Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Summary

Studere ionkanaler gennem et heterologt udtrykker system er blevet en central teknik i biomedicinsk forskning. I dette manuskript, præsenterer vi en tid effektiv metode til at opnå tæt kontrolleret ionkanal-ekspression ved at udføre transient transfektion under kontrol af en inducerbar promotor.

Abstract

Transfektion levering af fremmede nukleinsyrer i en celle, er et effektivt værktøj i protein forskning. Gennem denne metode, kan ionkanaler undersøges gennem elektrofysiologisk analyse, biokemisk karakterisering, mutationsmønstre undersøgelser, og deres virkninger på cellulære processer. Transiente transfektioner tilbyder en enkel protokol, hvor proteinet bliver tilgængelig for analyse i løbet af få timer til dage. Selv om denne fremgangsmåde giver en forholdsvis enkel og tidsbesparende protokol, er en af ​​de kritiske komponenter kalibrering ekspressionen af ​​genet af interesse til fysiologiske relevante niveauer eller niveauer, der er egnet til analyse. Til dette formål har mange forskellige tilgange, der tilbyder muligheden for at styre ekspressionen af ​​genet af interesse opstået. Adskillige stabile celle transfektionsprotokoller giver en måde at permanent indføre et gen af ​​interesse i det cellulære genom under regulering af et tetracyclin-kontrolleret transcriptional aktivering. Mens denne teknik producerer pålidelige ekspressionsniveauerne, hvert gen af ​​interesse kræver et par ugers faglært arbejde, herunder kalibrering af en dræbende kurve, udvælgelse af celle kolonier, og generelt flere ressourcer. Her præsenterer vi en protokol, som anvender transient transfektion af Transient Receptor Potential kationkanal underfamilien V element 1 (TRPV1) gen i et inducerbart system, som en effektiv måde til at udtrykke et protein i en kontrolleret måde, som er væsentlig i ionkanal analyse. Vi viser, at bruge denne teknik, er vi i stand til at udføre calcium imaging, hel celle, og en enkelt kanal analyse med kontrollerede kanalniveauer kræves for hver enkelt af indsamling af data med en enkelt transfektion. Samlet giver dette en replikerbar teknik, der kan anvendes til at studere ionkanaler struktur og funktion.

Introduction

Heterologt udtrykker systemer er en af de mest udbredte teknikker til at studere en mangfoldighed af cellulære funktioner ^1. Deres lave endogent protein profil, minimal vedligeholdelse, pålidelig vækst, og evne til at optage og udtrykke fremmed DNA har gjort cellelinjer, såsom humane embryonale Kidney (HEK293) og kinesisk hamster ovarie (CHO) næsten afgørende for biologisk forskning ^{2, 3.} Forskningsområder hjælp heterologe systemer omfatter membranproteiner, intracellulær signalering og enzymatisk aktivitet. Efter transfektion af fremmed DNA ind i cellen, kan udføres mange forskellige former for analyse, herunder elektrofysiologi, ratiometrisk calcium imaging, western blot, etc. ^{4, 5.}

På grund af den brede vifte af mulige anvendelser for heterologe ekspressionssystemer, mange Forskelnt reagenser og produkter er blevet udviklet til at udnytte disse celler og deres kvaliteter ^6. DNA afgivelsessystemer, der transient eller permanent integrere fremmed DNA i celler for at studere exogent protein er blevet en af ​​de mest populære og nyttige værktøjer til biologisk forskning. Mere specifikt er transient transfektion af DNA i en celle i vid udstrækning anvendes som en enkel, ligetil proces, der kræver forholdsvis lidt tid og materialer. Endvidere succesraten af celler, der undergår transfektion er høj ^7. Denne teknik er meget pålidelig, når det kombineres med et markørgen, såsom grønt fluorescerende protein (GFP), og kan anvendes til mange forskellige teknikker, såsom calcium imaging og elektrofysiologi ^5. Men desværre transient ekspression af DNA i værtsceller kommer med nogle store faldgruber, ikke mindst, at ekspressionsniveauet per celle er upålidelig. Antallet af kopier af plasmid-DNA taget up per celle er ukontrollabel, således at udtrykket mellem individuelle eksperimenter kan variere meget ^2. Dette problem bliver signifikant, når enten forsøger at replikere fysiologiske forhold, eller udfører præcise dataindsamlingsteknikker.

Som en løsning på de ovennævnte, stabil transfektion protokoller er blevet designet komplikationer, hvor et gen af ​​interesse kan indsættes i genomet af en celle under den stramme kontrol af en inducerbar promotor, såsom en tetracyclin repressor ekspressionssystem, sikrer en enkelt kopi af plasmidet integreres i genomet i hver celle og kun udtrykkes efter induktion af transskription mekanisme, for eksempel i nærvær af doxycyclin. Mens dette løser forhindringer af inkonsekvente protein udtryk niveauer, denne metode mister bekvemmelighed hurtig og relativt simpel protokol af transiente transfektioner. Etablering af en stabil cellelinje tager mindst et par uger i which må man kalibrere en dræbende kurve indstillet af specifikke antibiotika for at bevare proteinekspression og sikre integration af vektoren og dygtigt vælge og vokse cellekolonier. Samlet set tager betydeligt mere tid og kræfter med en lavere succesrate ^8.

Her introducerer vi en mellemliggende protokol, der trækker på styrkerne i begge de populære transfektion muligheder for at skabe en enkel og effektiv måde at styre ekspressionsniveauerne i enhver inducerbare cellelinje. Samtidig opretholde celler med et inducerbart tet systemet, vi forbigående transficere vores gen af ​​interesse, Transient Receptor Potential kationkanal underfamilien V element 1 (TRPV1), ligeret ind i en vektor, som homologt kan kombinere med repressoren system. På denne måde kan genet indføres i cellerne uden begyndt at udtrykke. Kun ved tilsætning af doxycyclin betyder genet begynde at udtrykke, tillader os at kalibrere niveauet af protein expression ifølge teknikken eller niveauer observeret i fysiologiske betingelser. Vores protokol undgår også langvarige komplikationer forbundet med generering af en stabilt udtrykkende cellelinie. Vi begynder med at vise de skiftende niveauer af TRPV1 aktivering i calcium imaging fra un-induceret gennem fire timers induktion og hvordan stigningen i intracellulære calcium niveauer korrelerer. Vi derefter duplikere protokollen i hele celle konfiguration af patch-clamp teknik, viser den stigende strøm med stigende tid af induktion. Endelig præsenterer vi eksempler på enkelt kanal elektrofysiologi optagelser, og vise, at denne teknik er især nyttig for kontrolleret udtryk, når de søger præcis dataindsamling baseret på individuelle enheder af proteinet. Gennem vores protokol, tilbyder vi en bekvem måde at styre proteinekspression i heterologe systemer samtidig undgå langvarige cellekultur komplikationer, hvilket giver en måde at kontrollere forhold mellem eksperimenter og give more reproducerbare resultater.

Protocol

1. ligering af genet af interesse i det repressible Site of Vector

1. Få en inducerbar vektor såsom pcDNA5 / FRT / TO eller pcDNA4 / TO.
2. Analyser genet af interesse for alle potentielt modtagelige restriktionssteder i midten af genet, der ligeledes i den multiple kloningssted i den valgte vektor ved in silico DNA-analyse software ^4.
3. Anvendelse af standard overlappende PCR-teknikker ^4, flankerer genet af interesse med to udvalgte restriktionsenzymgenkendelsessteder (som ikke findes i genet af interesse), den første indsættes før startkodonet, og anden gang stopkodonen.
4. Fordøje både vektor og insertet med restriktionsenzymer (valgt i trin 1.2) ved enzymer arbejdstid temperatur i en time, efterfulgt af tilsætning af én enhed kalvetarm phosphatase (CIP) til vektoren reaktionen i 30 minutter for at undgå selv- ligering.
5. Indlæse fordøjede DNA på en 1% agarosegel og separere de spaltede segmenter ved elektroforese ^9.
6. Med UV-lys, skæres med en kniv stykker af gel indeholdende de ønskede segmenter af vektor og insertet skal ligeres.
7. Uddrag DNA-segmenterne fra agarosegelen stykker (under anvendelse af kommercielt tilgængelige DNA-ekstraktion sæt) og måle deres slutkoncentration efter spektrofotometer ved 260 nm.
8. Ligere genet af interesse i den inducerbare valgte vektor under anvendelse af T4-ligase-enzym ved stuetemperatur i 20 minutter. For at øge sandsynligheden for indsatsen ligering med vektoren, anvende et 3: 1 molforhold af indsatsen: vektor. Til kontrol fremstilles en ligeringsreaktion, der kun indeholder vektoren.
9. For bakteriel transformation, tilsættes 10 ng vektor alene og vektor + genet i 50 pi kompetente E. coli. Inkubér røret på is i 30 minutter efterfulgt af 45 sekunder inkubation ved 42 ° C. Anbring straks tilbagepå is i to minutter og overføres de transformerede bakterier til 500 pi LB-medium. Pladen inkuberes i en time ved 37 ° C under omrøring ved 220 rpm.
10. Til udvælgelse af succesfuldt transformerede bakterier, plade 100 pi af hver reaktion (som beskrevet i 1.9) på et forberedt LB agarplade indeholdende det egnede antibiotikum (f.eks 100 ug / ml ampicillin ved brug pCDNA4 / TR).
11. Tillad at vokse natten over ved 37 ° C. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger efter stramt pakke dem i plast paraffin film.
12. Løft individuelle kolonier under anvendelse af en 10 pi spids, og tillade at vokse natten over i 3 ml LB + antibiotikum medium ved 37 ° C under omrøring ved 220 rpm. Bakterier med DNA af interesse kan fryses (-20 ° C) til kortvarig opbevaring ved centrifugering af LB og bakterier ved 11000 xg og opsugning ud supernatanten. Lang tids opbevaring kræver indefrysning af bakterier som glycerol lagre ved -80 ° C.
13. Uddrag DNA through mini-prep og måle den endelige koncentration af spektrofotometer ved 260 nm ^5.
14. Bekræft vellykket indsættelse af gen af interesse ved sekventering den rensede konstruktion ^fire. Alternativt kunne diagnostisk fordøjelse af konstruktionen med restriktionsenzymer under anvendelse af elektroforese for at adskille de afskårne segmenter og evaluere deres tilstedeværelse og længde også anvendes til dette formål ^4.

2. Kulturcenter cellelinjer, der udtrykker TetR

1. Opnå en cellekultur linje huser et Tet-repressor plasmid inkorporeret i deres genomiske DNA. Heri protokollen vil blive skrevet ved hjælp af menneskelige embryonale nyre 293T-celler (HEK-293T) huser pcDNA6 / TR-plasmid som et eksempel.
2. Seed celler i 100 mm vævsdyrkningsplade med Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, og 25 mM HEPES, pH 7,3 (heri: Fuld DMEM) og inkuber O / N ved 37 &# 176; C og _5% CO2. Alt arbejde med celler bør ske i en biologisk hætte under sterile forhold.
3. For at opretholde ekspressionen af ​​Tet-repressorgen, aspireres mediet og erstatte det med Full DMEM suppleret med 5 pg / ml blasticidin. Cellerne inkuberes ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Når celler op på 80 - 90% sammenflydning, aspireres medium og forsigtigt vaske cellerne to gange med DPBS (uden calcium og magnesium) opvarmet til 37 ° C.
5. For at forsigtigt løfte cellerne uden at forårsage mekanisk skade, inkuberes kulturen i DMEM indeholdende 0,05% trypsin opvarmet til 37 ° C i 1,5 min.
6. Bloker trypsin action med en tilsvarende mængde Full DMEM. Forsigtigt pipette op og ned for at løfte cellerne og overføre dem til et sterilt rør.
7. Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 5 min.
8. Aspirere supernatanten og erstatte det med 1 ml Fuld DMEM. Pipettere opløsningen med cellerne op og ned, indtil der ikkecelleklumper kan ses. Tælle og beregne antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer.
9. Seed 1 - 2 ud x 10 ⁶ celler i 100 mm vævskulturskål indeholdende 12 ml Fuld DMEM med 5 ug / ml blasticidin. Split cellerne to gange om ugen, da de når 90% sammenflydning.

3. transfektion af plasmid af interesse i celler

1. Under anvendelse af samme metode til at opdele celler som beskrevet ovenfor, overføre celler til brønde i en plade med 12 brønde fremstillet med 0,9 ml Full DMEM, tilstrækkeligt til at gøre 50% sammenflydende (~ 200.000 celler) og inkuberes natten over ved 37 ° C i en _CO2- inkubator.
2. Forbered en transfektion blanding med pcDNA4 / TO indeholder genet af interesse, en inaktiv plasmid at bringe den samlede DNA beløb til 1 pg (om nødvendigt), 3 pi lipid transfektion reagens og DMEM at foretage den endelige volumen 100 uL. Den optimale mængde af plasmid-DNA, der skal anvendes, varierer bredt som forskellige proteiner udtrykker i forskellig effektivitet. For udvalgterophysiological eksperimenter, indbefatter EGFP i pattedyr ekspressionsplasmid i transfektion cocktail for at visualisere celler, der med held gennemgår transfektion ^4.
3. Inkuber transfektionsblandingen ved stuetemperatur i 30 min.
4. Transficere celler ved pipettering transfektionsblandingen dråbevis på de udpladede celler i 12-brønds plade og klippe pladen kraftigt for at sikre homogen fordeling af DNA og transfektionsreagens. Celler bør være ~ 80% konfluente på tidspunktet for transfektion.
5. Inkuber de transficerede celler O / N ved 37 ° C og _5% CO2.
6. Bekræft, at cellerne med held blev transficeret ved at observere fluorescens signal EGFP under UV-lampe den følgende morgen, hvis udførelse elektrofysiologi.

4. Plating Celler på Poly-D-lysin (PDL) Dækglas / Wells

1. Sterilisere 12 mm dækglas ved dousing med 70% isopropyl ethanolopløsning. Tør og læg en enkelt coverslip i hver brønd i en 24-brønds plade til elektrofysiologisk optagelse.
2. Afpipetteres en opløsning af 0,1 - 0,2 mg / mL PDL opløsningen på hver dækglas eller brønd af en calcium imaging kammer.
3. Tillad at sidde i 30 minutter ved 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator.}
4. Vask med cellekulturkvalitet dobbelt destilleret vand (DDW) tre gange, opsugning mellem hver vask. Efter den sidste vask tørres grundigt og lad sidde ved stuetemperatur.
5. For elektrofysiologi, fylde hver brønd indeholdende en PDL coatet dækglas med 500 pi Fuld DMEM opvarmet til 37 ° C.
6. Udfør den samme metode til at opdele de transficerede celler som beskrevet ovenfor. Efter resuspendering af cellerne efter trypsinbehandling og blokering, overførsel 80 pi celler (eller cirka 30.000 celler) til centrum af hver PDL belagt dækglas til elektrofysiologi optagelse. Tillad celler at bundfælde i mindst 1,5 timer eller inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator.}
7. For calcium imaging overførsel og spot 20 pi celler (ca. 20.000 celler) til centrum af hver PDL coated calcium imaging godt. Tillad celler at bundfælde i mindst 30 minutter og tilsæt 180 pi fuld DMEM til hver brønd.

5. Induktion af genekspression

1. Der fremstilles en doxycyclin stamopløsning af 1 mg / ml i DDW i henhold til producentens anvisninger. Hold stamopløsning beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til 3 uger. Til langtidsopbevaring holde doxycyclin stamopløsning ved -20 ° C.
2. Forbered en frisk 2 mikrogram / ml (elektrofysiologi) eller 3 mg / ml (calcium imaging) doxycyclin løsning i Full DMEM og varme det til 37 ° C.
3. For elektrofysiologiske optagelser, pipette 500 pi 2 pg / ml doxycyclin opløsning til hver brønd for at foretage en endelig koncentration på 1 ug / ml doxycyclin. For calcium imaging, tilsættes 100 uL af 3 ug / ml doxycyclin løsning til hver brønd for at foretage en endelig koncention på 1 ug / ml doxycyclin. Skriv ned times induktion.
4. Inkuber i den ønskede mængde tid til induktion ved 37 ° C og _5% CO2.

6. Kalibrering Tidslinje for Protein Expression

1. Kalibrering proteinekspression gennem Calcium Imaging ^{5, 10}
   1. Forbered Ringers opløsning (140 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,8 mM _CaCl2, 2 mM _MgSO4, 20 mM HEPES, pH justeret til 7,4 med NaOH) og opvarme det til 37 ° C.
   2. Forbered mættende koncentrationer af kanal-agonist i Ringers opløsning. Fordi mængden af ​​agonist fortyndes når den sættes til de calcium imaging kamre indeholdende cellerne og ekstracellulær opløsning, fordoble mængden af ​​den ønskede slutkoncentration af agonist. Dette gør også mængden af ​​badopløsningen i hver brønd kritisk at kontrollere.
   3. Der fremstilles en opløsning af ikke-ionisk F-127 20% W / V in DMSO. Opvarm opløsningen til 40 ° C, indtil ikke-ionisk F-127 er opløst. det ikke-ioniske F-127-opløsning ved stuetemperatur gemme og opvarme det til 40 ° C før brug. Ikke-ioniske F-127 bruges til at hjælpe dispergere acetoxymethylestere (AM) estere af fluorescerende ion indikatorer såsom Fura-2 i vandige opløsninger.
   4. Aspirer medium og erstatte det med Fura-02:00 loading opløsning (Ringers opløsning tilsat 2 - 3 i uM Fura-02:00, 0,02 mg / ml ikke-ionisk F-127 og 10 mM D-glucose).
   5. Inkuber i 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
   6. Aspirer Fura-2 AM opløsning og vask cellerne med Ringers + 10 mM D-glucose løsning til at fjerne ekstracellulære farvestof. Gentag dette trin to gange.
   7. Efterlad 200 pi Ringers + 10 mM D-glucose-opløsning i hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
   8. Placer kammer på scenen over mikroskopet næsestykke og fastgør den med holderen.
   9. Tænd lampen, kamera og mikroskop og vælg Fura-2-filter til at detektere emission ved 510 nm wavelength.
   10. Justere for den ønskede forstørrelse og fokus celler i det valgte område.
   11. I den mørke, trække baggrunden lys og indstille eksponering tid.
   12. billede prøveudtagning på den ønskede hastighed og optage fluorescens respons af Fura-2 belastede celler ved spændende dem ved 340 og 380 nm bølgelængder Set. Forholdet mellem 340/380 signaler er en indikator for intracellulær Ca2 ⁺ -koncentration og dermed også for TRPV1 aktivitet.
   13. Tilsæt 2 pM capsaicin i 200 pi Ringers opløsning ved pipettering for at skabe en endelig mættende koncentration på 1 uM capsaicin for at vurdere ekspressionsniveauet af TRPV1.
   14. Analyser TRPV1 reaktion ifølge induktionstid og bestemme protokol for proteinet af interesse.
2. Justering proteinekspression i heterologe systemer ved hjælp af helcelle konfiguration af patch-clamp-teknikken ^{4, 11.}
   1. Forbered than bad opløsning af (mM) 140 NaCl, 2,3 KCI, 2 _MgSO4, 5 HEPES og 5 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES), indstillet til pH 7,4 med NaOH.
   2. Forbered mættende koncentrationer af kanal-agonist i ekstracellulær opløsning.
   3. Træk glas elektroder med en indvendig diameter (ID) på 1,10 mm og brand-polish til en modstand på 2 - 4 MQ.
   4. Der fremstilles en pipette opløsning af (mM) 130 KCI, 4 NaCl, 2 _MgSO4, 0,5 _CaCl2, 1 EGTA og 10 HEPES indstillet til pH 7,2 med KOH. Filtreres pipette opløsningen før brug. Før hvert forsøg, er en enkelt, brand-poleret glas pipette tilbage fyldt ved nedsænkning spidsen i pipetten opløsning i mindst et minut, og derefter fyldt ved hjælp af smeltet og strakte spids med en sprøjte fyldt med den samme pipette løsning.
   5. forsigtigt løfte en enkelt PDL coatet dækglas med de udpladede celler fra brønden til en 35 mm plastik petriskål fyldt med ca. 2 ml bad opløsning ved stuetemperatur. Overhold under en epi-fluorescensmikroskop.
   6. Find en EGFP positiv celle, som visualiseret med epifluorescensmikroskop, på den forberedte dækglas og flytte til midten af ​​visualiseret felt.
   7. Fastgør den fyldte pipette til pipette indehaveren af ​​mikromanipulator, og indsprøjte en lille mængde af positivt tryk i systemet for at undgå forurening af det intracellulære pipette opløsningen. Sænk det til lige over GFP - positive celle, kontrol for korrekt modstand.
   8. Som pipetten rører cellen, anvende en lille mængde af negativt tryk for at skabe en GQ tætning mellem glaspipette og cellemembran.
   9. Med en kort, skarp impuls af sugning, bryde cellemembranen, hvilket tillader pipetten at komme i berøring med de intracellulære indholdet af cellen.
   10. Skift forstærkeren tilstand til hele celle, og sænk Bessel-filter og output gain 1 - 5 kHz og 0.5α hhv.
   11. Optagelse af den aktuelt svar på mættendekoncentrationer af kanal-agonist ved hjælp spænding ramper eller hul fri protokol.
   12. Fordi udtryk effektivitet skifte mellem forskellige proteiner, gentage optagelser ved hjælp af forskellige induktion længde gange.
3. Bestemmelse ideel induktion tid for enlige kanal optagelser ^4.
   1. Der fremstilles en opløsning af (mM) 150 Na-gluconat, 15 NaCI, 5 EGTA og 10 HEPES, indstillet til pH 7,4 med NaOH, som en pipette opløsning. For badet løsning, bruge løsningen fra trin 6.2.1.
   2. Gentag celle procedure hel hjælp ID 0.86 mm glaspipetter brand-poleret til en modstand på 10 - 12 MOhm og indstille holdepotentiale til -40 mV.
   3. Skabe en tætning på membranen som tidligere beskrevet og sprænge membranen.
   4. Brug af mikromanipulator, løftes pipetten med membranen patch væk fra cellen.
   5. Placer perfusionssystemet direkte ud til pipette indeholdende membranen patch.
   6. Lavere than Bessel-filter og output gain til 2 - 5 kHz og 10α hhv.
   7. Perfundere mætte koncentrationer af agonist på membranen patch, at vurdere, om det plaster indeholder en eller flere kanaler i overensstemmelse med svaret.
   8. Analyser antallet af enlige kanal patches held optaget mod induktion tid anvendt på celler. Juster induktionstiden overensstemmelse med de ønskede resultater.

Representative Results

For hurtigt at oprette en inducerbar ekspression model, gjorde vi brug af HEK293-celler, der udtrykker Tetracyklin repressorproteinet (TR) (f.eks T-Rex-293) og vektorer, der indeholder tetracyklin operator sekvenser (TetO) mellem CMV-promotoren og det multiple kloningssted (f.eks pcDNA4 / TO). Når transficeret ind Trex-293-celler, er ekspressionen af ​​genet af interesse i pcDNA4 / TO undertrykt, som TR binder til TetO. Tilføjelse doxycyclin til mediet forhindrer TR-TetO interaktion, således at ekspressionen af ​​det transficerede protein. At kontrollere ekspressionen af ​​rotte-TRPV1 (rTRPV1) vi først indsat denne kanals gen i en pcDNA4 / TO vektor ved anvendelse af den ovenfor beskrevne protokol. Dernæst blev T-Rex-293 celler transficeret med rTRPV1- pcDNA4 / TO plasmid ifølge trinene i punkt 3 i protokollen. Efter transfektion blev rTRPV1 ekspression induceret ved inkubering af cellerne i nærvær af doxycyklin (1 μg / ml) til 1 - 4 timer. Vigtigt er det, kan forskellige doxycyclin koncentrationer anvendes til at opnå ønskede udtryk sats. Vi anvendte elektrofysiologiske og calcium imaging metoder til at evaluere rTRPV1 ekspressionsniveauet på hvert tidspunkt ved at anvende sin agonist, capsaicin. Som vist i figur 1, ved anvendelse af live-cell calcium imaging, er intracellulært calcium niveau efter capsaicin ansøgning steg gradvist med længere induktionstider. Aktivering af ikke-inducerede celler kan tilskrives en basal lækage i TR-aktivitet, overekspression af plasmidet, og resterende tetracyclin i cellers medier komponenter. Dernæst registreres vi strømme fra celler under anvendelse af helcelle-konfigurationen af ​​patch clamp-teknikken anvender spænding ramper mellem -80 mV til +80 mV. Figur 2 viser, at højere strømamplituder opnås med længere induktionstider. Mætningen i strømamplitude ved 4 timers induktion er consistent med mætningen set i calcium respons (figur 1). Endelig har vi analyseret rTRPV1 ekspressionsniveauer i udenfor-out konfiguration af plasteret-clamp-teknikken. En af de store vanskeligheder med at studere ionkanal struktur-funktion er ved at nå ekspressionsniveauer egnede til enkelt-kanal analyse. Baseret på den offentliggjorte ensartet rTRPV1 konduktans ⁴ blev registreret strømamplitude anvendes til at bestemme antallet af kanaler i den udskårne patch. Som vist i figur 3, antallet af kanaler i plasteret stiger proportionalt med doxycyclin inkubationstid. Efter en times induktion, var vi ikke i stand til at afsløre eventuelle kanalaktivitet (0 ud af 8). I begge to- og tre-timers tidspunkter indspillede vi enkelt kanal aktivitet i lignende succesrater. Af note, mens der i to timer fleste patches svarede ikke, i tre timer fleste patches viste single-til-multi -kanal aktivitet. Chancerne for optagelse af flere kanaler efter tre timers induktion er høj, således den optimale induktionstid for at optage strøm fra en enkelt kanal er mellem to til tre timer under de præsenterede betingelser. Tilsammen viser disse resultater, at ekspression af ionkanaler kan tæt kontrolleret og reguleret efter transient transfektion under anvendelse af denne protokol.

Figur 1. Reaktion af TRPV1 Activation Øger ifølge Induktion Time, som Visualiseret gennem Calcium Imaging. (A) Pseudo-farvede billeder af T-Rex-293 celler vedvarende udtrykker rTRPV1, før ( 'Basal ") og efter capsaicin (2 uM) ansøgning. Hvide søjler repræsenterer 30 um. Scale bar indikerer niveauerne af intracellulært calcium. (B) ændringer med tiden af intracellulære calcium niveauer i transficerede T-Rex-293 celler behandlet som visti A. Hver graf repræsenterer et gennemsnit på 50 capsaicin sensitive celler. Bemærk de trinvise stigninger i capsaicin responser i forhold til induktion tid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. TRPV1 Aktuelle stiger som følge af stigende induktion Tid i Whole Cell Patch Clamp Recordings. (A) helcelle optagelser fra T-Rex-293 transient transficeret med rTRPV1 ved en holdepotentiale på -40 mV. Celler blev induceret med doxycyclin (1 pg / ml) i den angivne tid, og derefter udsat for capsaicin ( "Cap« 1 uM, rød bar). Vist er et repræsentativt spor af 6 - 11 uafhængige optagelser. (B) Middel / scatter-punktdiagram repræsenterer helcelle-amplitude fremkaldte som vist i A. Statistikal signifikans mellem grupperne blev bestemt med ANOVA med multiple sammenligninger, hvor *** betegner p ≤0.001 og NS ikke statistisk signifikant (n = 6 - 11 celler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Succes Rate of Single Channel Patch i TRPV1 Recordings er afhængig af induktion Time. (A) uden for-out optagelser fra T-Rex-293 transient transficeret med rTRPV1 ved en holdepotentiale på +50 mV. Celler blev induceret med doxycyclin (1 pg / ml) i den angivne tid og blev udsat for capsaicin ( "Cap« 1 uM, rød bar). Vist er et repræsentativt spor af 6 - 9 uafhængige optagelser. (B) Middel / scatter-punktdiagram der repræsenterer antallet af kanaler i den udskårne plaster somvist i A. Statistisk signifikans mellem grupperne blev bestemt med ANOVA med multiple sammenligninger, hvor *** betegner p ≤0.001 og NS ikke statistisk signifikant (n = 6 - 9 celler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Transfektion er et meget anvendt protokol for proteinekspression og forskning, med mange forskellige variationer til forbedring ekspression konsistens og stabilitet. Forbigående transfektionsreagenser tilbyder en enkel, let at bruge protokol, hvor cellen og proteinet af interesse kan analyseres i løbet af timer til natten over fra tidspunktet for transfektion. Desværre denne fremgangsmåde kan være uforudsigelig, når den tilstand af analyse kræver et ensartet proteinekspression, såsom enkelt kanal optagelser i elektrofysiologi ^2. Alternativt er stabile cellelinier under tetracyclin repressible ekspressionssystem er udviklet til at tilbyde en måde at kontrollere ekspressionen af proteinet af interesse ^12. Denne fremgangsmåde giver konsekvent ekspression af alle celler i en kultur med indførelsen af ​​et tetracyclin afledt supplement, såsom doxycyclin. Mens dette giver mulighed for konsekvent og præcis styring af proteinniveauer, than tid og kræfter, der går ind til oprettelse af en stabil cellelinje gør det besværligt og ufordelagtig når man studerer en bred vifte af proteiner ^8.

Protokollen præsenteres her byder på en middle-of-the-road løsning på de nuværende transfektionsprotokoller tilbydes. Ved forbigående transfektion af en gen under en kontrollerbar promotor i celler besidder en Tet repressor, kan vi opnå kontrollerbar udtryk samtidig undgå langvarige og komplicerede procedurer. Her brugte vi den ikke-selektive kation kanal TRPV1 med calcium imaging og elektrofysiologi analyse. Vi fandt, at det ideelle induktionstiden til kontrolleret ekspression af dette specifikke protein til enkelt kanal analyse var mellem 2 - 3 timers inkubering med 1 ug / ml doxycyclin (figur 1 - 3). Over en bredere, kan denne teknik også anvendes til ethvert protein af interesse. Denne protokol tilbyder også en løsning til styring af udtryk, når en large række forskellige proteiner eller mutationer i proteinsekvenser er af interesse og skabe en stabil cellelinie for hver variant er upraktisk. Vigtigt er det, mens resultaterne her repræsenterer det optimale tidspunkt og koncentrationer for TRPV1 udtryk, hvert gen har sin individuelle og specifikke oversættelse og menneskehandel tempo, således kalibrerings- og udtryk tider af hvert protein vil variere meget ^13.

Mens denne teknik giver en bekvem løsning på kontrolleret ekspression, er det ikke uden begrænsninger. Eneste kommercielt tilgængelige cellelinier indeholdende Tet-systemet kan anvendes med dette system, som præsenterer et problem, hvis disse særlige cellelinier er uegnede til den type analyse, der skal udføres. En anden faldgrube sammenlignet med stabilt transficerede linier er, at ikke alle celler undergår transfektion, og således ikke alle celler udtrykker proteinet af interesse. Samlet set kan vi tilbyde en bekvem måde at kontrollere protein eXPRESSION i en heterolog system, der kan anvendes til en bred vifte af biomedicinsk forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1x), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL)	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225