huden ved hjelp av åpningen dannet av halshogging.
- Etter innsnitt, skrelle en av halvkulene til siden. Deretter bruke et par av buede eller hakeformede pinsett for å fjerne hele hjernen.
- Dypp hjerne (e) i en ny 50 ml rør inneholdende 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetspiste syre (EDTA) i 15 minutter i et 37 ° C vannbad. Bruke 2 ml trypsin-EDTA, pr hjerne.
- Vask hjernen (e) med friskt vekstmedium (10% FBS, DMEM / F12, 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% natriumpyruvat, og 1% ikke-essensielle aminosyrer) ved å legge til og fjerne media. Gjenta dette 4x.
- For hver hjerne, plate to T-75 kolber som inneholdt vekstmedia. Derfor, tilsett 2 ml vekstmedium pr hjerne til røret. Dermed vil det være en ekvivalent av 1 ml homogenisert hjerne med 8-9 ml vekstmedium per-T-75-kolbe.
- Homogenisere ved utgnidning hjernen (e) med pipetter med forskjellig åpningsstørrelser, i rekkefølge fra størst til minst. Når det er synlig at hjernevevet ikke blir mindre, overgang til den neste pipette. Ved slutten av triturering må suspensjonen være klart, uten synlige biter.
- Bruke en 25 ml pipette, 5 ml pipette, og deretter en 10 ml pipette sekvensielt.
- Passere hvert homogenous hjerne suspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil for å gjøre det til en enkelt cellekultur.
- For hver hjerne ble homogenisert, plate to T-75-kolber inneholdende vekstmedium, som beskrevet i trinn 1,5 (1 ml homogenisert hjerne med 8-9 ml vekstmedium per-T-75-kolbe).
- Endre vekstmedier etter 6 d og vokse til isolasjon på 16. dagen.
2. Isolering av mikrogliale celler
- Etter 16 dager, fjerne vekstmediet fra kolben og plassere det i en frisk 50 ml tube. Tilsett 3 ml 0,25% trypsin-EDTA til hver T-75 kolbe. Rist kolbene i 5 minutter ved RT på en orbital rystemaskin.
- Sentrifuger fjernet vekstmediet på 0,4 x g i 5 min, og bruk for å stoppe trypsin-EDTA reaksjon på det etterfølgende trinn.
- Etter rysting i 5 minutter, tilsett et minimum av 4 ml av vekstmediet (fersk eller den brukte mediet fra 2.1.1) for å stoppe trypsin-EDTA-reaksjon.
- Triturer for å sikre at alle calen er frittliggende.
- Etter triturering, passerer cellene gjennom et 70 mikrometer celle sil for å gjøre det til en enkelt cellekultur, utføre en celletelling, og deretter spinne ned cellene ved 0,4 xg i 5 min.
- For hver 100 x 10 6-celler (omtrent 15 x T-75 flasker), bruker 1 ml av Anbefalt materiale (2% FBS, DPBS (kalsium- og magnesiumklorid-fri), 1 mM EDTA) til cellepelleten suspenderes.
NOTE: Alle etterfølgende trinn er skreddersydd for en 1 ml separasjon. - Ta en 5 ml polystyren rør, tilsett 1 ml Anbefalt Media, og merk menisken. Legg Anbefalt Media opptil 2,5 ml og merke dette også. Kast Anbefalt materiale og overføre resuspenderes cellene i 5 ml polystyrenrør.
- Tilsett 50 ul av rotteserum for hver 1 ml suspenderte celler. Inkuber i 5 min ved RT.
- Forbered utvalg cocktail ved å blande 25 ul av komponent A og 25 pl av komponent B. Disse komponentene er eies.
- Legg 501; L av det merkede cocktail til cellene. Inkuber i 5 min ved RT.
MERK: For renere kulturer, gjenta trinn 2,9 (anbefalt, men ikke obligatorisk). - Vortex-mikrokuler i 45 s. Tilsett 80 pl av mikrosfærer per 1 ml av prøven. Inkuber i 3 min ved RT.
- Bringe volumet til 2,5 ml i polystyrenrør ved å tilsette anbefalt materiale.
- Sette røret i magneten i 3 min ved romtemperatur. Juster inkubasjon for å øke renheten. Hell sakte ut over anbefalt materiale inn i et 15 ml rør med magneten fortsatt i polystyrenrør.
- Gjenta steg 2,12 tre ganger. Andre magnetiske inkuberinger kan utføres for å øke renheten.
- Tilsett 3 ml av vekstmedier og telle antallet celler under anvendelse av en celleteller.
- Plate celler følgelig i Poly-D-lysin (PDL) -belagte plater for behandlinger. Behandle cellene 48 timer etter utsåing inPDL-belagte plater. Dette gjør det mulig for cellene å komme seg fra stress av separasjon.
MERK: Check renheten av kulturen ved anvendelse av immunocytokjemi som beskrevet tidligere 15. - Plate den negative fraksjon (samlet opp i en 15 ml rør), som for det meste inneholder astrocytter, i T-75-kolber i vekstmediet.
- Etter minst 6 timers inkubering i 37 ° C inkubator, bytter mediet og la det vokse O / N. Splitte astrocytter neste dag for behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroglia isolert ved anvendelse av CD11b positiv seleksjon kit II har høy renhet
Primære mikroglia hos mus ble isolert ved anvendelse av ovennevnte protokoll og sådd ut på poly-D-lysin-belagte dekkglass for å kontrollere renheten av isolasjon. Ti tusen celler ble utplatet per brønn og immuncytokjemisk analyse ble utført ved anvendelse av ionisert kalsium-bindende adaptermolekyl 1 (Iba1) som en markør av mikroglia og glial fibrillært surt protein (GFAP) som en markør av astrocytter for å kontrollere renheten av det isolerte mikroglia . Det isolerte kultur uttrykkes bare Iba1 uten GFAP uttrykket (figur 2A), noe som tyder på at kulturen ble isolert var rene mikroglia. I motsetning til andre tidligere publiserte fremgangsmåter for primær separasjon, mikroglia, som oppnådde ~ 97% renhet, ved hjelp av denne metode erholdt vi ~> 99% renhet i halvparten av tiden. For ytterligere å bekrefte renheten av th er kultur, kjørte vi en Western blot 20 for Iba1 og GFAP. Immunoblot-analyse viste videre at denne isolasjon fra de blandede glial kulturer var en nesten ren microglial kultur (figur 2B).
Den modifiserte isoleringsprosedyren ikke har noen auto-fluorescens fra magnetiske kuler
Den røde kanal kan ikke brukes for immunocytokjemi (ICC) ved bruk av den foregående CD11b-isolasjonssett for microglial separasjon som nevnt av Gordon et al. 15 på grunn av bruk av PE-merking under separasjonen. Ved hjelp av denne nye PE-fri-isolasjonssett, kan vi bruke den røde kanal for immunocytokjemisk analyse (Figur 3). Fra denne ICC, er det innlysende at denne nye metode gjør det mulig å bruke alle kanaler for flowcytometri eller andre fluoriserende bildediagnostikk.
ve_step" fo: keep-together.within-page = "1"> Isolerte mikrogliaceller kulturer funksjonelt svare på LPS stimulansFor å verifisere at det isolerte mikroglia er funksjonelt aktive, behandlet vi cellene med LPS, en utbredt stimulerende 9 for å aktivere mikroglia, i 24 timer før sentret for forskjellige proinflammatoriske faktorer. Klassisk microglial aktivering er ledsaget av frigivelse av nitritt og forskjellige pro-inflammatoriske cytokiner i mediet. Derfor brukte vi flere komplementære analyser for å bekrefte den funksjonelle aktiviteten til vår isolert mikroglia. Først må vi brukte Griess-analyse for å vise at LPS-indusert dramatisk nitritt sekresjon fra den isolerte mikroglia (figur 4A). For å bekrefte aktiviteten av isolerte mikroglia videre pleide vi QRT-PCR for å vise (messenger ribonukleinsyre) mRNA-nivåene av NOS2, et annet kjennetegn på microglial inflammasjon, betydelig forbedret with LPS behandling (figur 4B). Deretter ble det benyttet en kule-baserte multipleks assay, Luminex 21, for å verifisere at LPS signifikant stimulert sekresjon av pro-inflammatoriske cytokiner fra microglial kultur (figur 5A). Videre har vi bekreftet via QRT-PCR-analyse som LPS behandling forbedret genuttrykk nivåer av flere pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1β og TNFa (figur 5B). Alle disse data sammen tyder på at primær mikroglia isolert ved hjelp av denne nylig raffinert metode er funksjonelt aktiv og viser en lignende aktiveringsprofil som primære mikroglia isolert ved anvendelse av tidligere publiserte metoder.
Isolerte mikroglia kan brukes for signaleringsstudier
Ved hjelp av de tidligere metoder for microglial isolasjon, kjører Western blot for signaleringsstudier var vanskelig og umulig på grunn av lavt utbytte og renhet. Tidligere har vi vist at Fyn, en Src-familie kinase, er involvert i en pro-inflammatorisk signalkaskade i mikrogliale celler 9. Her belagt vi en million mikrogliale celler i en 12-brønns plate og etter 48 timer var samlet inn i cellene for å kjøre Western blot for native Fyn og Src kinaser fosforylert på tyrosin-rest 416 (p-Src-Y416). Vi var i stand til å detektere både Fyn og p-Src-Y416 nivået i våre isolerte mikrogliale celler (figur 6), som viser at denne metoden kan anvendes for å Western blotting-teknikker for signaleringsstudier.
Den negative fraksjon fra microglial separasjonen inneholder astrocytter som kan brukes for signaleringsstudier
Astrocytter er sentrale aktører i nevroinflammasjon, og forstå signalmekanismene bak astrocytic betennelse og neuron-astrocytt krysstale er viktig 19. Her viser vi at den negative fraksjon fra microglial separasjonen inneholder GFAP-positive astrocytic celler (Figur 7A). Dessuten vår Western blot-analyse for Fyn og p-Src-Y416 (figur 7B) viste at begge disse proteinene kan påvises i den negative fraksjonen i tillegg. Disse resultater sammen viser at den negative fraksjonen er en ideell forberedelse til astrocytic studier med sikte på identifisering av proteiner er viktige for inflammatoriske signaleringskaskader.
Figur 1: Skjematisk av Isolering av microglial Celler fra 1-2 dager-post-natal Pups. Klikk her for å se en større versjonav dette tallet.
Figur 2: Microglia Isolert hjelp CD11b-positive Selection Kit II har høy renhet. (A) Immunocytochemistry av isolert microglial kultur sentret for GFAP i rød sone og IBA1 i grønne kanalen. (B) Immunoblot av isolert microglial kultur sentret for GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) og β-Actin (~ 42 kDa). Skala bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Modifisert isoleringsmetoden ikke har noen Auto-fluorescens fra magnetiske kuler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: LPS-stimulering Økt Nitritt Produksjonen i mikrogliaceller kultur. (A) Isolerte mikrogliale celler behandlet med 1 pg / ml LPS i 24 timer og det behandlende medium ble samlet opp for å bestemme nitritt frigivelse av Griess-assay. (B) Q-RT-PCR for Nos2 fra isolerte mikroglia behandlet med LPS i 24 timer. Tallene representerer gjennomsnitt ± SE fra 2 eller flere uavhengige forsøk. Data ble analysert ved anvendelse av Students t-test (* p0 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: LPS-indusert pro-inflammatorisk cytokin fra mikrogliale celler. (A) Luminex multipleks-analyse ble utført på behandlingsmediet oppsamlet fra isolerte mikrogliale celler behandlet med 1 pg / ml LPS i 24 timer. (B) Q-RT-PCR for IL-1βand TNFa fra isolerte mikroglia behandlet med LPS i 24 timer. Tallene representerer gjennomsnitt ± SE fra 2 eller flere uavhengige forsøk. Data ble analysert ved anvendelse av Students t-test (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Isolert Microglia kan brukes til signale Studies. Western blot-analyse viser at Fyn og p-Src-Y416 kan oppdages fra mikroglia isolert med vår nylig raffinert metode.
Figur 7: Negativ Brøk fra microglial Separasjon Inneholder Astrocytter som kan brukes for signale Studies. (A) Western blotting viser at den negative fraksjonen inneholder GFAP-positive celler. (B) Western blot-analyse viser at Fyn og p-Src-Y416 kan detekteres av GFAP-positive celler.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| parametere | Gjeldende metode | modifisert metode | |
| Koste | $ 620 | $ 620 | |
| Tid | 55 min | 25 min | |
| fluorescens | Ja (red kanal) | Nei | |
| Purity | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabell 1: komparativ analyse mellom Raffinert mikrogliaceller isoleringsmetoden og den opprinnelige Fremgangsmåte for isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eldre mikrogliaceller isoleringsmetoder har begrensede gjenvinninger som ikke er passende for forskjellige proteinanalyser ved hjelp av Western blot analyser av RNA og QRT-PCR. Den differensielle tilslutning og mild tryp metoder er to vanlige fremgangsmåter med lave utbytter mikrogliaceller 13, 14, 15. Kolonne-baserte CD11b tilnærming har også lav utvinning, men oppnår en større renhet enn differensial adhesjon og mild trypsinisering 13, 14, 15, 16, 17. Vår opprinnelige kolonne-fri CD11b tilnærming sterkt forbedret de isolerte utbytter, noe som gjør den egnet for protein og RNA-analyser som Western-blotting og QRT-PCR, men på bekostning av redusert renhet 15.
Vårt nylig endret metoden beholderutbyttene av den opprinnelige metoden og øker renheten litt fra ~ 95 til 97% til ~> 99%, men på halvparten av kompletterings tid, noe som er viktig for celleoverlevelse. Avgjørende trinn innenfor protokollen kan sikre optimal microglial isolasjon. Mens decapitating valpene, bør man sørge for å holde hodene på is og til å dissekere i en laminær luftstrøm kammer inne i 5-10 min. Forlengede hjernen eksisjons- ganger vil gjøre det vanskelig å få den fulle hjernen fordi det begynner å miste sin soliditet ved normale temperaturer, går på bekostning av de mikrogliaceller avkastning. Spesielt, dersom trinn 2.9 blir gjentatt minst en gang, er det en observerbar økning i renhet og levedyktighet. Hvis flyte fra separeringen er lav, kan separasjonen gjentas ved bruk av færre kolber pr ml anbefalte media, eller ved å øke volumet av separasjon (> 1 ml). Avtagende celle samles vanligvis vil forbedre renheten, levedyktighet, og utbytte. Den magnetiske Inkubasjonstiden kan forlenges i trinn 2.12 for å øke renheten. Dette kansikre riktig magnetisk binding av mikrosfærer som er festet til mikroglia. Videre kan ytterligere magnetiske inkubasjoner utføres i trinn 2.9 på grunn av økende renhet og utbytte.
Gjennomførbarheten av protokollen er lik eller bedre enn den opprinnelige CD11b metoden; imidlertid, er den nye fremgangsmåten raffinerte og kortere. En annen betydelig fordel som oppnås fra dette raffinerte fremgangsmåten er muligheten til å utnytte den røde kanal for fluorescens mikroskopi, som er okkupert av PE i den opprinnelige metoden (tabell 1) 15. Selv om vi får høyt utbytte og renhet av mikroglia med fremgangsmåten, den astrocytic utbyttet oppnådd fra denne separasjon er mindre rent, siden det beholder noen fibroblaster. Som beskrevet i trinn 2.17, etter utsåing av astrocytter og inkubering i 6 timer, vekstmediet skal erstattes med friskt medium. Astrocytter er den første til å feste til kolben, mens mye av fibroblastene forbli i suspsjonen. Utskiftningen av mediet vil vanligvis fjerne hoveddelen av de forurensende fibroblaster. Selv om denne teknikken sikrer en høy renhet av astrocytter, er en sekundær rensemetode for å oppnå renere kulturer berettiget.
Totalt, genererer denne modifiserte CD11b isoleringsmetoden ble svært rene primære mikrogliale celler og astrocytter i løpet av kort tid. Jo kortere tid isolasjon forbedres generelt celle overlevelse. Den gir et nyttig modellsystem for å belyse signalerings mekanismer som ligger under både microglial og astrogliale biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Stipend: NS088206 og ES026892. W. Eugene og Linda Lloyd Velsignet Chair i AGK og Deans professoratet til AK er også anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
